正向遺傳學克隆基因的方法范文

導語：如何才能寫好一篇正向遺傳學克隆基因的方法，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

1.巴氏小體案例在遺傳學教學中的應用

2.下一代測序技術在表觀遺傳學研究中的重要應用及進展

3.遺傳學教學中在細胞與分子水平上理解等位基因的顯性與隱性

4.果蠅唾腺多線染色體研究進展及其在遺傳學教學中的應用

5.以人類血型為遺傳學案例教學的思考與實踐

6.表觀遺傳學藥物的研究進展

7.表遺傳學幾個重要問題的述評

8.構建優質教學體系,促進《遺傳學》精品教育

9.小鼠毛色遺傳的控制機制及其在遺傳學教學中的應用

10.肝癌發生的分子遺傳學和表遺傳學研究

11.景觀遺傳學原理及其在生境片斷化遺傳效應研究中的應用

12.以遺傳信息為主線的遺傳學教學架構及與其他課程的銜接

13.認知過程中的表觀遺傳學機制

14.我國高校遺傳學教材的出版與使用現狀的調查

15.表觀遺傳學:生物細胞非編碼RNA調控的研究進展

16.表觀遺傳學視角下運動干預阿爾茨海默病的機制分析

17.遺傳學與基因組學整合課程探討

18.表觀遺傳學研究進展

19.癲癇表觀遺傳學研究進展

20.不僅僅是遺傳多樣性:植物保護遺傳學進展

21.利用文獻精讀教學新模式優化遺傳學教學

22.2015年中國醫學遺傳學研究領域若干重要進展

23.發展行為遺傳學簡介

24.光遺傳學技術應用于動物行為學在神經回路中的研究進展

25.表遺傳學推動新一輪遺傳學的發展

26.生物教育專業《遺傳學》教學改革的探索

27.糖尿病腎病遺傳學研究進展

28.腫瘤表觀遺傳學研究熱點的聚類分析

29.淺談高?！哆z傳學》課程教學改革與實踐

30.2015年中國微生物遺傳學研究領域若干重要進展

31.利用經典文獻優化《遺傳學》雙語教學

32.孟德爾豌豆基因克隆的研究進展及其在遺傳學教學中的應用

33.表觀遺傳學在肺癌診治中的研究進展

34.人格行為遺傳學研究的兩類取向

35.害蟲遺傳學控制策略與進展

36.表觀遺傳學及其應用研究進展

37.阿爾茲海默病的表觀遺傳學機制及相關藥物研究

38.胃癌遺傳學及表遺傳學研究進展

39.遺傳學在膽管細胞癌發展中的重要性

40.子癇前期表觀遺傳學研究進展

41.行為遺傳學:從宏觀到微觀的生命研究

42.遺傳學史在遺傳學教學中的作用

43.男性不育的遺傳學評估

44.表觀遺傳學與腫瘤干細胞

45.開放式教學在遺傳學實驗教學中的探索與實踐

46.表觀遺傳學調控與婦科腫瘤發生、演進及治療的研究進展

47.規律運動干預人類衰老過程的表觀遺傳學機制研究進展

48.表觀遺傳學及其在同卵雙生子研究中的新進展

49.分子群體遺傳學方法處理鯉形態學數據的適用性

50.番茄果重數量性狀基因的研究進展及在遺傳學教學中的應用 

51.遺傳學教學中遺傳學史及科學方法論的教育

52.景觀遺傳學:概念與方法

53.孤獨癥的遺傳學和神經生物學研究進展

54.肺癌表觀遺傳學的研究進展

55.腫瘤的表觀遺傳學研究

56.遺傳學課程群的設置和思考

57.《遺傳學》課程的建設與優化

58.表觀遺傳學在中樞神經系統退行性疾病中的研究進展

59.遺傳學實驗教學體系的改進

60.肝癌表觀遺傳學研究進展

61.保護生物學一新分支學科——保護遺傳學

62.表觀遺傳學在淋巴系統腫瘤研究中的新進展

63.大腸癌的表觀遺傳學研究進展

64.重視經典遺傳學知識體系構建和學生自學能力的培養

65.植物化學遺傳學:一種嶄新的植物遺傳學研究方法

66.關聯分析及其在植物遺傳學研究中的應用

67.表觀遺傳學及現代表觀遺傳生物醫藥技術的發展

68.三陰性乳腺癌與表觀遺傳學研究現狀

69.構建培養新型醫學人才的醫學遺傳學課程體系改革

70.骨髓增生異常綜合征的遺傳學檢測研究進展

71.釘螺遺傳學及其生物學特性的研究進展

72.羞怯:來自行為遺傳學的觀點

73.遺傳學探究性實驗教學的思考及實踐

74.“教學、實踐、科研、臨床”四位一體的醫學遺傳學教學體系建設探索與實踐

75.國內高校遺傳學教材發展研究

76.男性生殖遺傳學檢查專家共識

77.腫瘤表遺傳學研究的進展

78.創新性遺傳學大實驗對提高大學生綜合能力的研究

79.白內障表觀遺傳學研究的現狀及進展

80.遺傳學研究性實驗教學模式探索與創新人才培養

81.表觀遺傳學在木本植物中的研究策略及應用

82.高通量測序技術結合正向遺傳學手段在基因定位研究中的應用

83.激發與培養學生學習遺傳學興趣的教學途徑

84.從表觀遺傳學開展復雜性疾病證候本質的研究

85.藍藻分子遺傳學十年研究進展

86.建設遺傳學課件體系 提高多媒體教學質量

87.表觀遺傳學與腫瘤

88.原發性肝癌的表觀遺傳學及其治療

89.青少年焦慮、抑郁與偏差行為的行為遺傳學研究

90.兒童孤獨癥的遺傳學研究進展

91.本科生遺傳學實驗教學的改革探討

92.與閉經有關的遺傳學問題

93.多媒體教學在遺傳學“三點測驗”教學中的實踐

94.一個實用的群體遺傳學分析軟件包——GENEPOP3.1版

95.論從“腎為先天之本”到“中醫遺傳學”

96.《遺傳學》多媒體教材的編寫與實踐

97.肺癌的表觀遺傳學研究進展

98.無創性產前遺傳學檢測研究進展

篇2

【關鍵詞】X-連鎖無丙種球蛋白血癥（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；診斷；治療

【Abstract】X-linkedagammaglobulinemia（XLA）belongstotheprimaryimmunodeficiencydisease（PID），whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglobulin，becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase（BTK）gene，whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlereviewsthegeneticcharacters，mutationanalysis，molecularpathogenicmechanismandtherapyoftheBKTgene.

【Keywords】XLA；BTK；diagnosis；therapy

X連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linkedagammaglobulinemia，XLA），又稱Bruton無丙種球蛋白血癥，是最早發現的人類原發性免疫缺陷?。╬rimaryimmunodeficiencydisease，PID）之一，Bruton（1952年）首次報道。患者臨床上以反復細菌感染為特征，血清中各類免疫球蛋白明顯降低或缺乏，對抗原刺激不能產生抗體應答，血循環中B淋巴細胞減少，淋巴結及淋巴組織缺乏生發中心和淋巴濾泡，骨髓中無漿細胞，但前B淋巴細胞數量正常，T淋巴細胞數量及功能正常。典型病例為出生后半年左右開始反復化膿感染（如肺炎鏈球菌或嗜血流感桿菌）或遲至幼年發病，患者體內缺少成熟B細胞，基本上不能自主產生免疫球蛋白，必須依靠免疫替代療法維持體液免疫水平。該病嚴重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］臨床診斷病例可檢出相關致病基因BTK發生突變，而其他10%～20%［1］的病人存在其他問題，有研究顯示常染色體編碼Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突變。

1BTK的遺傳學特性大多數PID的遺傳形式已經明確，幾乎均為單基因遺傳，多數為常染色體隱性遺傳，其次為X連鎖隱性和常染色體顯性遺傳。大多數情況男性發病，女性攜帶，但也有男性攜帶者不發病的報道。60%的PID突變基因的DNA序列已被克隆，突變位點（包括突變基因定位的染色體節段和基因位點）和突變形式（單個核苷酸缺失、替代、插入、移碼突變、無義或錯義突變等）也已確定［5］。在WHOPID專家委員會的指導下，成立了有關疾病基因庫，記錄登記全球范圍的PID基因突變及其類型。多基因遺傳性PID的確定較困難，至今尚無確切的報道。

1.1BTK的蛋白結構BTK蛋白為B細胞信號傳遞系統中的重要蛋白，屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一員，該家族的成員還包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5個不同的結構區段（見圖1），從N末端起為PH（pleckstrinhomology；PH）段，約有120個氨基酸，TH（Techomology；TH）段約有60～80個氨基酸SH3（Srchomology3;SH3）段約有60個氨基酸，SH2段約100個氨基酸，激酶催化段約280個氨基酸［6］。

