七五普法筆記范文

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篇1

關鍵詞N新戊酰基，O異丙醇（NPP）酯； 氨基酸； 氣相色譜燃燒同位素比值質譜； 營養級

1引 言

氮穩定同位素已廣泛用來研究生態系統的特征與過程[1]。其中， 生物體有機質總氮同位素的組成（δ15N）已成為一系列生態學研究的重要手段之一， 尤其是用于評估有機體的營養級和測定氮在食物鏈中的流動[2]?？偟凰胤椒ㄓ脕碓u估營養級是基于大量研究的平均觀測值：δ15N隨食物網的富集指示大約為3.4‰[3]。然而總氮同位素方法也有局限性：（1）不同物種間的δ15N富集程度存在明顯差異。DeNiro 和Epstein研究發現， 不同綱屬動物（昆蟲綱， 哺乳綱等）的

N值會造成所研究生態系統中營養關系的嚴重誤判。

氨基酸單體氮同位素組成是可以準確有效地估算有機體營養級。研究表明， 生物體內谷氨酸（Glu）以及苯丙氨酸（Phe）氮同位素比值差異可以指示其營養級[5～7]。代謝過程中， 谷氨酸快速進行轉氨基作用， CN鍵斷裂， δ15N富集較大（+8.0‰）。相反， 苯丙氨酸的主要代謝步驟是增加一個羥基基團轉化成酪氨酸， 此過程不伴隨CN鍵斷裂， δ15N富集不明顯（+0.4‰）， 這種代謝關系的差異導致在特定營養級的有機體中谷氨酸和苯丙氨酸的δ15N明顯不同。水生生態系統有機體營養級計算公式為[8，9]：

TLGlu/Phe =1+ （δ15NGlu-δ15NPhe-3.4）/7.6（1）

在文獻[10]基礎上， 本研究對GC條件、前處理方法以及衍生技術進行了優化。本方法準確性高， 重現性好， 為分析氨基酸氮穩定同位素以及評估水生生物體營養級提供參考。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

氣相色譜燃燒同位素比值質譜儀（GCCIRMS， 美國ThermoFisher公司）； 氣相色譜質譜儀（GCMS， 689070000C， 美國Agilent公司）；元素分析儀（EA， 美國ThermoFisher公司）； 氮吹儀（BYN1002， 上海秉越電子儀器有限公司）。

13種氨基酸標準品：丙氨酸， 甘氨酸， 纈氨酸， 亮氨酸， 異亮氨酸， 脯氨酸， 天冬氨酸， 蛋氨酸， 絲氨酸， 蘇氨酸， 谷氨酸和苯丙氨酸和γ氨基丁酸， 以及內標氨基酸：正亮氨酸和β氨基丁酸的純度均為99.9%， 均購于美國SigmaAldrich公司。陽離子交換樹脂（Dowex 50W X8 H+， 200～400 mesh， SigmaAldrich公司）用于純化樣品。水解和衍生試劑包括： 12.1 mol/L HCl（ACS級）、 甲醇（色譜級）、 正己烷、 二氯甲烷、 亞硫酰氯、 新戊酰氯、 無水MgSO4， 均購于上海阿拉丁公司。

2.2實驗方法

2.2.1生物樣品采集、氨基酸提取以及衍生化 本研究的樣品為2015年8月10日自阿哈湖水域（東經106°39′， 北緯26°33′）隨機采集9種水生生物。所有樣品冷凍干燥后， 研磨均勻。準確稱取10 mg樣品置于反應瓶中， 加入0.5 mL 2.1mol/L HCl后密封， 于110℃下水解24 h。室溫冷卻后， 水解液在60℃下用氮氣吹干。水解產物溶解于0.1 mol/L HCl， 經正己烷二氯甲烷（3∶2， V/V）充分脫脂后，過陽離子交換樹脂純化， 用4 mol/L 氨水洗脫。內標加入洗脫液中， 經氮吹儀吹干， 并按照上述方法進行衍生化。陽離子交換樹脂處理后可能存在的背景干擾由相應的空白程序檢驗。

2.2.2生物樣品氨基酸混標衍生化標準樣品溶液充分干燥后加入1 mL亞硫酰氯異丙醇（1∶4， V/V）于110℃下酯化2 h。氮吹儀吹干后， 再加入1 mL新戊酰氯二氯甲烷溶液（1∶4， V/V） 于110℃下?；? h， 生成N新戊酰基和O異丙醇酯， 多余的衍生化試劑經氮吹后完全去除。氨基酸NPP酯溶于0.5 mL二氯甲烷溶液， 用GCCIRMS測定氮同位素值[10]。

