ＲPA技術在結核分枝桿菌診斷的應用

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摘要:目的傳統的結核分枝桿菌鑒定方法周期時間長、敏感性較差，往往延誤患者的診斷和治療，隨著分子生物學的飛速發展，為了可以快速診斷結核分枝桿菌，本研究利用重組酶聚合酶擴增(ＲecombinasePolymeraseAmplification，ＲPA)技術建立快速的結核分枝桿菌檢測方法，為結核病患者的診斷和治療贏得寶貴時間。方法應用ＲPA技術對疑似肺結核患者痰標本中的特異性核苷酸片段進行檢測，利用衛生統計學檢驗ＲPA技術與傳統診斷方法有無差異。結果80例疑似肺結核患者的痰標本中檢測出70例陽性，有10例排除結核病。80例疑似肺結核患者的痰標本中，ＲPA技術檢測陽性率為87.50%，痰涂片檢測陽性率為56.25%，痰培養檢測陽性率為75.00%，ＲPA技術檢測陽性率較高，與痰涂片、痰培養比較，差異均有統計學意義(χ2=25.00，P＜0.01;χ2=10.00，P＜0.01)。結論ＲPA技術的成功建立對結核病的快速診斷有著重要意義。

關鍵詞:重組酶聚合酶擴增;結核分枝桿菌;特異性;診斷;檢測

結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌(Mycobacte-riumtuberculosis，MTB)引起的一種古老的慢性傳染病，以肺部感染最為常見［1］。2019年世界衛生組織統計，全球報告結核病患者710萬例，與估算的1000萬例有所差異，可能與大部分患者未被診斷出來有關［2］，可見結核病的診斷存在一定的難度。肺結核是結核病中具有傳染性的一類，臨床上對這類患者的診斷主要通過痰涂片法和痰培養法，按照世界衛生組織的統計，臨床上的診斷率只有不到70%。由于部分患者未得到及時診斷，使其成為持續的傳染源，發病數持續增加。基于此，需改進現有的診斷方法，以提高結核病的診斷率。重組酶聚合酶擴增(ＲecombinasePolymeraseAmplification，ＲPA)技術被稱為是可以替代PCＲ技術的核酸檢測技術［3－7］。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物防御、農業等領域［8－11］。本研究利用ＲPA技術建立結核分枝桿菌的快速檢測方法，現報告如下。