圖1BTK蛋白的組成（從N端開始）包括5個區域：PH、TH、SH3、SH2和激酶區。

注：圖上邊的數字代表各段的氨基酸長度，圖下邊的數字代表不同的外顯子及其相應的位置。

BTK蛋白的空間結構多數已測明，包括PH區、TH區的前半部、SH3區和激酶催化區［7］，SH2區的結構可借用其他蛋白激酶的類似結構進行研究。這些三維空間結構可用于分析突變造成的蛋白空間結構的改變。

1.2BTK基因的分子結構及其突變分析在20世紀80年代，多位學者應用DNA多態性標志分析的方法，成功地將XLA的缺陷基因定位于X染色體中部（Xq21.3-22）的2cm區域內［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病變基因區內分離鑒定了一個新的基因，該基因表達于正常人各期B淋巴細胞，在XLA患者中發生突變，故認為是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全長37.5kb，含有19個外顯子，除第一外顯子外，其余18個編碼BTK蛋白的659個氨基酸，分子量為76KD［9］。cDNA含有2560個核苷酸，有一個編碼659個氨基酸多肽的開放閱讀框架，起始密碼子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15個密碼子處閱讀框架閉合。根據國際研究小組BTK突變分析，迄今已經在471個家族544個XLA病人中發現了BTK基因341個獨立存在的堿基置換、插入或缺失，其中有13個大段缺失和2個大段插入。突變不僅存在于19個外顯子，還涉及內含子和啟動區域。其中，發生頻率最高的是錯義突變，其次是無義突變和拼接位點突變。錯義突變主要發生在三聯體密碼子的前兩位。外顯子8和9的185~287位沒有錯義突變，這些位點可能不易突變或是功能上不重要。33%的替代累及CPG雙核苷酸，這是目前認為的最常見的突變熱點［10］，而突變高頻位點R520也屬于CPG突變［6］。編碼外顯子蛋白突變的區域［11］（見表1）。表1編碼外顯子蛋白突變的區域

2BTK的分子致病機制BTK屬于非受體酪氨酸蛋白激酶，該類激酶廣泛參與細胞信號傳導，影響細胞的存活、增殖和分化，BTK是B細胞發育成熟的關鍵因素。正常人除T細胞和漿細胞外均有BTK表達，而BTK基因突變只影響B細胞的數量，這說明BTK在B細胞的生長發育過程中起著至關重要的作用。目前對BTK參與細胞信號傳導研究比較清楚的是BCR交聯介導的信號傳導途徑。其過程簡述如下：BCR交聯激活Pl-3激酶并產生一定數量的Pl-3，4，5-risphosphate與膜結合，Pl-3，4，5-risphosphate與BTK的SH3段作用使其定位于細胞膜。然后，BTK經過兩步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是與Lyn作用），接著是SH3段Y223位的自身磷酸化?；罨蟮腂TK與B細胞銜接蛋白（BLNK）結合并激活phospholipaseC-γy（PLC-γ），導致鈣離子通道打開，胞外鈣離子內流。該信號傳導途徑最終導致細胞增生加強和轉錄的變化。此模式僅限于以B細胞受體交聯作為刺激信號，至于前B細胞受體交聯是否也引起相同的信號傳導目前還缺乏證據［1，12］。該信號傳導途徑受FcRⅡB和SHIP（SH2-containinginositol-5-phosphatase）磷酸酶介導的另一途徑制約，通過水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate關閉鈣離子內流通道［13］。BTK不僅可以由BCR和FCR介導激活，也可以通過其他很多受體激活，包括G-protein-coupledreceptors（GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和單克隆抗體的交聯也可激活BTK［13］，近年來研究表明，CD40也是B細胞發育過程中的重要受體，傳遞刺激信號影響細胞存活、生長和分化。與BCR介導的BTK活化途徑相似，CD40的交聯也可激活BTK。CD40和BCR可能是B細胞發育過程中不同階段激活BTK的信號傳遞通路。但也有研究提示CD40不通過BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是獨立于BTK的信號傳導通路［14～16］。BTK在細胞內與很多分子相互作用，共同構成了一種微環境，在信號傳導的過程中起著重要的作用。這些分子分別與BTK的不同區段相互作用，其中與PH段作用的分子研究得很多，R28附近區域與PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH-TH區域與Gαq和Gβ雙體作用;SH3與c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2與磷酸化的BLNK作用。另外，SH3與TH在BTK分子內作用，抑制BTK的活性。在BCR交聯介導的信號傳導途徑中，Syk和BLNK對BTK的活化起正向調節作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK對BTK的活化有抑制作用。盡管與BTK作用的分子很多，但是它們如何協調地與BTK作用，完成BTK參與的信號傳導，機制目前尚不清楚［17，18］。

3XLA的診斷XLA是一種原發性體液免疫缺陷癥，危害著人們的健康。因而，對該癥進行產前診斷和女性攜帶者的鑒定就顯得十分重要［19］。為了研究XLA家系女性成員的情況，Fearon等采用了X染色體失活的方法去發現攜帶狀況以及驗證B淋巴細胞發育的內在缺陷。根據這一方法用重組DNA探針同時發現RFLP和X染色體基因甲基化。在無攜帶狀態的女性的外周血粒細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞中發現X染色體的隨機失活。相反，該癥的三個攜帶者在外周B淋巴細胞兩個X染色體中的一個優先失活，但不是T細胞或粒細胞。這一發現強烈地支持XLA是由B淋巴細胞發育的內在缺陷所致的假設。Lovering（1994）等［20］對BTK基因缺失患者DNA分子斑點雜交分析見到了已改變的DNA限制性片段，并對7個患者家庭用已經改變的限制性片段方法對與患者有關的女性攜帶狀況作出診斷。隨后，Schuster等［21］報道了對所有19個外顯子。包括側翼內含子邊界采用PCR-SSCP方法成功地檢測到兩例男性患兒BTK的SH2功能區的新突變，并用一個已改變過的第一個引物做PCR擴增突變發生，作出三代中健康女性攜帶者的鑒定。接著，Hagemann等［22］對一個散發的XLA患兒及家庭的三代成員應用PCR擴增基因組DNA，采用序列分析的方法直接鑒定XLA的基因突變，結果診斷出患兒及其免疫學表現正常的女性攜帶者。以上這些方法均可應用于產前診斷。這無疑對優生優育是很有意義的。

4XLA的治療研究免疫重建是采用正常細胞或基因片段植入患兒體內，使之發揮功能，以持久地糾正缺陷的基因及其表達產物。1968年使用HLA配型同種異體骨髓移植治療2例致死性免疫缺陷病獲得成功。至今已有近2000例PID患兒接受骨髓移植，總存活率為62%，其中同型合子骨髓移植達79%。無關供體配型骨髓（matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率約為50%，5歲以內接受移植者可達85%［23］。近年開展臍血干細胞移植，存活率為75%。用母體骨髓CD34+干細胞宮內移植（腹腔注射）已有成功的報道［5］。將正常目的基因片段整合到患兒干細胞基因組內（基因轉化），隨細胞有絲分裂，轉化的基因片段能在患兒體內復制而持續存在。理論上講，凡能通過骨髓移植治愈的疾病均是基因治療的指針［24］?；蛑委烶ID的嘗試已經歷多年，取得一定成效，但尚處于探索和臨床驗證階段［25］。Faust等［26］的動物實驗是通過免疫球蛋白的增強子和驅動子介導的小鼠BTKcDNA轉錄至兩組免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。轉入1個拷貝的XLD或BTK-/-鼠經蛋白印跡法檢測其BTK達到正常量的25%；而轉錄2個拷貝者其BTK達到正常量的50%。兩組小鼠經檢測均有正常數量的脾B細胞，兩組小鼠對TNP一蔗聚糖刺激所產生抗體的反應和血清IgM、lgG3水平較正常野生鼠明顯減低，但較XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通過人類BTKcDNA與鼠主要組織相容性復合體Ⅱ區調節因子的轉基因治療，糾正了BTK缺陷鼠的B細胞功能，并發現轉入的基因并不表達于前B細胞以前的分化階段，此外它在胸腺上皮細胞、活化T細胞、單核細胞上表達，并在其他組織均有低水平表達。經蛋白印跡法檢測轉基因鼠的脾細胞產物發現，BTK蛋白總含量可達到與野生型鼠相同。這些研究均向我們提供了基因治療XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通過動物實驗證實，應用極少量正常骨髓細胞輸注即可通過競爭使XID小鼠獲得B系統免疫重建。這項研究推測，即使不成功的基因治療也可對XLA患者有益，為今后開展人類XLA的基因、細胞治療提供有利的基礎和廣闊的前景?？傮w上說，盡管目前基因治療離成熟的臨床治療技術還有相當的距離，但經過近10年的臨床試驗，人們已獲得了大量寶貴的臨床資料。我們有理由相信，XLA的基因治療將在不久的將來獲得突破性進展。

