轉座子的遺傳學效應范文

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篇1

[關鍵詞]RNAi；dsRNA；siRNA

[中圖分類號]R394[文獻標識碼]A[文章編號]1673-7210（2007）10（b）-007-03

RNAi（RNA interfering，也稱RNA干擾）是利用小雙鏈RNA特異阻斷特定基因的表達，并促使靶mRNA降解，從而使細胞表現出某種特定基因缺失表型的現象。由于RNAi對基因表達的阻斷具有高效、特異性，已迅速發展成為代替基因敲除的遺傳工具。

1 RNAi的分子作用機制

經過眾多學者的研究，現已基本闡明了RNAi的作用機制。在不同生物中RNAi的作用機制各有不同,主要分為兩種：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的長雙鏈RNA的非特異效應和21～23 nt的短雙鏈RNA的特異效應[1]。RNAi的特異效應作用機制是在轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平等多個不同的水平上實現的。其中以siRNA轉錄后水平的RNAi研究最為深入，應用最為廣泛，下文將做主要介紹(圖1)。

1.1 轉錄后水平的RNAi機制

轉錄后水平的RNAi機制是在對線蟲、果蠅等生物體進行研究而進一步推導得出來的。不同研究領域的學者相繼提出了多種RNAi機制的模型，這些模型大致都將RNAi分為兩個階段：起始階段和效應階段。

起始階段包括：①dsRNA的導入：包括由外源導入或由轉基因、轉座子、病毒感染等各種方式引入的dsRNA;②dsRNA在細胞內被一種命名為Dicer的酶切割成21~23 nt長的小分子干擾RN斷（short interfering RNA, siRNA）。

效應階段包括：①在siRNA反義鏈指導下，雙鏈siRNA與一個不同于DICER的RNA酶結合形成沉默復合物RISC。②siRNA雙鏈解旋，正義鏈被釋放出來，RISC被激活。③活化的RISC通過堿基配對識別互補的靶mRNA，siRNA反義鏈與mRNA復合體中換位，并在距siRNA的3'末端12 nt處切割靶mRNA，從而實現了對mRNA的降解。降解位點多為尿嘧啶。

某些學者認為RNAi過程中還具有自身循環放大機制，并將其歸為模型的第三階段――循環放大階段，其機制大致如下：

在效應階段，活化的RISC結合mRNA后，內切核酸酶將mRNA切割成12~23 nt的片段，特異性地抑制了靶基因的表達。同時，釋放出來的siRNA可以作為一種特殊引導物，在RNA依賴的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA為模板合成新的dsRNA，后者又被降解為新的siRNA，進入上述循環，呈放大效應。此過程又稱為隨機降解性多聚酶鏈式反應（PCR）[2]。

1.2翻譯水平的RNAi機制[1]

翻譯水平上的RNAi是抑制相應mRNA的翻譯，使相應的蛋白質表達受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由長度約70 nt的RNA形成的莖環樣前體，經Dicer酶作用后形成長約21～23 nt的dsRNA， 通過RISC結合在相應mRNA的3'末端非翻譯區上,進而阻斷mRNA的翻譯。

1.3轉錄水平上的RNAi機制[1]

該機制是通過siRNA與互補的DNA直接發生作用，激發同源DNA甲基化的加強，使目的基因轉錄受限，表達關閉，進而加強了基因沉默。有報道dsRNA可誘導組蛋白H3及相應DNA區域甲基化。如果甲基化出現在啟動子區域,則轉錄就不能進行,如甲基化出現在編碼區,則轉錄進行,但在轉錄后水平上沉默。

1.4 非特異效應

許多研究表明，當向哺乳動物轉染大于30 nt的長雙鏈RNA（dsRNA）時，由于dsRNA激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途徑[3]，使EIF-2α因子磷酸化，進而非特異性地抑制翻譯，從而使細胞內發生全面的細胞沉默。

1.5 RNAi過程所涉及的主要因子

siRNA：是RNAi作用賴以發生的重要中間效應分子。它是長約21~23 nt的雙鏈RNA小分子，與靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每條單鏈 的3'末端均有2~3個非配對的堿基[4]。