1材料與方法

1.1材料結核分枝桿菌標準株H37Ｒv由中國疾病預防控制中心提供，該研究涉及的菌株標本和痰標本均來源于邯鄲市第六醫院;引物與探針(表1)交由上海生工有限公司合成;DNA提取采用江蘇碩世公司的磁珠提取試劑盒，ＲPAMasterMix購自濰坊安普未來生物科技有限公司，培養基選用珠海貝索的酸性羅氏培養基和中性羅氏培養基。1.2儀器西安天?。襡al－timePCＲ儀，江蘇碩世全自動核酸提取儀，熱電培養箱。1.3方法1.3.1痰涂片鏡檢抗酸染色［12］，用玻片夾夾持涂片標本，滴加石炭酸復紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現蒸汽即暫時離開，若染液蒸發減少，應再加染液，以免干涸，加熱3～5min，待標本冷卻后用水沖洗。3%鹽酸酒精脫色30s～1min，用水沖洗。用堿性美蘭溶液復染1min，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。1.3.2分離培養取目標痰液經4%氫氧化鈉溶液消化處理15min后，酸性羅氏培養基37℃培養7周，分離得到菌株。1.3.3DNA制備取1ml菌懸液或痰液于1.5ml離心管中，7500rpm離心10min，棄上清，加入180μl溶有溶菌酶的緩沖液BL，充分混勻，低速離心，于37℃水浴溫育30min(溫浴期間每隔10min顛倒混勻一次)。加入10μl蛋白酶K至樣品中，充分混勻，低速離心，56℃水浴溫育10min。將消化液全部加入到試劑板AT中的第1、7列中。將加入樣本的試劑板AT放置在核酸提取儀中，試劑板AT的缺口朝外。插入八聯磁棒套，關上試驗倉，按下設置核酸提取程序，并選擇運行。1.3.4ＲPA反應體系每份反應液中含有A反應液29.4μl，上、下游引物(10μmol/μl)各2μl，探針(10μmol/μl)2μl，滅菌水11.5μl，結核分枝桿菌DNA樣品2μl，反應液總體系50μl。1.3.5PCＲ反應條件39℃30s(×1)，39℃10s→39℃20s(×40)。1.3.6結果分析采用SPSS21.0對數據進行整理分析，采用χ2檢驗對不同檢測方法的結果進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1ＲPA技術檢測結果80例疑似肺結核患者的痰標本中檢測出70例陽性，結果見圖1。對余下的10例患者標本分別進行痰涂片以及痰培養，結果均為陰性，又對10例患者進行流行病學調查，綜合實驗結果可以排除結核病的可能。2.2痰涂片鏡檢結果對80例疑似肺結核患者的痰標本進行痰涂片鏡檢，陽性45例，再進行ＲPA檢測，45例患者標本全部陽性;對35例涂片陰性的標本進行ＲPA檢測，其中檢出25例陽性、10例陰性。在80例疑似肺結核患者的痰標本中，ＲPA檢測陽性率為87.50%，痰涂片檢測陽性率為56.25%，ＲPA陽性檢測率較高，對兩種檢測方法進行配對設計的χ2檢驗，差異有統計學意義(χ2=25.00，P＜0.01)。2.3痰培養結果80例疑似肺結核患者的痰標本中培養出60株結核分枝桿菌。與ＲPA技術比較見表3。60例培養陽性的標本進行ＲPA檢測，全部陽性，對20例痰培養陰性的標本進行ＲPA檢測，其中檢出10例陽性、10例陰性。在80例疑似肺結核患者的痰標本中，ＲPA檢測陽性率為87.50%，痰培養檢測陽性率為75.00%，ＲPA陽性檢測率較高，對兩種檢測方法進行配對設計的χ2檢驗，差異有統計學意義(χ2=10.00，P＜0.01)。

3討論

肺結核患者傳統診斷方法主要有細菌學、免疫學和分子生物學。細菌學的臨床診斷是傳染性肺結核患者診斷的金標準，其中主要的診斷方法有痰涂片的抗酸染色法和結核分枝桿菌培養法。然而，痰涂片抗酸染色法的陽性率很低，陽性率低的原因主要受痰標本質量好壞的影響，因此陽性率的差別很大。細菌分離培養法的陽性率稍高于痰涂片抗酸染色法，并且能夠分離得到活菌，但結核分枝桿菌的生長速度緩慢，檢測周期較長，一般需要7周左右。隨著PCＲ技術突飛猛進的發展，該技術被廣泛應用于臨床實驗室診斷之中，具有靈敏、快速、特異的特點，能夠快速檢測不同類型的標本中的少量細菌，靈敏度較高，而且不受抗生素使用的影響。但PCＲ技術無法避免地要經歷變性、退火、延伸等熱循環步驟，并且需要具備昂貴的PCＲ擴增儀器才能實現核酸擴增，因此限制了其在基層單位以及現場簡陋條件下的應用，加之擴增時間長、成本高，并不適合傳染病的現場檢測和床旁診斷［13］。目前Gene－XpertMTB/ＲIF技術已被應用在結核病的診斷中，雖然可以提高診斷率，但該技術設備昂貴并且通量小，試劑封閉且較貴，并未得到很好的應用推廣。因此，研究和發展一種快速高效、操作簡便、靈敏可靠的檢測技術，對傳染病的診斷、治療和疫情的控制具有重要意義。ＲPA技術是一種新型的等溫擴增技術，是目前全球較新的等溫擴增檢測技術，其對硬件設備的要求很低，尤其可以應用于傳染病的分子診斷中［14－17］，且檢測時間短，只需5～20min就可以完成［18－20］。

作者：黃亮 胡朝輝 閆永飛 高騰 許夢捷 李偉昊 趙麗萍 單位：邯鄲市疾病預防控制中心