5展望盡管80%～90%臨床診斷為XLA的病人依靠BTK突變檢測確診為XLA，但是XLA的基因突變位點很多，與臨床癥狀的相關性不強，同一家系中的XLA病人臨床表現程度很可能各不相同。即：基因型和臨床表型的關系是目前需要研究的課題之一［29］。這涉及到突變基因產物蛋白質的功能、結構穩定性和二維構像［30，31］。這樣，通過基因突變及其對蛋白的影響無法預知XLA的病程、復雜程度、B細胞數量和免疫球蛋白的水平。只有徹底明確BTK在B細胞信號傳導中的作用機制，才能找到基因突變和臨床癥狀的相關性，完善XLA的基因診斷，并為治療奠定理論基礎［32］。1994年，國際上成立了BTK基因突變分析小組并建立了BTK基因突變數據庫（http：//uta.fi/imt/bioinfo/btkbase/），為XLA的基因診斷提供了便利的條件。但是數據庫中的病源主要來自西方國家、日本和俄羅斯，而國內的BTK基因研究相對處于空白階段。因此，目前開展BTK基因突變的檢測工作應成為國內同類研究的重點，通過建立有效可靠的BTK基因突變篩查方法，研究中國人BTK基因突變的規律。因此，隨著對PID認識的深入和檢測方法的簡化，將會有更多的病例被確診，不僅可以用常規方法治療，而且可以做基因分析，同時，建立PID登記網絡［33］，也將有助于了解確切的發病率和需要治療的患者?？傊?，來自突變基因的BTK蛋白還沒有被完全認識，在蛋白質水平這些突變的結果還不清楚。BTK基因突變在XLA發病機制中更詳細作用還不清楚，但作為疾病基因，對其基因組結構的研究，將為未來的體細胞基因治療創造條件。當然，體細胞治療存在著一定的問題，目前還不能達到此目的，但這是今后研究的一個重要方向，基因治療無疑是近20年來分子生物學和重組DNA技術迅速發展的一種結果。由于體內大劑量靜脈丙種球蛋白的長期替代療法有不少的副作用，且價格昂貴，不能根本解決問題。若能將缺陷的基因進行原位的修補，基因治療將是最理想的根治方法。

【參考文獻】

1LebienTW.FatesofhumanB-cellprecursors.B1ood，2000，96（1）：9-23.

2MinegishiY，Coustarn-SmithE，RapalusL，etal.MutationsinIg（CD79a）resultinacompleteblockinB-celldevelopment.JournalofClinicalInvestigation，1999，104（8）：1115-1121.

3WangY，KaneganeH，SanalO，etal.NovelIg（CD79a）genemutationinaTurkishpatientwithBcell-deficientagammaglobulinemia.Ameri-canJournalofMedicalGenetics，2002，108（4）：333-336.

4MliliM，AntunesH，Blanco-BetancourtC，etal.Aneecessiveagammaglobulinemiawithimpairedpre-BcelldifferentiationduetoalargedeletionoftheIGHlocus.EuropeanJournalofPediatrics，2002，161（9）：479-484.

5ChapelH，GehaR，RosenF.Primaryimmunodeficiencydiseases：anupdate.ClinExpImmunol，2003，132：9-15CDC.

6VihinenM，KwanSP，LesterT，etal.MutationsofthehumanBTKgenecodingforBrutontyrosinekinaseinX-linkedagammaglobulinemia.Humanmutation，1999，13（4）：280-285.

7MaoC，ZhouM，UckunFM.CrystalStructureofBruton’styrosinekinasedomainsuggestsanovelpathwayfoxactivationandprovidesinsightsintothemolecularbasisofX-linkedagammaglobulinemia.JournalofBiologicalChemistry，2001，276（44）：41435-41443.

8孫金英，劉樂宇，劉桂蘭.X連鎖無丙種球蛋白血癥的分子生物學研究進展.國外醫學·兒科學分冊，2001，28（4）：191-194.

9王劍利，耿松海.BTK基因與XLA.國外醫學·遺傳學分冊，2000，23（5）：263-266.

10VihinenM，BrooimansRA，KwanSP，etal.ImmunolToday，1996，17（1）：502-506.

11VihinenM，CooperMD，DeSaintBasileG，etal.ImmunolToday，1995，16（1）：460-465.

12TanJE-L，WongS-C，GanSK-E，etal.TheadaptorproteinBLNKisrequiredforBcellantigenreceptorinducedactivationofnuclearfactorbandcellcycleentryandsurvivalofBlymphocytes.TheJournalofSiologicalChemistry.TheJournalofBiologicaltheMistry，2001，276（23）：20055-20063.

13Mohamed，Nore，Christensson，etal.SignalingofBruton’styrosinekinase，Btk.ScandinavianJournalofImmunology，1999，49（2）：113.

14BrunnerC，AvotsA，KrethHW，etal.Bruton’styrosinekinaseisactivateduponCD40stimulationinhumanBlymphocytes.Immunobiology，2002，206（4）：432-440.

15MizunoT，RothsteinTL.Cuttingedge：CD40engagementeliminatestheneedforBruton’styrosinekinaseinBcellreceptorsignalingfoxNF—B.JournalofImmunology，2003，170（6）：2806-2810.

16BrunnerC，KrethHW，OchsHD，etal.Unimpairedactivationofc-JunNH2-terminalkinase（JNK）1uponCD40stimulationinBcellsofpatientswithX—linkedagammaglobulinemia.JournalofClinicalImmumology，2002，22（4）：244-251.

17KoyasuS.Beatingakinase.NatureImmunology，2001，2（10）：897-898.

18LiuW，QuintoI，ChenX，etal.DirectinhibitionofBruton’styrosinekinasebyIBtk，aBtkbindingprotein.NatureImmunology，2001，2（10）：939-946.

19黃海.Btk與XLA相關性研究進展.國外醫學·兒科學分冊，1998，25（5）：248-251.

20LoveringRC，SweatmanA，GenetSA，etal.HumGenet，1994，94（1）：77-79.

21SchusterV，SeidenspinnerS，KrethHW，etal.AmJMedGenet，1996，63（1）：318-322.

22HagamannTL，ChenY，RosenFS，etal.AmJModGenet，1995，59（2）：188-192.

23AntoineC，MullerS，CantA，etal.Long-termsurvivalandtransplantationofhaemopoieticstemcellsforimmunodeficiencies：reportoftheEuropeanexperience1968一99.Lancet，2003，361：553-560.

24Hacein-Bey-AbinaS，LeDeistF，CarlierF，etal.SustainedcorrectionofX-linkedseverecombinedimmunodeficiencybyexvivogenetherapy.NEnglJMed，2002，346：1185-1193.

25Hacein-Bey-AbinaS，VonKalleC，SchmidtM，etal.AseriousadverseeventaftersuccessfulgenetherapyforX-linkedseverecombinedimmunodeficiency.NEnglJMed，2003，348：255-256.

26SatterthwaiteAB，CheroutreH，KhanWN，etal.BtkdosagedeterminessensitivitytoBcellantigenreceptorcross一linking.ProcNatlAcadSciUSA，1997，94（24）：13152-13157.

27DrabekD，RaguzS，DeWitTP，etal.CorrectionoftheX-linkedimmunodeficiencyphenotypebytransgenicexpressionofhumanBectontyrosinekinaseunderthecontrolofthelossⅡmajorhistocompatibilitycomplexEalocuscontrolregion.ProcNatlAcidSciUSA，1997，94（2）：610-615.

28RohrerJ，ConleyME.CorrectionofX一linkedimmunodeficientmicebycompetitivereconstitutionwithlimitingnumbersofnormalbonemarrowcells.Blood，1999.94（10）：3358-3365.

29楊錫強.原發性免疫缺陷病的歷史、現狀和展望.中華兒科雜志，2004，42（8）：561-563.

30馮雷.免疫缺陷病.北京：人民衛生出版社，1988，184-217.

31Applyingpublichealthstrategiestoprimaryimmunodeficiencydiseases：apotentialapproachtogeneticdisorders.2004，6.1stavailablefrom：URL：http：//cdc.gov/genomics/info/conference/PIsynop.htm.

