妊娠晚期抗病毒免疫阻斷治療新生兒血清研究論文

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【關鍵詞】宮內感染InfluenceonserumhepatitisBvirustranscriptsinnewbornsbyHBIGimmunoblockingtherapyduringthelaterstageofpregnancy【Abstract】AIM:ToinvestigatethesignificanceofviraltranscriptsinearlystagediagnosisofHBVverticaltransmission,andtoobservetheinfluenceofHBIGimmunoblockingtherapyonserumHBVRNAinnewbornsfromHBVcarriermothers.METHODS:FortysixHBsAgpositivepregnantwomenweretreatedwithantiHBVimmunotherapy(HBIG200IU/4weeksandLimidazolewasappliedasliniment10mg/week)since26weekpregnancy.Theother23weretakenascontrolswithoutanyantiHBVtherapy.Viralnucleicacidswereextractedfromseraofmothersbeforetherapyandfromseraofnewborns.HBVDNAandRNAs,includingthefulllengthandtruncatedRNAmolecules,wereamplifiedrespectivelythroughPCRandRTPCRtargetedtotheHBVXproteinencodingregion.RESULTS:SerumHBVDNAinnewbornswasonlyfoundwhentheirmothershadnotbeentreated.CirculatingviralRNAwasdetectedinmorethanhalfofthenewbornsirrespectiveoftreatmentofmothers.However,inthenewbornsoftreatedmothers,serumRNAwasuniformlyofthetruncatedtype.CONCLUSION:ApplicationofserumHBVRNAisgreatlyhelpfultothediagnosisofearlystageinfectionofnewbornsfromHBVcarriermothers.TruncatedRNAistranscribedfromHBVtemplatesinthenewbornsratherthanbeingtransmittedfrommothertochild,immunoblockingtherapydoesnotinterferewithintrauterineinfection.However,itmayinterferewiththemanifestionofahighreplicativeinfection.【Keywords】hepatitisBvirus;transcript;verticaltransmission;intrauterineinfection;immunotherapy【摘要】目的：探討乙型肝炎病毒（HBV）轉錄體在早期診斷HBV母嬰傳播中的意義，并觀察母親抗乙型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）免疫阻斷治療對新生兒血清HBV轉錄體的影響．方法：治療組46例HBV表面抗原（HBsAg）陽性孕婦自孕26wk開始行抗HBV免疫治療（HBIGim,200IU/4wk;同時使用左旋咪唑涂布劑10mg/wk）；另23例HBsAg）陽性孕婦做為對照組未給予任何抗病毒治療.從孕婦治療前血清及其新生兒血清中提取核酸，經PCR及RTPCR擴增HBVDNA，全長型RNA（fRNA）和頓挫型RNA（trRNA），瓊脂糖凝膠電泳顯示產物，Southern雜交進一步驗證擴增產物.結果：HBVDNA陽性僅存在于未接受免疫治療的母親所生新生兒中；超過半數的新生兒血清中可檢測到病毒轉錄體RNA，并與其母親是否接受免疫阻斷治療無關.但是，治療組母親所生新生兒中僅可檢測到頓挫型病毒轉錄體trRNA.結論：血清HBV轉錄體可早期診斷新生兒HBV感染的狀態；新生兒血清中trRNA的轉錄模板可能為新生兒體內的病毒DNA;HBIG免疫阻斷治療不能阻斷HBV宮內感染，但可以阻止高復制性感染的發生.【關鍵詞】乙型肝炎病毒；轉錄體；母嬰傳播；宮內感染；免疫療法0引言母嬰傳播是形成慢性HBV感染的重要原因.據估計我國的慢性HBV感染約有30%~50%是通過母嬰傳播發生的.