Dicer酶：Dicer酶（在果蠅中發現）是一種RNaseⅢ家族中的一種識別dsRNA的酶，據報道其結構含有1個PAZ結構域，1個氨基螺旋酶結構域，2個RNaseⅢ模體及2個dsRNA結構域。在dsRNA導入后，Dicer酶以ATP依賴的、持續方式連續切割dsRNA。在對dsRNA進行切割時，Dicer以二聚體形式參與，每個二聚體包括4個活性中心，在降解RNA時其中的2個要失活,從而使降解過程每隔一定間隔進行,這個間隔正好為22個核苷酸,即每隔22個核苷酸Dicer酶將dsRNA降解一次。而Dicer酶結構上的微小改變將會引起間隔的改變,所以不同的物種產生的siRNA長度也略有不同[1]。

RdRP：許多實驗證明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前僅知其主要是在單鏈siRNA指導下擴增RNA而加速RNA的過程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低濃度下高效快速地進行。

ATP[5]：ATP在siRNA介導中起重要作用，dsRNA被降解為siRNA的過程需要ATP；siRNA解旋，反義鏈與RISC前體結合形成RISC的過程也依賴ATP。研究還發現，RNAi過程中外源性ATP不能起促進作用。

2 RNAi的特征

高穩定性：以3'末端突出的TT堿基的dsRNA尤為穩定，無需象反義核酸那樣進行進行廣泛的化學修飾以提高半衰期[6]。

高效率：在低于反義核酸幾個數量級的濃度下，就能使目標基因的表達降到極低水平甚至完全抑制，從而產生缺失突變體表型[7]。

高特異性：siRNA除正義鏈3'末端突出的2個堿基在序列識別中不起主要作用外，其他單個堿基的改變均可能使RNAi效應大大減弱。而針對同源基因共有序列的RNAi則導致同源基因共同失活[5]。

高傳遞性：RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持，在某些生物中RNAi還可以傳遞到后代中去。

3 RNAi應用過程需要解決的幾個問題

避免非特異性效應：前述已闡明，在哺乳動物中，當大于30 nt的dsRNA被導入時，可激活PKR途徑而導致非特異性抑制。這就要求在設計dsRNA時必須考慮該dsRNA導入時能否避免非特異性效應的出現。多數實驗表明，以21~23 nt為最佳選擇。

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干涉dsRN段的獲取和導入：在實際應用中，siRNA的長度、結構、組成及其觸發的效果基因、種屬、序列、細胞類型、甚至實驗體系的不同而有變異。目前，siRNA的獲取大多數仍舊是生化合成，其設計仍處于試驗階段，能否成功地設計出合理實用的siRNA對其能否廣泛應用起決定性作用。對RNAi效應的調控：目前對RNAi的研究還限于以雙鏈干涉片段抑制特定基因的表達，對其調控的干涉較少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潛在靶位、活性片段濃度等都是RNAi有效性發揮的影響因素。Yang等還證實RNAi現象可被過剩的不相關的dsRNA競爭性抑制，深入的研究表明，甚至過剩的正義鏈與反義鏈也可競爭性抑制RNAi效應。

4 RNAi的應用及前景

4.1遺傳學研究的應用

4.1.1 穩定轉座子RNAi缺陷可引起內源性轉座子的移動。轉座子的重要特征之一是具有反向重復序列，生物體通過此序列可以產生dsRNA發夾，啟動PTGS效應，所以抑制轉座子的移動有利于遺傳穩定，防止遺傳損害。因此人們認為RNAi的一個自然功能就是轉座子沉默[8]。

4.1.2 基因功能分析人類基因組計劃中的基因測序已經完成，人類將進入后基因組時代。其主要任務是確定基因的功能，因此迫切需要建立有效、經濟的分析基因的技術。

盡管目前對RNAi機制并未完全弄清，但其高效、特異阻斷基因的表達已在某些研究中開展。RNAi克服了傳統基因功能分析技術要求高，過程繁等缺點，已吸引了越來越多學者的重視。可以預見，RNAi將成為新一代基因組功能研究的有力工具。