2.2.3色譜及儀器條件色譜柱：Agilent DB5ms毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）； 載氣： He（99.9999%）， 流速1.4 mL/min； 進樣口溫度： 250℃； 升溫程序： 初始40℃保持2.5 min， 以15℃/min升至110℃，再以3℃/min升至150℃， 最后以6℃/min升至230℃； 無分流模式進樣， 進樣量1.0～1.5 μL。單個氨基酸保留時間用GCMS確定。氨基酸氮同位素分析使用GCCIRMS進行， 氨基酸衍生化樣品先通過GC分離， 然后進入毛細管微反應器（IsoLink）轉化為相應的氣體， 燃燒產生的水分由全氟磺酸滲透膜去除， 將連通燃燒管與質譜儀的毛細管置于液氮冷阱中， 以固定樣品燃燒產生的CO2， 每測定10個樣品后， 將冷阱去掉， 以釋放固定住的CO2， 防止堵塞毛細管[11]。設定燃燒爐溫度為1030℃， 選用N2測定模式， 自動調用m/z 28， 29， 30的離子源參數。

2.3數據處理

數據處理運用ISODAT 軟件（Thermo， Fisher）， δ15N峰開始和結束的斜度分別設為0.2和0.4 mV/s， δ15N值的計算如下：

δ15N（‰）=[（Rsample/Rstandard）-1]×1000（2）

其中， Rsample表示所測樣品中15N豐度與14N豐度之比， Rstandard表示標準樣品中15N豐度與14N豐度之比。

3結果與討論

3.1衍生條件及GCCIRMS系統

氨基酸是兩性離子， 其羧基、氨基以及側鏈官能團被完全衍生化前并不適合用氣相色譜分離。在本研究中， 氨基酸通過衍生成功轉化為NPP酯。該方法的主要優點：所有的衍生化試劑不含氮原子， 因此不需要對氮同位素進行進一步校正；相較乙酰基而言， 新戊?；囊脒M一步減小了氨基酸的極性， 增加了色譜的分離效果。另外， 氨基酸NPP衍生物產生的背景噪音更小[12]。對于氣體同位素質譜系統而言， 毛細管柱和燃燒系統是非常重要的， 任一系統表面失活， 都可能會導致靈敏度的下降， 伴隨著保留時間的漂移， 信號強度顯著下降以及同位素比值不穩定等現象。因此， 每隔20～25個樣品，

GCIsoLink燃燒爐都有必要進行重新氧化。通氧后， 氮信號強度是判斷儀器是否恢復穩定的最好評判標準。本研究在GCCIRMS通氧后連續測定丙氨酸NPP酯衍生物20次。如圖1所示， 丙氨酸氮信號值在第6次進樣后達到穩定。GCCIRMS通氧、反吹后， 為保證測定值的準確性， 至少需測定標準樣品5次（活化）， 待信號值穩定后才能進行樣品的測定。實際過程中， 利用氨基酸混標進行活化。GCCIRMS每批次能測定的樣品數量與、 樣品性質及通氧時間等因素有關。實驗時應注意插入氨基酸標準來檢測Isolink的氧化性能， 一旦發現氧化效率降低， 立即停止測樣進行通氧氧化。通過氧化、活化， 氨基酸保留時間和氮信號強度會恢復正常。

3.2氨基酸在GCCIRMS中的色譜行為

GC的分離度取決于分析物的揮發性以及與固定相的相互作用。本研究使用非極性氣相色譜柱（DB5ms）對氨基酸NPP衍生物進行分離。與其它極性色譜柱相比， 該色譜柱可承受更寬的溫度范圍，