對于未接受治療的母親來講單獨HBsAg陽性母親的嬰兒，約40%在半歲內出現HBsAg陽性的所謂“突破性感染”［1-3］.而HBsAg和HBeAg雙陽性母親的嬰兒HBsAg陽性率高達90%以上［4］.這些嬰兒多數轉變為慢性HBV感染形成新的傳染源，并成為發生肝細胞癌（HCC）的高危人群.由于大部分受感染的新生兒延遲出現診斷性的指標HBsAg和HBVDNA,再加上部分病毒抗原和抗體可以通過胎盤屏障進入胎兒體內，使得新生兒感染的早期診斷顯得極為復雜和困難［1,5］.有研究表明，新生兒延遲出現的“突破性感染”發生在已有的隱匿型感染的基礎上［1,6-7］.我們的研究表明，結合病毒轉錄體的檢測可以更精確地診斷和區分復制期和非復制期（既隱匿型感染）等不同的感染階段［8-11］.并且，我們前期的研究也顯示，在慢性HBV感染母親所生的新生兒中，HBV轉錄體是一個較早出現的病毒標志物［12］.本研究擬應用我們建立的血清HBVRNA檢測方法，進一步分析血清病毒轉錄體在早期診斷新生兒感染狀態中的意義，以及免疫治療對它的影響.1材料和方法1.1材料1.1.1病例選擇69例HBsAg陽性孕婦分為治療組46例及未治療組23例.69例孕婦孕期均無先兆流產史無急性或慢性肝炎病史癥狀及體征無肝功能受損情況.孕婦年齡孕產次胎齡均無明顯差異.69例孕婦分娩新生兒69(男36，女33)例.1.1.2試劑高純度核酸提取試劑盒、核糖體RNA(rRNA)、單管RT/PCR試劑盒、地高辛探針標記及原位雜交試劑盒均購自Roche公司(Mannheim,德國)，原位雜交試劑盒、DNase和RNase滅活的吸頭購自Biolabs，HybondN尼龍膜購自Amersham，TaqDNA聚合酶、100bpDNAMarker及DNaseI均為Gibcol產品，DNase和RNase滅活的試管和離心管購自Eppendof公司.其他常用試劑和藥品均為分析純或電泳級.1.1.3引物和質粒PCR引物由上海生工合成.用于陽性對照的質粒為40A和41A［13］，均由德國癌癥研究中心病毒與宿主相互關系分部制備.1.2方法1.2.169例HBsAg陽性孕婦治療方法孕26wk開始，按來診次序分為治療組46例，孕26wk始孕婦臀大肌注射已型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）（上海生物制品研究所生產批號為20000712)200IU/4wk，同時使用左旋咪唑涂布劑(福建省凱華藥業有限公司生產批號為20000307500mg/支)5mL涂布于上下肢體內側皮膚易吸收處2次/wk，3mo一療程.未治療組23例根據患者或其親屬的意見未給予上述任何主動或被動免疫防治措施，孕婦所生的新生兒的乙肝疫苗接種均按第0,1,6月進行.1.2.2血清分離和核酸提取孕婦26wk肘靜脈采血2mL，新生兒分娩后24h內采股靜脈血2mL.按照我們建立的方法［10］，于30min內應用低溫離心（4000r/min，20min，4℃）分離血清.核酸的提取采用高純度病毒核酸提取試劑盒，按照說明書操作，僅將其中的poly(A)RNA替換為rRNA作為載體RNA，以免與后面使用的oligod(T)引物結合而干擾HBV3′端的結構分析.200μL血清標本提取后可得到50μL的核酸提取物.1.2.3目的核酸擴增按我們建立的方法［10］，針對HBV基因X區血清核酸的PCR，RTPCR所用上游引物包括txs（1445）：5′GGACCGTGTGCACTTCGCTT3′，txs1（1454）：5′GCACTTCGCTTCACCTCTGC3′，txs2（1464）：5′TCACCTCTGCACGTCGCATG3′；下游引物包括：txas（1574）：5′CCTCAAGGTCGGTCGTTGAC3′，xas1（1668）：5′AATTTATGCCTACAGCCTCC3′，txas5（1683a）：5′(T)15GCTGG3′.擴增病毒DNA采用50μL反應體系，TagDNA聚合酶5U，引物為txs/txas，循環條件：93℃100s，90℃40s，58℃50s，70℃40s，35個循環，72℃15min.trRNA的RTPCR系統在逆轉錄后采用半巢式PCR，引物txas5分別與txs和txs2配對.trRNA擴增用的錨定oligod(T)引物與fRNA的末端1803~1806位置的結構也有一定的親和力，故也同時檢測fRNA［10］.20g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果.1.2.4地高辛標記探針的制備和原位雜交按我們建立的方法采用PCR法合成2種地高辛標記探針，用于區分fRNA和trR[1][2][3]NA［10］.在這些PCR反應中，Dig11dUTP部分取代了dTTP作為Taq多聚酶的底物.各種核苷的使用濃度為：200μmol/LdATP,dGTP,dCTP;180μmol/LdTTP和20μmol/LDIG11dUTP.