4.2 臨床應用

4.2.1 抗病毒David等認為在動物中RNAi代表一種古老的抗病毒反應，與植物的PTGS（轉錄后的基因沉默）一樣可抵抗病毒的感染，目前這一觀點已被普遍認可。

目前，利用體外培養人類細胞研究抗病毒感染，主要限于單鏈 RNA病毒，包括人類免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰質炎病毒等。Novina[9]等用針對CD4的siRNA轉染Magi-CCR5細胞，產生了對CD4受體表達特異性抑制達75%，Northern雜交發現CD4分子的mRNA明顯降低了8倍，從而阻斷了HIV-1病毒細胞。Kapadie等[10]用針對HCV的siRNA與表達HCV的質粒共轉染人的肝癌細胞株Huh-7細胞，2 d后，Northern雜交檢測顯示：HCV的RNA含量下降，證明了HCV特異的siRNA抑制了病毒的復制[9]。

RNAi在針對其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰質炎病毒，豬瘟病毒等均顯示出抑制病毒復制的作用。最近有文獻報道RNAi在研制抗SARS藥物中顯示出特殊的作用。

從當前的這些研究結果可以看出，siRNA通過序列特異性干擾作用，能封閉病毒基因在體內的復制，RNAi成為控制病毒在細胞內復制的重要工具，為病毒治療提供了新的思路。

4.2.2 抗腫瘤利用RNAi的高效率和高度特異性，我們可以設計特異siRNA分子，沉默目標基因，而正常基因不受影響。這是用RNAi抗腫瘤的基本思路。從現階段研究的進展看來，RNAi有望成為新一代研究抗腫瘤的重要工具，發揮重要作用。

腫瘤是多因素、多基因的疾病，單個癌基因的抑制難以達到治療效果，用基因敲除等方法進行治療研究就造成了時間和經費的浪費。RNAi技術可同時抑制多個基因，且抑制效果互不干擾，并且RNAi識別可以精確到單個核苷酸，對由野生型突變形成的癌基因，如ras、p53等，能產生準確有效的封閉效果，而野生型不受影響[11]。Wilda等針對bcr/abl基因融合位點設計了一段21 nt長的dsRNA分子，特異性沉默了該融合基因，并使表達該融合基因的細胞凋亡，而對不表達該基因的腫瘤無任何作用。最近，Linsl等把針對bcl2基因的mRNA-cDNA雜交體轉染到人前列腺癌lncap細胞中，產生了長時期的阻抑bcl2表達效應，這一效應與體外培養的前列腺癌細胞中的RNAi非常相似。

5 結語

RNAi的發現改變了人們對細胞基因調控的傳統思路，提供了特異性阻斷基因表達的新工具和評價基因功能的新策略，為人類基因功能研究和疾病基因治療開辟了一條革命性的新領域。盡管其機制仍未完全弄清，但RNAi技術在病毒、腫瘤等尚未根治的疾病提供了新的治療方案，并帶來根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已經日新月異，可以相信，不久的將來，將會出現基于RNAi的基因治療藥物，RNAi技術也將成為未來生命研究的重要工具。

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(收稿日期:2007-08-23)

篇2

[關鍵詞]桔梗；同源四倍體；DNA甲基化；MSAP

[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g?mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g?mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.

[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP

多倍體是指含有3套或3套以上完整染色體組的生物體[1]。由于多倍體將1個或多個整套染色體累加到基因組上，對生物體的基因組產生了一定沖擊，這種“基因組沖擊”使生物體的新陳代謝和基因調控等發生改變，從而使植株的形態器官、生理指標、遺傳特性等產生變異[2-5]，這些變異會增強植株的生態適應性和環境的抗逆性，降低蒸騰作用，提高光合效率等，對植株的生物量和某些次生代謝產物含量及品質有促進作用[6]。因此多倍體植物具有更大的生存潛能和更強的選擇優勢。研究表明，多倍化不僅能導致植物的基因組結構改變、堿基序列消除、轉座子激活等，還能影響表觀遺傳調控模式[7-8]。表觀遺傳變異是指不改變DNA堿基序的一種可遺傳的基因表達變化，包括DNA甲基化修飾、組蛋白的各種修飾等[9]，其中DNA甲基化修飾是研究多倍體表觀遺傳變異的最佳途徑之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上對基因的表達進行調控，保護基因組結構的完整性，并控制冗余基因的表達，保持多倍體植物基因組的穩定性 [11-12]。多倍化能夠誘導DNA甲基化的改變，而DNA甲基化又在基因組調控和基因表達上起到一個樞紐的作用，因而用甲基化敏感擴增多態性技術（MSAP）研究不同倍性植株基因組DNA甲基化的表達水平及模式變化，在一定程度上對解釋多倍體植株出現的新的表型具有重要的意義。