并可以得到氨基酸峰之間的最佳基線分離（如圖2a和圖2b）。目標化合物峰的基線分離是準確測定同位素值的首要條件， 尤其對于復雜的生物樣品而言。氨基酸衍生物保留時間與引入的烷基的長度相關， 其次還與氣相色譜柱的極性相關。在本研究中， 13種氨基酸可以得到基線分離（如圖2a和圖2b）， 低分子量、非極性的氨基酸， 例如丙氨酸、甘氨酸， 與固定相作用不強烈， 所以首先被洗脫出來。其次被洗脫出來的是較高分子量的中性氨基酸（例如纈氨酸， 亮氨酸）以及低分子量的極性氨基酸。最后被洗脫出來的是更高分子量的極性、芳香族氨基酸， 因為它們能與固定相發生強烈作用（圖2b）。樣品水解過程中， 天冬酰胺和谷氨酰胺會轉化為天冬氨酸和谷氨酸， 因此GCCIRMS 測量得到的天冬氨酸的δ15N 值代表了天冬氨酸中的氮和天冬酰胺中的氨基氮的δ15N 值， 谷氨酸的δ15N 值代表了谷氨酸中的氮和谷氨酰胺中的氨基氮的δ15N 值。

3.3GCCIRMS測定氨基酸氮同位素比值的精密度和準確度

為了評估測定結果的精確度以及檢驗本系統是否適用于自然豐度的氨基酸氮同位素比值的測定， 6個同樣濃度的氨基酸混合標準溶液分別衍生化， 并用GCCIRMS 測定其δ15N值。GCCIRMS測定的氨基酸δ15N值與EAIRMS測定的值相比， 評估測定結果的準確性（表1）。結果表明， GCCIRMS測定值具有較高的精密度， 所有氨基酸的δ15N值精密度都在1‰以內。EAIRMS和 GCCIRMS測定結果高度相關， 回歸斜率接近1， 相關系數為0.98（圖3）。經過校正， 這兩種儀器的測量值之間的差異小于1‰。另外， 采用BlandAltman 法評估EAIRMS和 GCCIRMS測定結果的一致性。結果表明， GCCIRMS測定結果的平均偏差接近0.0‰， 明顯位于儀器精確度范圍內（圖4）。因此， GCCIRMS測定

氨基酸氮同位素沒有造成明顯的同位素分餾， 并且本方法得到的δ15N值EAIRMS具有同等的準確度。

3.4氨基酸δ15N分析所需樣品量

GCCIRMS分析氨基酸氮同位素所需的樣品量是優化δ15N測定結果的準確度和精確度必須考慮的另一個重要參數。Merritt 等[13]認為δ15N的測定值和進樣量之間存在一定的相關性。Takano等[14]發現當氨基酸峰高（m/z 28）大于100 mV時， δ15N測定值的精確度較高（1σ=0.5‰）， 約相當于30 ng N的進樣量。同樣的， Styring等[15]發現在100～1200 mV的信號強度范圍內， 氨基酸δ15N測定值重復性最佳。本研究同樣證實了這種現象， 0.3～4.5 nmol氨基酸標準經過衍生后測得的信號值與對應的δ15N值具有一定的相關性， 如圖5所示。為得到準確可靠的δ15N值， 本實驗中進樣量為不少于20 ng N， 大致相當于200 mV（m/z 28）信號強度。與文獻[14，16]相比， 可能是由于同位素質譜儀以及燃燒爐性能的提高， 因此本研究所需進樣量減少。

3.5陽離子交換樹脂對于氨基酸δ15N測定的影響

利用陽離子交換樹脂純化氨基酸樣品被認為是一種有效方法， 可以去除一部分無機化合物， 并且將氨基酸從復雜的親水化合物中分離出來， 如糖、有機酸等。這些干擾化合物會大量消耗衍生劑， 也可能會對GCCIRMS系統的燃燒和還原爐造成損害[14，15]。尤其是， 當樣品中的目標化合物和其它含氮化合物不能基線分離時， 會導致目嘶合物的δ15N測定值與真實值偏差較大[17]。因此， 為了得到準確可信的δ15N值， 樣品純化是非常必要的。

如圖6所示， 過柱前后氨基酸δ15N值具有較好的相關性， 即使使用氨水洗脫樹脂中富集的氨基酸， δ15N值差異也不明顯。這說明使用此方法能夠有效排除非氨基酸類物質對檢測結果的干擾。

為了驗證陽離子交換樹脂可能帶來的雜質化合物， 空白溶液經完整的前處理過程后衍生并用GCCIRMS分析。如圖2c所示， 色譜圖中沒有明顯的背景化合物， 因此使用陽離子交換樹脂對生物樣品進行純化是非常有效的手段。