地高辛標記探針的合成嚴格按照產品說明書進行（Roche,Cat.No.1093088）.作為分析血清RNA的PCR擴增產物，DIG11dU/dT的最佳比例為1∶10.地高辛標記探針的顯影，采用一種堿性磷酸酶鏈接的抗地高辛抗體，當堿性磷酸酶與底物BCIP結合后，其產物可進一步與NBT反應，在膜上產生持久的藍色或棕色的沉淀.2結果2.1母親和新生兒血清中HBVDNA，fRNA(全長型)trRNA(頓挫型)的檢測圖1所示為4對治療組母親新生兒血清中相應的PCR和RTPCR擴增結果［10］.第1和第2對的母親DNA，fRNA，trRNA和HBeAg陽性，第3對的母親僅DNA和trRNA陽性，第4對的母親僅trRNA陽性.而所有4名新生兒僅顯示trRNA陽性.2.2治療組與非治療組母親和新生兒血清病毒RNA和DNA檢測結果表1總結了治療組與非治療組母親和新生兒血清中HBVDNA，fRNA和trRNA檢測結果.HBVDNA和fRNA等病毒復制的指標僅存在于非治療組新生兒，而trRNA在治療組與非治療組新生兒中普遍存在.未治療組新生兒HBVDNA和fRNA陽性率明顯高于治療組新生兒（P<0.01），而兩組新生兒血清trRNA陽性率無顯著性差異（P>0.05）.圖中所示119bpPCR擴增產物為HBVXDNA，360bp和235bp分別為fRNA和trRNA擴增產物.m1n1到m4n4表示4對母親/新生兒.cDNAf和cDNAtr：包含fcDNA和trcDNA的陽性對照質粒；符號“-”表示陰性對照；M：100bpDNA標志物.圖14對母親/新生兒血清中HBV核酸檢測的代表性結果（略）表1HBsAg陽性母親及其新生兒血清中HBV核酸的檢測結果（略）2.3HBIG免疫阻斷治療對trRNA和fRNA的影響表2對比了僅僅trRNA陽性和fRNA與trRNA共同陽性新生兒的例數.未治療23位母親所生23名新生兒中，12名表現為僅trRNA陽性，而治療組46位母親所生新生兒全部表現為僅trRNA陽性（表2）.結果提示，單獨trRNA陽性新生兒的出現與免疫治療無關，免疫治療導致新生兒fRNA消失，相應地trRNA單獨陽性的例數增加.在HBsAg和HBeAg共同陽性母親所生的新生兒中，免疫治療導致新生兒單獨trRNA陽性例數相對增加的作用表現得更加明顯（表2）.未治療母親所生新生兒中，fRNA和trRNA共同陽性者占7/11，而在治療組中則為0/14.3討論本研究立足于應用血清HBVRNA和DNA區分新生兒的不同感染類型.既往研究表明，fRNA是一個病毒復制的標志物，而trRNA單獨陽性提示無復制階段的病毒基因表達［8,9,14］.先前基于肝組織和血清的研究提示，trRNA的來源與染色體整合的和游離的病毒DNA均有一定關系［14-15］.而新生兒的感染處于病毒感染的早期階段，此時染色體整合的病毒DNA不占主導地位.因此更支持游離的病毒DNA為trRNA的轉錄模板.表2頓挫型RNA在全長型RNA陰性(tr)和陽性(ftr)母親/新生兒血清中的表達（略）不難理解，新生兒的HBV感染是由于暴露于受感染母親體內的病毒所導致的宮內感染.但是，這種感染不一定伴隨高復制階段.這可能是由于前基因組RNA缺乏反轉錄起始位點，原因可能為轉錄和轉錄體成熟的相關因素與肝臟的發育程度有關［16］.接受免疫阻斷治療的母親所生新生兒普遍缺乏fRNA和病毒DNA(以及HBeAg)，但trRNA陽性較為普遍.這一方面反映了免疫阻斷治療可以有效預防新生兒的高復制性的感染.另一方面，治療組與非治療組新生兒trRNA陽性率無明顯差異，提示病毒感染本身并沒有被有效預防.如果新生兒血清trRNA是宮內感染的產物，我們推測病毒感染和表達的模式可能有兩種：一種導致病毒的高復制，而另一種則檢測不到病毒的復制.前者對免疫治療敏感，而后者不敏感.但是，后者有可能會轉變為高復制狀態，這有助于解釋部分新生兒在出生后1歲以內甚至更晚出現的“突破性感染”［1,3,17］.雖然本研究明確地顯示了血清HBVtrRNA在新生兒HBV感染血清學診斷中的潛在意義，但在推廣至臨床應用之前，有必要進行包括動態追蹤觀察在內更大規模的研究.【參考文獻】［1］WangZ,ZhangJ,YangH,etal.QuantitativeanalysisofHBVDNAlevelandHBeAgtiterinhepatitisBsurfaceantigenpositivemothersandtheirbabies:HBeAgpassagethroughtheplacentaandtherateofdecayinbabies［J］.JMedVirol,2003,71(3):360-366.［2］ZhuQ,YuG,YuH,etal.ArandomizedcontroltrialoninterruptionofHBVtransmissioninuterus［J］.ChinMedJ(Engl)，2003,116(5):685-687.