目前多倍體方面的研究主要集中于異源多倍體的物種[13-16]，而對同源多倍體化后所產生的一系列變化方面的相關文章較少，這是因為異源多倍體化后較同源多倍體化后引起的變化更為明顯[17-18]。但是，異源多倍體帶來的雜交效應將混淆于倍性引起的后果[19]，因此，僅依賴于倍性調控變化方面的研究應通過同源多倍體來體現，揭示僅由基因組加倍而不涉及雜交等其他因素所造成的基因組沖擊以及隨后多個基因組趨于穩定的內在機制也需通過同源多倍體的研究來闡明。

桔梗為常用大宗藥材，具有開宣肺氣，祛痰排膿的功效[20]，在我國南北各地大面積栽培。但長期以來只種不選，導致品種退化，藥材產量和品質下降[21]。本研究在采用生物技術離體誘導并鑒定獲得桔梗同源四倍體的基礎上，采用甲基化敏感擴增多態性（MSAP）技術對二倍體和四倍體基因組DNA的甲基化變化情況進行分析，一方面為桔梗的品種選育提供材料，另一方面從表觀遺傳學的角度探討桔梗四倍體表型變化的分子機制，為多倍體育種提供一定的理論依據。

1材料

挑選籽粒飽滿的桔梗種子，經流水沖洗40 min后置于超凈工作臺，用75%乙醇消毒30 s后轉入0.1%升汞（HgCl2）中滅菌6 min，無菌水清洗3～5次，接入MS培養基，25～30 d后獲得桔梗無菌系。

2方法

2.1桔梗無菌快繁體系的建立和優化

以桔梗幼芽為材料，接種到增殖和生根培養基上，增殖培養基以MS為基本培養基，分別添加不同濃度6-BA（6-芐氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培養基以1/2MS為基本培養基，并添加不同濃度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）進行生根培養，試驗設計見表1，2。每個處理15個幼芽，5瓶重復，培養30 d后分別統計增殖系數和生根率。

2.2桔梗同源四倍體的離體誘導及鑒定

2.2.1桔梗同源四倍體的離體誘導具體方法參照王紅娟等[22]，并作適當調整。質量分數為0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液經20 mL的注射器和0.22 μm的水系濾頭抽濾滅菌后將桔梗不定芽浸泡在其中，置于震動搖床內處理12，24，36，48，60 h，然后用無菌水沖洗3次后接種到MS培養基中進行培養。以清水浸泡作為對照，共15個處理，每個處理15個幼芽，做5次重復。

2.2.2桔梗同源四倍體的鑒定采用形態鑒別、流式細胞儀分析和根尖染色體鑒定相結合的方法來確定倍性株系。先將形態變異明顯的植株進行流式細胞儀分析，具體方法參照張俊娥等[23]，稱取0.5 g組培苗葉片，用濾紙吸干水分后置于干凈培養皿中，加入2 mL預冷的組織解離液（80 mmol?L-1KCl，20 mmol?L-1NaCl，15 mmol?L-1Tris-HCl，20 mmol?L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎葉片，過濾后于4 ℃環境下2 000 r?min-1離心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室溫下反應1 h后即可上樣測定。流式細胞儀鑒定的株系進一步采用根尖壓片法確定植株染色體數目。具體方法參照張振超等[24]，早上9：00～11：00點取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol?L-1的八羥基喹啉預處理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡諾固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）處理24 h，在60 ℃的1 mol?L-1 HCL中解離8 min，卡寶品紅染色10 min，然后制片、鏡檢。

2.3總DNA提取

稱取0.5 g二倍體和四倍體桔梗試管苗幼葉，采用改良的CTAB法進行DNA提取，具體方法參照陳昆松等[25]，提取的DNA經紫外-可見分光光度計測定濃度和純度后用并1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，總DNA 置于-20 ℃冰箱待用。