3.6氨基酸氮同位素方法初步評估阿哈湖淡水生態系統常見物種營養級

本研究通過對自然界生物個體中氨基酸氮同位素的測定評估該有機體的營養級。氨基酸的氮同位素組成以及TLGlu/Phe值如表2所示。根據所得TLGlu/Phe 值， 可以有效確定淡水生態系統的有機體營養級。大部分淡水生態系統中的食物鏈始于初級生產者（TL = 1，例如藻類和植物）。一般認為食草動物的營養級為2， 雜食性動物處于2～3之間， 而肉食性動物則處于3以上。在本研究中， 以白鰱和草魚為代表的草食性魚的的TLGlu/Phe≈2， 分別為1.9和 2.1。初級生產者水綿和黑藻的TLGlu/Phe 值分別為1.0和1.2。黃顙魚是一種被公認的兇殘的食肉型魚類， 其TLGlu/Phe=3.2。包括花鰱、鯽魚、鯉魚以及日本沼蝦在內的水生生物被認為是雜食性動物， TLGlu/Phe 值處于2.3～2.4之間。表2中的TLGlu/Phe 值和個體預期的營養級高度符合。因此， 氨基酸氮同位素法能準確反映有機體在自然淡水生態系統中的營養級。

4結 論

本研究采用氨基酸NPP酯衍生方法對前處理、衍生以及GC條件進行優化， 有效分離了13種氨基酸， 通過GCCIRMS測定得到準確可靠的δ15N值。陽離子交換樹脂純化氨基酸是一種有效的方式， 氨基酸標準經純化后其δ15N值變化幅度低于1‰。在進樣量不低于20 ng N時， GCCIRMS測定氨基酸δ15N值精度較高。本方法可以廣泛應用于大部分生物樣品中氨基酸δ15N值的y定。另外， 應用本方法測定阿哈湖水生生態系統中生物個體的氨基酸的δ15N 值， 進而計算對應的營養級， 所得結果與預期值高度相符，說明本方法可以有效估計自然生態中的某特定生物體的營養級。

References

1Fry B. Stable Isotope Ecology， New York： Springer Science & Business Media， 2007： 1-2

2Hobson K A. Mar. Ecol. Prog. Ser.， 1992， 84： 9-18

3DeNiro M J， Epstein S. Geochim. Cosmochim. Acta， 1981， 45（3）： 341-351

4Bronk D A， Glibert P M. Marine Biology， 1993， 115（3）： 501-508

5Chikaraishi Y， Steffan S A， Ogawa N O， Ishikawa N F， Sasaki Y， Tsuchiya M， Ohkouchi N. Ecol. Evol.， 2014， 4（12）： 2423-2449

6Naito Y I， Bocherens H， Chikaraishi Y， Drucker D G， Wiing C， Yoneda M， Ohkouchi N. J. Archaeol. Sci.， 2016， 6： 720-732

7Chikaraishi Y， Ogawa N O， Doi H， Ohkouchi N. Ecol. Res.， 2011， 26（4）： 835-844

8Dore J E， Brum J R， Tupas L M， Karl D M. Limnol. Oceanogr.， 2002， 47（6）： 1595-1607

9Ohkouchi N， Tsuda R， Chikaraishi Y， Tanabe K. Mar. Biol.， 2012， 160（4）： 773-779

10Corr L T， Berstan R， Evershed R P. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（23）： 3759-3771

11LI GuoHui， ZHONG QiDing， WANG DaoBing， SHEN ShiGang. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2016， 37（1）： 60-67

李國輝， 鐘其頂， 王道兵， 申世剛. 質譜學報， 2016， 37（1）： 60-67

12XU ChunYing， MEI XuRong， LI YuZhong， ZHONG XiuLi. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2008， 24（4）： 151-156

徐春英， 梅旭榮， 李玉中， 鐘秀麗.中國農學通報， 2008， 24（4）： 151-156

13Merritt D A， Hayes J. J. Amer. Soc. Mass Spectrom.， 1994， 5（5）： 387-397

14Takano Y， Kashiyama Y， Ogawa N O， Chikaraishi Y， Ohkouchi N. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2010， 24（16）： 2317-2323

15Styring A K， Kuhl A， Knowles T D， Fraser R A， Bogaard A， Evershed R P. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2012， 26（19）： 2328-2334

16Molero G， Aranjuelo I， Teixidor P， Araus J L， Nogues S. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2011， 25（5）： 599-607

17Ricci M P， Merritt D A， Freeman K H， Hayes J. Org. Geochem.， 1994， 21（67）： 561-571