篇3

關鍵詞：白菜型油菜；BraSDG2；RNA干擾；擬南芥；遺傳轉化

中圖分類號：S634.301文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0007-05

據估計，50%～70%的被子植物在其進化過程中至少經歷過1次多倍化過程[1]，基因表達的變化在多倍體化過程中起著重要作用[2]。組蛋白甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，在參與重塑染色質結構與基因表達方面起到重要作用，其主要包括賴氨酸和精氨酸的甲基化[3]。組蛋白賴氨酸（K）甲基化修飾包括組蛋白H3的K4、K9、K27、K36和組蛋白H4的K20的單、雙和三甲基化的修飾狀態。組蛋白H3K4及H3K36的甲基化修飾被認為參與基因表達的激活，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化修飾則被認為與基因沉默及異染色質結構的維持相關[4]。

擬南芥SDG2編碼一個包含2 335個氨基酸的蛋白質，其含有SET、Post-SET、GYF保守結構域，具有特異的H3K4me3甲基轉移酶活性。SDG2突變后，擬南芥的育性完全喪失，50%的四分體包含小孢子的數量少于四個，且BT3、SPL、MS1、EDA31、MEE65等11個與雄配子發育相關基因的表達發生明顯下調[5]。因此，SDG2介導的H3K4me3甲基轉移酶活性影響著雄配子體的發育及植物育性。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）所介導的基因沉默現象，它在轉錄、轉錄后以及翻譯水平上干擾基因的表達。RNAi技術是一種研究功能未知基因的有效方法。我們前期的研究表明，在二倍體的白菜型油菜中，BraSDG2具有2個拷貝，并具有不同的組織表達模式，這些結果暗示在基因多倍體化過程中組蛋白甲基轉移酶基因的命運可能發生了明顯分化[6]。本研究擬通過構建BraSDG2的RNA干擾載體，經浸花法轉化哥倫比亞野生型擬南芥（Col-0），篩選BraSDG2基因沉默的穩定遺傳的轉基因擬南芥植株并觀察其表型特征，為進一步研究白菜型油菜BraSDG2的生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

白菜型油菜（Brassica rapa）B2；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α；根癌農桿菌GV3101；載體pMD19-T vector和pFGC5941（含PPT抗性）。以上試驗材料均來自湖南農業大學植物發育與表觀遺傳調控實驗室。

1.2試驗方法

1.2.1白菜型油菜BraSDG2-RNAi片段的克隆從Tair與白菜基因組數據庫BRAD收集擬南芥SDG2、白菜BraSDG2a和BraSDG2b CDS序列，經比對分析后選取一段258 bp的保守序列，命名為BraSDG2-RNAi。設計引物序列BraSDG2-RNAi F：5′-CCATGGTCTAGATTGGTGGGCTGCCAGATTG-3′（下劃線分別表示NcoⅠ、XbaⅠ酶切位點）；BraSDG2-RNAi R：5′ -GGCGCGCCGGATCCGATCCCCAAACACACGTCTCATAAC-3′（下劃線分別表示Asc Ⅰ、BamHⅠ酶切位點）。

高保真酶PCR擴增后獲得RNA干擾目的片段，切膠回收后連接到pMD19-T載體上，命名為pMD19-T-BraSDG2-RNAi，將連接好的載體通過熱激法轉化至感受態大腸桿菌DH5α，挑選PCR檢測為陽性的單菌落提取質粒測序。

1.2.2RNAi載體的構建使用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切載體pMD19-T-BraSDG2-RNAi和pFGC5941。將反向BraSDG2-RNAi片段導入終止子與CHSA intron之間，獲得中間載體p-BraSDG2-RNAi；再通過AscⅠ和NcoⅠ對載體pMD19-T-BraSDG2-RNAi和p-BraSDG2-RNAi進行雙酶切，將正向BraSDG2-RNAi片段導入35S啟動子與CHSA intron之間，最終獲得RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi。對獲得的RNA干擾載體進行酶切驗證。

1.2.3擬南芥的遺傳轉化及篩選將pFGC5941-BraSDG2-RNAi導入到工程菌GV3101后，挑選陽性菌落用于擬南芥轉化。通過浸花法將該重組質粒轉化至野生型擬南芥（Col-0）中，采用濃度為100 mg/mL的PPT篩選T0代擬南芥轉化子。設計檢測引物35S825 F：5′-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT-3′，Intron825 R：5′-TGAC-TCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3′，對獲得的抗性苗進行PCR檢測篩選轉基因植株。

1.2.4轉化子的表型觀察將野生型、T3代和T4代（純合體）轉基因擬南芥種子經4℃春化2～3 d后，置于22℃長日照（16 h/8 h）條件下培養37 d，對其進行表型觀察。

2結果與分析

2.1BraSDG2-RNAi片段的克隆

經序列比對，選取一段長度為258 bp的保守序列作為RNAi片段，命名為BraSDG2-RNAi，并成功克隆到該基因片段，見圖1。將克隆的目的片段與pMD19-T載體連接并導入感受態工程菌DH5α中，選取編號為13和16的兩個陽性單菌落（圖2）送至公司測序。結果如圖3所示，目的

片段與預期片段比對，序列基本一致（5個位點的差異是由于本實驗室所提供的白菜型油菜品種與白菜基因組數據庫品種有所差異導致）。

2.2BraSDG2干擾載體的構建

將BraSDG2-RNAi片段正反向插至目的載體pFGC5941上，結構如圖4所示。通過酶切驗證，確認BraSDG2 RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi構建成功，酶切后的片段大小與預期一致，如圖5所示。

2.3擬南芥的遺傳轉化

經浸花法將構建的重組質粒轉化野生型擬南芥（Col-0），通過100 mg/mL PPT篩選得到抗性苗并進行PCR檢測，擴增結果如圖6所示。結果顯示，獲得了1株轉基因植株。

2.4BraSDG2 RNAi轉基因植株表型觀察

在相同長日照條件下（16 h/8 h），對生長37 d的T3、T4代 BraSDG2 RNAi轉基因擬南芥植株與Col-0進行觀察。相比Col-0，T4代BraSDG2 RNAi轉基因植株（純合體）形態特征表現為植株矮小且出現敗育現象（圖7），其表型與擬南芥sdg2缺失突變體相近。

3討論與結論

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學標記，其作用機理是通過特異的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶催化改變染色質結構，間接影響基因表達，在植物生長發育中起到重要的生物學作用。擬南芥核組蛋白的賴氨酸殘基被甲基化常見的有4類， histoneH3lysine4（H3K4）、H3K9、H3K27、H3K36?，F有研究的基因組規模分析的結果顯示不同位點不同程度的甲基化會導致轉錄異常，從而影響基因的表達[7-15]。

研究表明，擬南芥的大多數基因都存在組蛋白甲基化現象，其中發揮重要作用的就是組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT），這是一類包含130～150個氨基酸保守 SET結構域的蛋白[16]，該保守結構域也是其發揮催化作用的活動中心。SDG蛋白家族都含有SET結構域，擬南芥SDG2功能表現為特異性地催化組蛋白，對H3K4位點造成雙甲基化與三甲基化，從而調控相關基因表達[17]。

已有試驗表明，對擬南芥SDG2進行RNAi，會導致植株弱小、葉片變小、根長變短、蓮座葉數目變少。本研究通過序列比對獲得白菜型油菜中與擬南芥SDG2同源的基因片段BraSDG2-RNAi，并構建BraSDG2 RNA干擾載體轉化擬南芥，結果表明構建的載體可以有效干擾擬南芥SDG2基因的表達，BraSDG2 RNAi擬南芥轉基因純合植株表型與sdg2擬南芥突變體相似，都表現為植株矮小且育性極低，從而佐證了組蛋白甲基化轉移酶SDG2同系物在植物中是高度保守的。有研究顯示，擬南芥SDG2的缺失導致H3K4me3甲基轉移酶在體內劇烈下降，突變體具有強烈的多向性的表型以及許多基因的錯誤調控，植株矮小和敗育就是其中重要的表型[18]。本試驗證明了白菜型油菜中SDG2的同系物BraSDG2可能對H3K4me3甲基轉移酶具有相似的功能，該結果為進一步研究組蛋白甲基轉移酶SDG家族的作用機制與白菜中BraSDG2的生物學功能奠定基礎。

參考文獻：

[1]Masterson J. Stomatal size in fossil plants： evidence for polyploidy in majority of angiosperms[J]. Science， 1994，264（5157）：421-423.

[2]Wendel J F. Genome evolution in polyploids[J]. Plant Mol. Biol.， 2000，42（1）：225-249.

[3]Martin C， Zhang Y. The diverse functions of histone lysine methylation[J]. Nat. Rev.Mol.Cell Biol.， 2005，6（11）：838-849.

[4]Liu C， Lu F， Cui X， et al. Histone methylation in higher plants[J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2010，61：395-420.

[5]Berr A， McCallum E J， Ménard R， et al. Arabidopsis SET DOMAIN GROUP2 is required for H3K4 trimethylation and is crucial for both sporrophyte and gametophyte development[J]. Plant Cell， 2010，22（10）：3232-3248.

[6]Huang Y， Liu C， Shen W H， et al. Phylogenetic analysis and classification of the Brassica rapa SET-domain protein family[J]. BMC Plant Biol.， 2011，11：175.

[7]Lippman Z， Gendrel A V， Black M， et al. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control[J]. Nature， 2004，430 （6998）：471-476.

[8]Turck F， Roudier F， Farrona S， et al. Arabidopsis TFL2/LHP1 specifically associates with genes marked by trimethylation of histone H3 lysine 27[J]. PLoS Genet.，2007，3（6）：e86.

[9]Zhang X， Clarenz O， Cokus S， et al. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27 trimethylation in Arabidopsis[J]. PLoS Biol.，2007，5（5）：e129.

[10]Bernatavichute Y V， Zhang X， Cokus S， et al. Genome-wide association of histone H3 lysine nine methylation with CHG DNA methylation in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS ONE， 2008，3（9）：e3156.

[11]Oh S， Park S， van Nocker S. Genic and global functions for Paf1C in chromatin modification and gene expression in Arabidopsis[J]. PLoS Genet.， 2008，4（8）：e1000077.

[12]Zhang X. The epigenetic landscape of plants[J]. Science， 2008，320（5875）：489-492.