2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.4.1酶切、鏈接反應MSAP試驗步驟參照Portis等[26]方法，用雙切酶組合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ對基因組DNA進行酶切，在酶切片段的兩端加上人工設計的與EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位點互補的人工接頭，然后用AFLP擴增體系進行擴增，接頭和引物序列見表3。引物由北京博友順生物科技有限公司合成。

2.4.2預擴增、選擇性擴增和電脈預擴增反應體系為20 μL，其中含有10 mmol?L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U?μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol?L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol?L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水補齊。反應條件為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26個循環，72 ℃延伸10 min。預擴增產物稀釋20倍，供選擇擴增用。

選擇擴增體系同預擴增體系，條件為：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個循環，每個循環降0.7 ℃進行降式PCR 擴增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23個循環，72 ℃延伸10 min。

選擇性擴增完成后在擴增PCR產物中加入上樣緩沖液，94 ℃變性10 min 后然后立即轉移到冰上冷卻防止復性，取5 μL變性產物于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，銀染后觀察。

2.5條帶統計與數據處理

由于甲基敏感擴增多態性技術中分別用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙切酶對基因組DNA進行酶切。因此每個樣品同時擁有2條泳道：第1條泳帶采用EcoRⅠ/HpaⅡ進行酶切，記為H，第2條泳帶采用EcoRⅠ/ MspⅠ進行酶切，記為M。同一位點有條帶的記為“1”，無帶的記為“0”。

3結果與分析

3.1增殖及生根培養基優化

將長1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7種增殖培養基中，經30 d培養后均出現不定芽增殖的現象，具體結果見表4，在4號培養基中，分化的芽數最多，增殖系數平均達9.3±0.24，且出芽整齊，生長健壯，葉色濃綠。因此，桔梗無菌苗增殖的最適培養基為MS+6-BA 1.5 mg?L-1+ NAA 0.3 mg?L-1。

生根培養基優化結果見表5，不同濃度的NAA和IBA對桔梗試管苗生根率、根生長狀況均有影響，隨著NAA和IBA濃度的增大，生根率逐漸降低，且出根不整齊，根細短。當培養基蔗糖含量為28 g?L-1，NAA質量濃度為0.6 mg?L-1時，平均生根率高達82.6±3.8，且根粗壯，整齊。由此可見，桔梗的最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.6 mg?L-1。

3.2桔梗同源四倍體的誘導結果

將桔梗不定芽用抽濾滅菌的秋水仙素（加0.02 g?mL-1二甲亞砜）混合液浸泡處理后，成功得到了桔梗同源四倍體植株。誘導結果見表6，不同的質量濃度和處理時間對不定芽的誘導效果不同，低濃度和短時間處理下誘導率低，但成活率高，隨著質量濃度和處理時間的增加，誘導率逐漸提高，但不定芽成活率降低。根據四倍體植株的誘導率和成活率，篩選出最佳處理濃度和時間，即用0.1%的秋水仙素溶液處理48 h或0.2%的秋水仙素溶液處理12 h為桔梗同源四倍體誘導的最佳條件。

3.3桔梗同源四倍體的鑒定

一般而言，四倍體植株具有巨型化特征，將形態變異明顯的植株先經流式細胞儀分析后，再用根尖壓片法鑒定，見圖1。結果表明，桔梗二倍體植株根尖染色體數為2n=2x=18，DNA相對含量在100處有1個單峰；同源四倍體植株染色體數為2n=4x=36，DNA相對含量在200處有1個單峰，見圖2。

3.4桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化水平差異

MSAP技術中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能識別并切割CCGG序列，但二者識別甲基化的位點不同，HpaⅡ能切割無甲基化和單鏈甲基化位點而不能切割雙鏈甲基化位點；MspⅠ能切割無甲基化和內甲基化位點而不能切割外甲基化位點，因此經HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上能檢測出4種條帶類型，即：Ⅰ型，H，M都有帶，說明CCGG位點無甲基化；Ⅱ型，H有帶，M無帶，說明CCGG位點發生單鏈外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H無帶，M有帶，說明CCGG位點發生雙鏈內甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都無帶，說明CCGG位點有雙鏈內外側甲基化、雙鏈外甲基化或無CCGG序列[16]。桔梗二倍體和同源四倍體DNA經MSAP擴增的條帶數及甲基化水平見表7，用20對引物組合共擴增后共有1 586條條帶，其中二倍體764條，四倍體822條。二倍體總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為92.15%，61.52%，30.65%，而四倍體的為86.13%，54.38%，31.75%，與桔梗二倍體相比，其同源四倍體總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，這說明染色體加倍后其DNA甲基化水平發生了變化。