篇2

一、深入開展法治宣傳教育

1、突出抓好十八屆五中全會精神的學習宣傳。充分利用各類普法陣地、普法平臺、普法載體，在全系統深入開展系列法制宣傳活動，引導廣大干部、群眾深刻理解和把握全面推進依法治國和依法治市建設，學習十八屆五中全會一系列新論斷、新部署、新要求，培育法治理念，塑造法治信仰，不斷增強厲行法治的積極性和主動性，努力成為社會主義法治的忠實崇尚者、自覺遵守者、堅定捍衛者。

2、突出抓好以憲法為核心的中國特色社會主義法律體系的宣傳教育。開展“學習憲法、尊法守法”主題活動。把主題活動作為重要載體，突出宣傳憲法，系統宣傳中國特色社會主義法律體系，大力宣傳憲法法律至上、法律面前人人平等、權由法定、權依法使等基本法治觀念。認真開展“12?4”國家憲法日暨全國法制宣傳日系列宣傳活動，不斷深化以宣傳憲法為主要內容的專項主題教育活動。

3、突出抓好與衛生、計生工作密切相關法律法規的宣傳教育。重點學習和宣傳《傳染病防治法》、《人口與計劃生育法》、《職業病防治法》、《精神衛生法》、《執業醫師法》、《省人口與計劃生育條例》、《公共場所衛生管理條例》等法律法規的學習宣傳，進一步增強衛生計生工作人員和廣大群眾知法、用法、自覺守法意識。

二、強化法律素養，扎實抓好重點對象普法教育工作

4、強化領導干部法治思維。抓住領導干部這個“關鍵少數”，推動落實領導干部學法活動。進一步健全黨組中心組學法和學法講座制度，黨組中心組全年集中學法活動不少于2次，舉辦法制講座不少于2次。堅持和完善領導班子和領導干部重大決策前法律咨詢制度。充分發揮好領導干部帶頭學法守法用法的表率作用，推動衛生計生系統普法教育工作的深入開展。

5、抓好機關公務員的學法用法工作。堅持和完善國家工作人員學法用法制度，大力推進公務員學法用法活動和依法行政培訓工作，進一步增強法治意識和依法行政能力，公務員依法履職情況好，辦事效率高。機關工作人員堅持集體學法與自學相結合，每人要有學法筆記和學習心得，每年有針對性的學法時間不少于30學時。

6、抓好衛生計生行政執法人員的學法用法工作。一方面要學習熟知衛生計生相關法律法規，另一方面在執法過程中加強法律法規的宣傳，同時運用法律條款準確，提高執法效率和水平。

7、抓好衛生計生專業技術人員的學法用法工作。深入學習《傳染病防治法》、《精神衛生法》、《執業醫師法》、《護士條例》等，進一步增強法律意識，提高法律素養，依法開展執業活動。各級醫療機構每年針對在職醫師、護士的法律培訓不能少于2次。

8、抓好管理相對人的宣傳培訓。繼續深入開展“法律六進”活動，積極宣傳衛生計生法律法規，有效提高廣大人民群眾尊法守法意識，營造單位和社會學法用法的良好氛圍。

三、積極創新普法宣傳的載體和形式，健全普法教育機制

9、扎實推進法制文化陣地建設。鞏固發揮報刊、廣播、電視等大眾傳媒的獨特優勢，加大媒體法制宣傳教育力度，創新傳統媒體普法的方式方法。廣泛利用各類公共活動場所，融入法制元素，建設法制走廊、法制宣傳欄和法制宣傳櫥窗，形成覆蓋機關、城鄉的法制文化陣地網絡。加大應用新媒體開展法制宣傳教育的力度，推進網絡、移動通訊法制宣傳教育力度，積極運用微博、微信、QQ群開展普法，擴大新媒體普法的覆蓋面。全系統各單位均要設立固定的法制宣傳陣地，不斷更新法制宣傳內容。

10、進一步健全普法教育機制。改進普法宣傳教育方式，建立“誰執法誰普法”制度，推進落實國家機關“誰執法誰普法”的普法責任制。結合本行業制定頒布重點普法目錄，明晰行政執法部門普法清單、明確普法責任。把法治宣傳教育納入精神文明創建內容，把尊法守法用法情況作為精神文明創建的重要指標。

四、強化領導，完善普法工作運行機制，注重考評宣傳