[13]Zhang X Y， Bernatavichute Y V， Cokus S， et al. Genome-wide analysis of mono-， di- and trimethylation of histone H3 lysine 4 in Arabidopsis thaliana[J]. Genome Biol.， 2009， 10：R62.

[14]Charron J B， He H， Elling A A， et al. Dynamic landscapes of four histone modifications during deetiolation in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2009， 21（12）：3732-3748.

[15]Jacob Y， Stroud H， LeBlanc C， et al. Regulation of heterochromatic DNA replication by histone H3 lysine 27 methyltransferases[J]. Nature， 2010， 466：987-991.

[16]宋江華，曹家樹. 植物SET蛋白[J]. 細胞生物學雜志， 2007， 29（3）：384-388.

篇4

［關鍵詞］ 乳腺癌；甲基化;NDRG-1基因

［中圖分類號］ R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1671-7562（2008）02-0079-05

The methylation status of CpG island in the promoter

region of NDRG-1 gene in breast cancer

WANG Li-wei1，ZHOU Dong-rui2，FANG Ru-jing2，ZAHNG Ren-min2，LU Zu-hong2，HE Jie1

（1.Department of Pathology,Zhongda Hospital,School of Clinical Medicine,Southeast University,Nanjing 210009,China;2.State Key Laboratory of Bioelectronics,Southeast University,Nanjing 210096,China)

Abstract:Objective To explore the correlations of methylation status in the promoter region of NDRG1 geneto carcinogenesis of breast cancer.Methods Microarray-based methylation analysis was used to detect the methylation status in the promoter region of NDRG1 gene in 33 pairs of breast cancer and corresponding normal tissues.Results The methylation level of CpG island in the promoter region of NDRG1 gene in breast cancer was higher than that in tissues adjacent（t=14.12，P

Key words:breast cancer;methylation;NDRG-1 gene

（Modern Medical Journal,2008,36:79-83）

NDRG-1基因（N-myc downstream regulated gene 1）又稱Drg-1[1](differentiation related gene 1，分化相關基因)、RTP[2]（reducing agents and tunicamycin responsive protein，還原劑和衣霉素敏感蛋白）、Cap43[3](calcium activated protein 43，鈣激活蛋白43)、Rit42[2]（reduced in tumor 42）和PROXY-1[4](protein regulated by OXYen-1，氧調節蛋白)。NDRG-1基因是近年來發現的與細胞分化相關的新基因，作為候選的抑癌基因，具有調控腫瘤細胞分化、抑制腫瘤細胞轉移和生長的功能，并且能夠在誘導分化劑作用下表達增加，NDRG-1基因與多種腫瘤的發生發展相關，如直結腸癌、乳腺癌、肝細胞癌等[5]。有研究表明，NDRG-1基因的表達與乳腺癌的轉移呈負相關，它能抑制腫瘤細胞增殖、降低其侵襲能力，可作為一個候選的腫瘤抑制基因，并有望成為乳腺癌基因治療新的候選基因[6]。目前更傾向于NDRG-1基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中表達下調，但仍需進一步研究得以證明。對于NDRG-1基因的可能調控機制主要有：DNA甲基化,PPARγ/ RXR 轉錄因子途徑,Ca離子通道途徑等。本實驗采用雙色熒光雜交微陣列基因芯片技術[7]對NDRG-1基因啟動子區甲基化狀態進行研究，探討NDRG-1基因在乳腺癌和癌旁組織中甲基化程度是否存在差異，并進行定量檢測，對NDRG-1基因的甲基化模式和程度進行研究。

1 材料與方法

1.1樣本來源

收集東南大學附屬中大醫院2004年1月―2007年12月外科手術切除的乳腺癌標本33例，其中乳腺浸潤性導管癌29例，乳腺導管內癌1例，乳腺導管原位癌1例，乳腺導管狀癌合并黏液癌1例，乳腺黏液癌1例。組織學分級Ⅰ級14例，Ⅱ～Ⅲ級19例。33例乳腺癌患者均為女性，平均年齡52.3歲（39~81歲），采集腫瘤組織及其相應的腫瘤旁正常乳腺組織，-80℃保存。患者術前均未行化療和放療，所有標本均經病理學檢查確診。

1.2DNA提取

采用蛋白酶K及酚氯仿法抽提組織基因組DNA，正常對照標本取自健康正常人外周血作為未甲基化基因對照（陰性對照），正常健康人血細胞經過甲基轉移酶M.SssI（New England Biolabs）作用，作為甲基化基因對照（陽性對照）,-20℃保存。

1.3亞硫酸氫鹽處理

參照文獻[7-9]，取1~2μg基因組DNA，加入5.5μl3mol•L-1NaOH，加水至55μl，42℃水浴變性30min，再加入520μl 新鮮配制的40.5%亞硫酸氫鈉sodium bisulfite（pH=5）和30μl 0.5mmol•L-1的對苯二酚，混合充分后離心，再加入200μl石蠟油封層，50℃水浴16~18h。移去石蠟油，用Wizard DNA Clean-Up System（Promega Corporation）純化DNA。純化的DNA加入NaOH，使終濃度為0.3mol•L-1，室溫放置5~10min。加入1/10體積的3mol•L-1乙酸鈉和2.5體積的乙醇，-20℃沉淀5h，然后4℃下12000r•min-1離心30min。室溫干燥后50μl滅菌雙蒸水重新溶解DNA，-20℃保存。

1.4PCR擴增

為了能同時擴增甲基化和非甲基化DNA，設計的引物中不含有CpG位點。前引物PF-5′-GGTTTA GGGTGTGTTATAGTGTAATA-3′,后引物PR-5′-CCTA ACTCCAACCAACTCAAAAA-3′（擴增基因序列Genebank no：NC_000008.9，前引物位置為781-806，后引物位置為933-957）。PCR反應體系50μl，其中含10×buffer3μl，Mg2+1.8mmol•L-1，dNTPs200μmol•L-1，每條引物各1μl，模板DNA2μl，Taq DNA聚合酶2U。PTC-225 熱循環儀（MJ Research）上進行PCR擴增：95℃預變性5min，然后95℃變性50s，59℃復性45s，72℃延伸45s，共35個循環，最后72℃再延伸5min。取 5μlPCR反應產物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，Syngene公司凝膠成像系統下觀察并記錄圖像。采用DNA純化試劑盒（TAKARA）對PCR產物進行純化，純化后的DNA進行芯片點樣。

1.5陰性陽性樣本克隆與測序

正常人血液DNA擴增的陰性PCR產物和經過M.SssI處理DNA擴增陽性PCR產物割膠純化（TAKARA），克隆到pMD18-T載體（TAKARA）中（根據pMD18-T載體說明書操作），分別挑取2個陰性和陽性克隆并測序（由上海英駿生物技術有限公司完成），測序正確的克隆提取質粒并保存于-20℃待用。

1.6 探針及丙烯酰胺標記引物合成

寡核苷酸探針由上海英駿生物技術有限公司合成并標記，PM1-3#是與甲基化的位點完全匹配的探針，標記為cy5；PU1-3#是與未甲基化的位點完全匹配的探針，標記為cy3。NDRG-1-P-L#是丙烯酰胺標記引物，由上海超世生物公司合成并標記，標記為Acrydite。見表1。

表1 探針與PCR擴增未經亞硫酸氫鈉處理的原序列

1.7 芯片制備

將純化后的PCR產物與丙烯酰胺、10％過硫酸胺和甘油等按照比例混合后，吸取20μl樣本點至一塊384孔板（AxyGen），準備機點或者手點。機點采用點樣儀（CapitalBio SmartArrayerTM-48）將準備好的PCR產物點于處理好的玻片上，兩個點圓心之間的距離為300~500μm。

1.8 雜交

取等量PM1-3#和PU1-3#混合，使得每種探針濃度為1pmol•L-1，再與雜交液（Telechem）1∶3混合。取25μl探針溶液均勻覆蓋于玻片上面，加蓋經離水處理的蓋玻片，放入濕潤密閉的雜交盒中，45℃、37℃各雜交1h。取出玻片，用70%甲酰胺70℃變性15min，變性電泳1h，在室溫下用滅菌雙蒸水反復清洗后氮氣吹干玻片。

1.9 圖像掃描與數據處理

雜交清洗后的玻片采用雙色共聚焦掃描儀[CapitalBio LuxScanTM-10K（A），中國博奧]掃描，分別記錄cy3和cy5濾片掃描的圖像，采用Genepix Pro 3.0分析結果，記錄每個點的熒光強度，最后將記錄下來的數據用Microsoft Office Excel 2003統計并制表。統計分析用SPSS13.0軟件，采用t檢驗，P