3.5桔梗二倍體和同源四倍體基因組DNA甲基化類型

二倍體和同源四倍體桔?；蚪MDNA甲基化類型見表8，二倍體和四倍體共有15種條帶，見圖3。其中A型為單態性位點，包括3個亞類，表示二倍體與四倍體甲基化狀態相同；B型為去甲基化位點，包括5個亞類，說明在該位點二倍體存在甲基化，而四倍體發生了去甲基化；C型為過或超甲基化類型，也有5個亞類，即與二倍體相比，四倍體甲基化升高；D型為次甲基類型，有2個亞類，表示相比于二倍體來說，四倍體甲基化降低，但仍有甲基化現象[17]。與二倍體相比，桔梗試管苗染色體加倍后，其基因組DNA有23.54%發生了去甲基化現象，29.07%發生了過或超甲基化現象，2.97%發生了次甲基化現象，只有44.42%的基因組DNA未發生任何改變。

4討論與結論

4.1桔梗同源四倍體的離體誘導及鑒定

本研究中采0.2%抽濾滅菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10對引物，每對引物下有4條泳道，從左往右依次為2H，2M，4H，4M；2H和4H分別表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的擴增結果；2M和4M表示二倍體和四倍體桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的擴增結果。

泡桔梗頂芽12 h，獲得了誘導率為32.0%的四倍體植株。高山林等[27]采用培養基中添加40 mg?L-1秋水仙素的方法誘導桔梗四倍體，誘導率達到37.5%；王小華等[28]采用0.1%秋水仙素處理桔梗嫩莖40 h，誘導率達到50%。前人誘導率較高的原因可能是在鑒定過程中僅用形態學和細胞學的方法鑒定倍性，并沒有排除嵌合體的干擾，從而將嵌合率也計算到誘導率中，出現誘導率較高的現象，本研究采用了形態鑒別、流式細胞儀分析和根尖染色體鑒定相結合的方法進行倍性鑒定，排除了嵌合體的干擾，提高了結果的可靠性，為進一步研究桔梗同源四倍體的遺傳穩定性和農藝性狀評價提供可靠的材料。

4.2桔梗二倍體與四倍體基因組DNA甲基化水平差異及模式變化

多倍體植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性強等優點，這可能是多倍化后植物體內基因組結構和表觀遺傳修飾發生了廣泛變化[3]，進而導致植物出現新的性狀。但在對擬南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍體及二倍體的比較研究中發現這些植物同源多倍化后基因組結構并沒有發生明顯改變，且多倍化后多倍體的基因表達譜也與二倍體十分相似。表明同源多倍化后基因組并沒有同異源多倍化一樣發生大規模的基因組結構調整事件。本研究中，從圖1可以明顯看出桔梗同源四倍體比二倍體植株粗大，葉片增厚增大，葉柄葉脈粗大等現象，同源多倍體桔梗新出現的區別于親本的性狀則可能與表觀遺傳調控密切相關。

甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾形式，在基因表達中起著重要的調節作用，同源多倍化過程中，DNA甲基化會參與多倍體的適應性調整，并發生特異性的變化以調控基因表達和轉座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平會發生一定程度的改變[29]。楊嵐等[30]采用MSAP技術對甜葉菊同源四倍體與二倍體的表觀遺傳進行研究后發現四倍體基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以過和超甲基化為主；長春花[31]多倍化后基因組CCGG位點的 DNA的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率較二倍體植株均有所提高，甲基化類型以C型即過或超甲基化類型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因組DNA的總甲基化率和全甲基化率有所降低，其中總甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以過或超甲基化類型（C型）為主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推測同源四倍體出現新的表型與DNA甲基化模式的重新調整尤其是大量過或超甲基化變異有關，過或超甲基化就可能導致相應位點所在基因表達的關閉或抑制，進而維持四倍體植株這自身基因組的穩定性。有關染色體加倍后DNA甲基化模式調整的程度對多倍體性狀和表型改變的機制還有待進一步的研究。

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