［3］DentingerCM,McMahonBJ,ButlerJC,etal.PersistenceofantibodytohepatitisBandprotectionfromdiseaseamongAlaskanativesimmunizedatbirth［J］.PediatrInfectDisJ,2005,24:786-792.［4］朱啟熔,呂晴,愈蕙,等.宮內感染HBV嬰兒接種乙肝疫苗失敗的機制和預后研究［J］.中華兒科雜志，1997,35(7):349-351.［5］WangJS,ChenH,ZhuQR.TransformationofhepatitisBserologicmarkersinbabiesborntohepatitisBsurfaceantigenpositivemothers［J］.WorldJGastroenterol,2005,11(23):3582-3585.［6］WheeleySM,BoxallEH,TarlowMJ,etal.HepatitisBvaccineinthepreventionofperinatallytransmittedhepatitisBvirusinfection:finalreportonaWestMidlandspilotstudy［J］.JMedVirol,1990,30(2):113-116.［7］NguiSL,OConnellS,EglinRP,etal.LowdetectionrateandmaternalprovenanceofhepatitisBvirusSgenemutantsincasesoffailedpostnatalimmunoprophylaxisinEnglandandWales［J］.JInfectDis,1997,176(5):1360-1365.［8］BreitkreutzR,ZhangW,LeeM,etal.HepatitisBvirusnucleicacidscirculatingintheblood:distinctpatternsinHBscarrierswithhepatocellularcarcinoma［J］.AnnNYAcadSci,2001,945:195-206.［9］SuQ,WangSF,ChangTE,etal.CirculatinghepatitisBvirusnucleicacidsinchronicinfection:Representationofdifferentlypolyadenylatedviraltranscriptsduringprogressiontononreplicativestages［J］.ClinCancerRes,2001,7(7):2005-2015.［10］ZhangW,HackerHJ,MildenbergerM,etal.2004.DetectionofHBVRNAinserumofpatients(Invitedpaper)［J］.MethodsMolMed,2004,95:29-40.［11］吳濤，張偉，蘇勤，等.中國人終末期肝病組織中乙肝病毒轉錄體的檢測［J］.第四軍醫大學學報，2004,25（7）:587-589.［12］崔云，張偉，蘇勤，等.乙型肝炎病毒轉錄體血清學檢測及其在母嬰垂直傳播中的意義［J］.第四軍醫大學學報，2005,26（12）:1089-1092.［13］HilgerC,VelhagenI,ZentgrafH,etal.DiversityofhepatitisBvirusXgenerelatedtranscriptsinhepatocellularcarcinoma:AnovelpolyadenylationsiteonviralDNA［J］.JVirol,1991,65(8):4284-4291.［14］KairatA,BeerheideW,ZhouG,etal.TruncatedhepatitisBvirusRNAinhumanhepatocellularcarcinoma:Itsrepresentationinpatientswithadvancingage［J］.Intervirology，1999,42(4):228-237.［15］Zhang[1][2][3]W,HackerHJ,TokusM,etal.PatternsofcirculatinghepatitisBvirusserumnucleicacidsduringlamivudinetherapy［J］.JMedVirol，2003,71(1):24-30.［16］ZhaoR,DuncanSA.Embryonicdevelopmentoftheliver［J］.Hepatology,2005,41(5):956-967.［17］YuenMF,LimWL,ChanAO,etal.18yearfollowupstudyofaprospectiverandomizedtrialofhepatitisBvaccinationswithoutboosterdosesinchildren［J］.ClinGastroenterolHepatol,2004，2(10):941-945