2 結 果

2.1 陽性克隆與陰性克隆測序結果

經過亞硫酸氫鈉處理及PCR擴增序列中所有非CpG位點的胞嘧啶C均轉變為胸腺嘧啶T，而引物區及非引物區的CpG位點均呈甲基化狀態，胞嘧啶C保持不變。見圖1。

A 純陰性克隆模板反向測序結果

B 純陽性克隆模板正向測序結果

圖1 陽性與陰性樣本克隆后測序結果

2.2 定量分析

陽性PCR產物和陰性PCR產物分別以陽性克隆和陰性克隆為模板進行PCR擴增，擴增出來的PCR產物經過樣純化后參比使用，每個混合物樣本的DNA總濃度是一致的，而陽性PCR產物分別占0%，33.3%，50%，66.6%，100%，而陰性PCR產物分別占100%，66.6%，50%，33.3%，0%,掃描結果見圖2。每樣重復5次，雜交反應后分別用cy5標記和cy3標記掃描頭掃描，計算雙色熒光強度定量平均值，并以熒光強度為縱坐標，以混合物中陽性產物百分率為橫坐標作圖，可見cy5隨著陽性片斷濃度的增大而信號增強，cy3則隨著陰性片斷濃度的增大而信號增強（圖3）。以cy5/（cy5+cy3）比值為縱坐標，混合物陽性產物百分率為橫坐標作圖，可得檢測DNA甲基化水平的劑量反應曲線，可根據該曲線計算樣本的甲基化水平，見圖4。

從左至右陽性PCR產物分別為0%、33.3%、50%、66.6%、100%圖2 陽性和陰性PCR產物參比后微陣列芯片掃描結果

圖3 陽性和陰性PCR產物參比后微陣列芯片掃描熒光強度值對比圖

圖4 陽性和陰性PCR產物參比后微陣列芯片掃描cy5/（cy5+cy3）對比圖

2.3 甲基化水平測定標準曲線建立

將上述數據做一定量曲線，定量曲線的橫坐標為甲基化水平，縱坐標為cy5/（cy5+cy3）的比值，通過回歸分析發現數據呈現較好的線性關系，決定系數為0.9485。見圖5。

圖5 甲基化水平定量分析標準曲線

2.4 樣本甲基化水平測定

用雙色熒光雜交基因芯片檢測33對乳腺癌及癌旁組織樣本，在一張芯片上點上一個陽性樣本和一個陰性樣本作為對照，每個樣本重復5~8次。樣本雜交結果見圖6。腫瘤樣本的熒光呈偏黃色，而對應的癌旁組織樣本則呈綠色，表明癌旁的cy3的熒光強度更大，腫瘤樣本的cy5熒光強度更大。根據樣本芯片雜交熒光結果，計算cy5/(cy3+cy5)的比值，腫瘤樣本cy5/(cy3+cy5)的比值均值為0.3041，而對應的癌旁組織樣本的cy5/(cy3+cy5)的比值均值為0.1261。由甲基化水平定量分析標準曲線可得到相應的甲基化率，腫瘤樣本組織中該檢測CpG位點甲基化率為40.76%，而對應的癌旁樣本組織中該檢測CpG位點甲基化率為22.41%，差異有統計學意義（t=14.12，P

圖6 乳腺癌標本和癌旁組織標本PCR產物微陣列芯片熒光結果圖

3 討 論

DNA甲基化與腫瘤的發生有著密切關系，它作為表觀遺傳學的一種調控機制是最早被人們發現的。腫瘤可發生許多種基因的異常甲基化，包括抑癌基因、DNA損傷修復基因及與腫瘤代謝和浸潤相關的基因。DNA高甲基化，不僅可以直接或間接影響基因轉錄，也可導致CT突變；引起基因表達異常，導致細胞惡變，最終形成腫瘤[10-12]。

甲基化狀態的改變可以導致基因結構和功能的異常，進而導致細胞發生癌變，最重要的甲基化堿基是胞嘧啶，通常發生在啟動子區CpG島區域。CpG島甲基化可以抑制啟動子序列的基因表達，DNA甲基化水平與腫瘤的生物學特性密切相關[13]。

Bandyopadhyay等[14]研究發現,在乳腺癌細胞中NDRG-1基因蛋白表達顯著降低，特別是在存在淋巴結轉移或者骨轉移患者的乳腺癌細胞中，該基因蛋白表達明顯比非轉移乳腺癌細胞低。Wang等[6]的研究結果提示,NDRG-1基因的表達與乳腺癌的轉移呈負相關，該基因可能成為早期預測乳腺癌轉移的分子生物學標記物之一，可作為一個候選的腫瘤抑制基因，有望成為乳腺癌基因治療新的候選基因。Kalaydjieva等[8]發現NDRG-1基因 5′端含有一個CpG島，說明該基因的表達調控可能與DNA甲基化有關；Guan等[15]也發現DNA甲基化可能是該基因的調控途徑之一；Bandyopadhyay等[14]用DNA甲基化抑制劑5′-氮雜2′-脫氧胞核苷（5-Azacytidine)作用于多種乳腺癌細胞株，發現可以明顯增加該基因的表達，進一步說明該基因的低表達可能受DNA甲基化調控。

對于NDRG-1基因的啟動子區甲基化狀態研究，國內外尚無研究報道。本實驗利用雙色熒光雜交微陣列基因芯片技術對NDRG-1基因啟動子區甲基化水平進行定量檢測，發現CpG位點腫瘤組織和對應癌旁組織的甲基化率分別為40.76%和22.41%，差異有統計學意義。因此可以推測甲基化調控機制可能是NDRG-1基因的重要調控途徑之一，從而與乳腺癌的發生相關。

[參考文獻]

[1]van Belzen N,Dinjens W N,Diesveld M P,et al.A novel gene which is up-regulated during colon epithelial cell differentiation and down-regulated in colorectal neoplasms [J].Lab Invest,1997，77(1):85-92.

[2]Kurdistani S K,Arizti P,Reimer C L,et al.Inhibition of tumor cell growth by RTP/ rit42 and its responsiveness to p53 and DNA damage [J].Cancer Res,1998，58(19):4439-4444.

[3]Zhou D,Salnikow K,Costa M.Cap43,a novel gene specifically induced by Ni2+ compounds [J].Cancer Res,1998，58(10):2182-2189.

[4]Park H,Adams M A,Lachat P,et al.Hypoxia induces the expression of a 43-kDa protein(PROXY-1)in normal and m alignant cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2000，276(1)：321-328.

[5]Shimono A,Okuda T,Kondoh H.N-myc-dependent repression of ndr1,a gene identified by direct subtraction of whole mouse embryo cDNAs between wild type and N-myc mutant [J].Mech Dev,1999，83(1-2):39-52.

[6]Wang Z,Liu Q,Chen Q,et al.Overexpression of NDRG1:relationship with proliferative activity and invasiveness of breast cancer cell line and breast cancer meta stasis [J].Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi,2006，35(6):333-338.

[7]Zhou D,Qiao W,Wan Y,et al.Microarray-based methylation analysis using dual-color fluorescence hybridization[J].J Biochem Biophys Methods,2006,66(1-3):33-43.

[8]Frommer M,McDonald L E,Millar D S,et al.A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1992,89(5):1827-1831.

[9]Clark S J,Harrison J,Paul C L,et al.High sensitivity mapping of methylated cytosines[J].Nucleic Acids Res,1994,22(15):2990-2997.

[10]Ushijima T.Detection and interpretation of altered methylation patternsin cancer cells[J].Nat Rev Cancer,2005,5(3):223-231.

[11]Goffin J,Eisenhauer E．DNA methyltransferase inhibitors-state of the art[J].Ann Oncol,2002,13(11):1699-1716.

[12]Verma M.Viral genes and methylation[J].Ann N Y Acad Sci,2003,983:170-180.

[13]Esteller M,Hamilton S R,Burger P C,et al Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia [J].Cancer Research,1999，59(4):793-797.

[14]Bandyopadhyay S,Pai S K,Hirota S,et al.Role of the putative tumor metastasis suppressor gene Drg-1 in breast cancer progression [J].Oncogene,2004,23(33):5675-5681.

[15]Guan R J,Ford H L,Fu Y,et al.Drg-1 as a differentiation-related,putative metastatic suppressor gene in human colon cancer [J].Cancer Res,2000,60(3):749-755.

篇5

【關鍵詞】 鼻咽癌;放射治療;腫瘤干細胞

鼻咽癌是我國南方地區常見惡性腫瘤之一，以放射治療為主，但療效尚不理想，約55%的NPC在放療后5年出現復發轉移。其原因主要與NPC發病部位隱蔽、鼻咽部組織構成復雜，治療方式較單一，且不同的NPC患者在病理類型、腫瘤分化程度、就診時病變嚴重程度、臨床表現、體質狀況、對放化療敏感性方面都存在著不同程度的差異有關。本文對影響NPC放療敏感性的機制綜述如下。

1 DNA損傷修復與NPC放療后復發

1.1 DNA修復基因 放射可引起DNA鏈斷裂和DNA-蛋白交聯，最終導致細胞死亡。DNA的修復能力是影響細胞存活和死亡的原因之一。

hMSH2是被研究最多的錯配修復系統基因之一。hMSH2蛋白參與組成hMutSα和hMutSβ二聚體，識別DNA復制中的錯配堿基及插入缺失環，并與之結合，是完成DNA修復必需的組件之一[1，2]。范凱[3]等報道放射可以誘導鼻咽癌細胞hMSH2表達;hMSH2對放射造成的DNA損傷可能有修復作用。

MGMT基因主要修復由烷化劑等誘變劑造成的DNA損傷。DNA鏈的斷裂是誘導MGMT表達的最終信號，電離和紫外線輻射可以誘導MGMT的表達。人類和鼠肝細胞以及肺、腎等組織在接受電離輻射后MGMT表達及酶活性增強，MGMT的這種改變發生在基因轉錄水平，并且與其啟動子的激活有關。劉敏等[4]認為X射線照射可能誘導CNE細胞株MGMT基因的表達，參與細胞照射后DNA損傷修復過程。

DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)是哺乳動物細胞經照射后，參與DNA雙鏈斷裂(DSB)損傷修復主要的分子途徑之一，是由Ku70、Ku80以及DNA-PKcs(DNA-PK的催化亞基)三亞基組成，其中Ku70、Ku80組成Ku蛋白調節亞基，在DSB修復中起著辨認、結合和排列DNA末端并招募催化亞基DNA-PKcs的作用。曲頌等[5]認為DNA-PKcs是決定鼻咽癌DNA-PK功能比較重要的亞基，其催化功能在射線照射后引起的DSB修復中發揮著較為重要的作用，調控著DNA-PK的活性，DNA-PKcs基因的表達與鼻咽癌細胞的放射敏感性有關。另有研究表明[6，7]，不同放射敏感性的細胞株CNE1(敏感性低)、CNE2(敏感性高)中Ku70、Ku80、DNA-PKcs的表達水平無明顯差異，而在射線照射后三者的表達水平卻明顯升高，這表明Ku70、Ku80、DNA-PKcs在鼻咽癌的放射敏感性中起著重要的作用。

1.2 熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs) HSPs是一組具有重要生理功能的糖蛋白質，在體內可與多種蛋白形成復合體，參與蛋白質的折疊與伸展、多聚復合體的組裝，發揮調節靶蛋白的作用，但又不改變靶蛋白的結構，又稱為“分子伴侶”。根據其同源程度及分子量大小分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP等幾個家族。HSP90、1HSP70在許多腫瘤中有表達。在放射適應性反應中，由蛋白質組成的DNA修復系統起著主要作用。近年研究發現HSPA8 heat shock 70kDa protein 8)與放射適應性反應關系密切。馮雪萍等[8]報道HSP90β和HSPA8 參與了細胞照射后DNA修復系統的構建，與放射耐受有一定的相關性，并推測HSPs可能與CNE1細胞株放射相對耐受有關。

gp96是存在于真核生物細胞內質網中的分子量約為96kD的熱休克蛋白，屬于HSP90家族。有研究表明[9]，基于gp96的免疫治療可以提高放射治療的功效。Chang等[10]實驗發現用RNA干擾鼻咽癌放射抵抗細胞gp96基因的表達，能夠使瘤細胞克隆形成能力減弱。據報道[11，12]，HSP90調節Akt激酶活性并且參與放射后DNA損傷修復。gp96作為HSP90家族成員之一，是否也通過影響Akt來發揮細胞保護作用和增強細胞生存能力，其機制還有待于進一步研究。

2 瘤細胞凋亡調節與NPC放療后復發

2.1 p53基因 p53是一種凋亡抑制基因，在細胞周期的調控和誘導細胞凋亡中起重要作用。其編碼蛋白可分為野生型蛋白(wtp53)和突變型蛋白(mtp53)。wtp53是體內重要的抑癌基因，它通過調節細胞周期和誘導細胞凋亡而發揮其抑癌的功能。當細胞發生DNA損傷時，wtp53蛋白的表達會急劇升高，導致細胞周期停滯在G1期來進行修復，使細胞恢復正常狀態，重新進入細胞周期。若損傷無法修復，它可激活與DNA凋亡相關基因如bcl-1/bax、TNF-α、Fas等，啟動細胞凋亡機制，使有癌變傾向的細胞失去活性從而起到抑癌的作用。多數學者認為由于mtp53干擾DNA受損細胞的G1期抑制，使其很快進入S期，另外增加了DNA修復酶的活性、提高DNA修復能力，因而抗拒放射線。

在NPC中，60%以上的NPC組織和幾乎100%的NPC細胞株有p53蛋白過表達。p53蛋白過表達及其功能失活可能與一些EB病毒基因產物與wtp53蛋白穩定結合，使p53蛋白半衰期延長有關。葉偉軍等[13]研究發現NPC中p53表達高者放射敏感性差。而石慧英等[14]研究結果表明NPC細胞中過表達的p53蛋白具有生物學功能，在放射誘導的NPC細胞損傷和凋亡中發揮重要作用，臨床NPC病人對放療抗拒可能與p53蛋白過表達無關。Agaoglu等[15]對97例NPC患者行免疫組織化學p53檢測，發現p53表達與分期、總生存率、無病生存率無關。

2.2 bcl2基因 bcl2基因是目前發現的抗凋亡作用最強的基因之一，它通過抑制細胞凋亡而延長細胞存活。一般認為bcl2蛋白可能是作為抗氧化劑起作用，通過調整Ca2+轉運而調節凋亡。大量研究表明，bcl-2蛋白的高表達會抑制放療誘導的腫瘤細胞凋亡，而抑制bcl-2基因的表達可能會增加放射敏感性。Jayasurya[16]等認為bcl-2高表達與NPC放療后局部復發存在相關性。Yu等[17]研究表明Bcl-2蛋白的高表達可以阻止放療引起的細胞凋亡，降低鼻咽癌細胞對放療的敏感性。張文玲等[18]利用免疫組化、原位雜交檢測發現，Bcl-2在NPC放療敏感組和放療不敏感組比較有統計學差異，提示bcl-2參與了NPC的放療耐受。而蘇珊[19]等認為bcl-2可能未參與放射引起的NPC細胞株CNE-1及CNE-2的凋亡過程。

2.3 MDR1基因多態性，STR基因多態性 P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多藥耐藥基因(MDR1)編碼的一種轉運蛋白。P-gp可以穩定腫瘤細胞線粒體膜電位和線粒體膜通透性，抑制X射線的凋亡效應，從而遞呈放射抵抗表型。迄今已發現MDR1基因有多個單核苷酸多態性，其中有21外顯子G2677T(Ala893Ser)和26外顯子C3435T(Ile1145Ile)及其單體型，可能與MDR1和P-gp的功能和表達密切相關。王等[20]發現MDR1G2677T和C3435T多態性可能是NPC放療療效的影響因素之一。

STR基因座由長度為1～6個堿基對的短串聯重復序列組成[21]。這些重復序列廣泛分布于人類基因組中并呈現高度多態性。串聯重復序列可能影響染色質結構、基因活性的調控、DNA復制重組、細胞分裂周期及錯配修復系統等。王旭丹等[22]研究表明，不同輻射抗拒鼻咽癌細胞株CNE-2和CNE-2R細胞的STR基因座表達存在量和質的差異，變異的STR基因座可能參與鼻咽癌細胞CNE-2輻射抗拒的誘導。至于這些串聯重復序列如何影響NPC細胞輻射抗拒的確切機制有待進一步探討。

2.4 放療群集耐受性(multicellular resistance) 研究表明，實體瘤的放療敏感性與單層培養的腫瘤細胞顯著不同;在三維培養時，腫瘤細胞對細胞毒藥物和放射線等治療的耐受性比單層細胞明顯增強，而與在體腫瘤相近，即群集耐受性。

整合素是重要的細胞黏附分子，介導細胞與細胞以及細胞與細胞外基質的黏附作用。αV整合素是腫瘤細胞形成三維結構的重要分子，抑制αV整合素的作用影響多細胞球(MCSs)的形成過程。欒巍等[23]研究表明，NPC中，較之單層細胞，MCSs的放射敏感性顯著下降;2Gy的X射線照射后MCSs凋亡率上調亦不明顯，體現了MCSs的群集耐受性。腫瘤多細胞球廣泛而緊密的黏附是群集耐受的基礎。實驗中用單克隆抗體預先阻斷αV整合素的作用后再照射，則MCSs的細胞存活率下降，放射敏感性提高，凋亡率也明顯上調。欒巍等[24]用CNE-2Z多細胞球模擬實體瘤實驗表明，SAPK/JNK信號通路短暫激活可能傳遞生存信號而在鼻咽癌放療群集耐受中發揮作用，特異性阻斷其信號傳遞上調MCSs凋亡率，這可能與促進caspase3蛋白表達有關。

3 腫瘤干細胞與NPC放療后復發

TSC是一類具有永生或無限自我更新能力的細胞，它們的數目相對恒定，有強的遷徙、浸潤和轉移能力;具有多分化潛能，能分化為不同表型的腫瘤細胞;在發育期間能夠通過對稱性分裂以擴增數量，或者通過非對稱性分裂進行自我更新和產生更多不同分化類型的祖細胞;這些細胞具有治療抵抗特性，能夠耐受傳統的細胞毒化療和放射治療。許多學者認為，腫瘤復發、轉移以及對治療的耐受等均與TSC相關。

2007年，Wang等[25]從5個鼻咽癌細胞系CNE-1，CNE-2，SUNE-1，HONE-1，和C-666-1中分離出了具有干細胞表型特征的腫瘤細胞(SP細胞)，并且檢測了從CNE-2細胞系中分離出的SP細胞的干細胞特性，結果表明SP細胞具有強的分裂增值能力、自我更新能力及分化潛能，并且具有對放療和化療的抵抗性。通過將SP細胞植入非肥胖型糖尿病重癥聯合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)體內，他們觀察到SP細胞具有很強的成瘤能力。Wang等還發現SP細胞高表達角蛋白19，這很可能成為進一步研究鼻咽癌腫瘤干細胞的有用的分子標志。

腫瘤干細胞放射抗拒的機制可能與損傷DNA的修復，影響細胞周期調控、細胞凋亡、增殖等信號轉導通路改變有關。Bao等[26]通過多種放射損傷標記例如DNA損傷修復、腫瘤細胞凋亡、γH2AX焦點形成等檢測放射線處理后的變化，從而驗證CD133+腫瘤干細胞表現出顯著的放射抗拒。并且他們還發現膠質瘤干細胞在接受放射線處理后，有效激活了放射引起的DNA損傷信號通路，使得相關通路蛋白—ATM，Rad17，Chk1和Chk2磷酸化，通過給予檢查點(Chk1和Chk2)激酶的特異性抑制劑能夠逆轉腫瘤干細胞放射抗拒。他們推斷膠質瘤干細胞能夠通過優先激活DNA損傷的應答，誘導細胞循環阻滯進而修復損傷的DNA，從而提高放射抗拒。神經腫瘤干細胞與正常神經干細胞有相類似的信號轉導途徑，如Wnt途徑、Notch途徑、Shh途徑等[27]。這些信號轉導途徑在一些其他腫瘤干細胞中可以調節其放射敏感性。Chen等[28]在乳腺癌細胞中驗證Wnt/β-catenin信號轉導通路能夠調節乳腺癌干細胞放射敏感性。Phillips等[29]研究了電離輻射是否直接干擾Notch-1信號通路，發現分次放射線處理激活Notch-1信號通路，將會引起乳腺癌干細胞的增加，引起放療抗拒。Wang等[25]發現Shh信號轉導通路能夠調節鼻咽癌干細胞樣細胞放射敏感性，經環王巴明(Cyclopamien)處理封閉該信號轉導通路能夠提高鼻咽癌干細胞樣細胞放射敏感性。此外，腫瘤干細胞的放射敏感性除與其內在敏感性密切相關以外，其活體微環境也很可能正向或者負向調節其特性。

4 結 語

NPC放療后復發涉及了多個基因的共同參與，它們之間的相互作用是NPC放療后復發的基礎。NPC放療后復發的機制仍不清楚。隨著基因組學和蛋白質組學方法的不斷完善，建立惡性腫瘤發生和發展過程中基因表達譜和蛋白質表達譜，將使篩選出NPC放療后復的相關分子成為可能。

NPC腫瘤干細胞研究對于探索NPC的發病機制、復發轉移機制、判斷預后以及探索新的治療方法具有重要意義。針對腫瘤干細胞的治療有望從根本上治療腫瘤。通過調控腫瘤干細胞內重要基因表達而使其失去干細胞特性，研究腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞蛋白或基因表達的差異、信號轉導通路的差異、表面標志的差異，選擇性地對這些細胞進行干預，可為NPC的治療開辟新的途徑。NPC腫瘤干細胞研究還處于起步階段，這些細胞數量少，且其信號轉導通路及表面標志與正常成體干細胞有較多的共性，缺乏特異標志進行區分。這些都為選擇性殺滅腫瘤干細胞提出難題。這些細胞保持長期自我更新的機制、對稱分裂及非對稱分裂方式的調控機制均有待進一步研究。

參考文獻

[1] Schofield MJ，Hsieh P.DNA mismatch repair:molecular mechanisms and biological function[J].Annu Rev Microbiol，2003，57:579～608.

[2] BIGNAMI M，CASORELLI I，KARRAN P.Mismatch repair and response to DNA-damaging antitumour t-herapies[J].EurJ Cancer，2003，39(15):2142～2149.

[3] 范 凱，王 輝，于志紅，等.X線照射對鼻咽癌細胞hMSH2和hMLH表達的影響[J].腫瘤，2006，26 (2):120～122.

[4] 劉 敏，范 凱，王 彥，等.X射線照射后鼻咽癌細胞株DNA修復基因MGMT表達的變化[J].中國老年學雜志，2007，27(10):920～921.

[5] 曲 頌，朱小東，黎丹戎，等.DNA-PKcs 表達與鼻咽癌細胞株放射敏感性的關系[J].腫瘤防治研究，2007，3(4)：237～240.

[6] Zhong PP，He YX，Xia YF，et al.Expression and subcellular localization of DNA-PK in nasopharygeal carcinoma cell lines CNE1 and CNE2 with different radiosensitivity [J].Chinese Journal of Cancer Research，2006，18(2):77～82.

[7] He YX，Zhong PP，Yan SS，et a1.DNA-dependent protein kinase activity and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE1/CNE2[J].Acta Physiologica Sinica，2007，59(4):524～533.

[8] 馮雪萍，陳主初，肖志強，等.放療誘導鼻咽癌細胞株CNE1熱休克蛋白高表達[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2005，11(2):81～84.

[9] Lin S，Wang H，Yang Z，et al.Enahncement of cancer radiation therapy by use of adenovirus-mediated secretable glucose-regulated protein 94/gp96 expression[J].Cancer Res 2005，65(20):9126～9131.

[10]Joseph Tung-Chieh Chang，Shih-Hsuan ChanChien-Yu Lin，et al.Differentially expressed genes in radioresistant nasopharyngeal cancer cells:gp96 and GDF15[J].Molecular Cancer Therapeutics，2007;6(8):2271～2279.

[11]Sato S，Fujita N，Tsuruo T.Modulation of Akt kinase activity by binding to Hsp90[J].Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(20):10832～10837.

[12]Dote H，Burgan WE，Camphausen K，et al.Inhibition of Hsp90 compromises the DNA damage response to radiation[J].Cancer Res，2006;66(18):9211～9220.

[13]葉偉軍，閔華慶，曹新平，等.P53蛋白、血管內皮生長因子等生物分子指標與鼻咽癌放射敏感性的關系[J].癌癥，2006，25(9):1168～1172.

[14]石慧英，孫 懿，易 紅，等.p53沉默對人鼻咽癌細胞株CNE2放射生物學特性的影響[J].國際病理科學與臨床雜志，2008，28(2):97～102.

[15]Agaoglu F Y，Dizdar Y，Dogan O，et al.P53 overexpression in nasopharyngeal carcinoma [J].In Vivo，2004，18(5):555～560.

[16]Jayasurya A，Dheen ST，Yap WM，et al.Inducible nitric oxide synthase and bcl-2 expression in nasopharyngeal cancer:correlation with outcome of patients after radiotherapy[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2003，56(3):837～845.

[17]Yu Y，Dong W，Li X，et al.Significance of c-Myc and Bcl-2 protein expression in nasopharyngeal carcinoma[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2003，129(12):1322～1326.

[18]張文玲，周艷宏，肖 嵐，等.鼻咽癌分子標志物研究[J].生物化學與生物物理進展，2008，35(1):7～13.

[19]蘇 珊，郭琳瑯，張 健，等.鼻咽癌細胞放射敏感性與Bcl-2及Bak表達的關系[J].實用醫學雜志，2007，23(8):1113～1115.

[20]王志遠，陳龍華，范 欽，等.鼻咽癌放射敏感性與MDR1基因多態性的關系[J].南方醫科大學學報，2007，27(5):580～583.

[21]徐 林，李松峰，鄧瓊英，等.廣西毛南族群體15個短串連重復序列基因座的遺傳多態性[J].中華醫學遺傳學雜志，2007，24(1):97～100.

[22]王旭丹，曲昌菊，楊惠玲，等.相同遺傳背景鼻咽癌細胞株輻射抗拒與STR基因座相關性的研究[J].國際內科學雜志，2008，35(2):71～73.

[23]欒 巍，黃海輝，梁后杰.αV整合素在鼻咽癌放療群集耐受中的作用[J].中華腫瘤防治雜志，2006，13(18):1380～1383.

[24]欒 巍，黃海輝，梁后杰.SAPK/JNK信號通路在鼻咽癌放療群集耐受中的作用研究[J].第三軍醫大學學報，2006，28(21):2177～2179.

[25]Wang J，Guo LP，Chen LZ，et al.Identification of cancer stem cell-like sidepopulation cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J].Cancer Res，2007，67(8):3716～3724.

[26]Bao S，Wu Q，McLendon RE，et al.Glioma stem cellspromote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature 2006，444(7120):756～760.

[27]Vescovi AL，Galli R，Reynolds BA.Brain tumour stem cells[J].Nat Rev Cancer，2006，6(6):425～436.