抗前列腺特異抗原/抗CD3雙特異性單鏈抗體四聚體的活性研究

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【關鍵詞】前列腺腫瘤；抗原,CD3；抗體親和力；四聚體

BiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3molecule

【Abstract】AIM:Tostudythebiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigen(PSA)andCD3molecule.METHODS:Flowcytometry(FCM)wasusedtodetectthebindingactivityofbispecificsinglechainantibodytoCD3positivecelllineJurkatandprostatecarcinomacelllineLNCaP.Theefficacyoftheantibodiyinmediatingtumorcelllysisinvitrowasdeterminedbyusingthe51Crreleasetest.Forinvivoevaluationoftheantibodysactivity,anudemousemodelwasused.ThemicewereinoculatedwithLNCaPprostatecancercells.RESULTS:ItwasdemonstratedthatthetetramerofbispecificsinglechainantibodycouldbindtotheJurkatandLNCaPcellswithhighspecificity.Thepercentsofthecellsbondbytheantibodywere70.4%and81%,respectively.Invitro,withactivatedCTLsaseffectorcells,aspecificlysisofLNCaPcellsmediatedbytheantibodywasconfirmedby51Crreleaseassay.ThespecificlysisrateofLNCaPcellswaspositivelycorrelatedtotBsAbconcentrationoreffector/targetcellratio.Thehighestspecificlysisrateswere(80.3±5.2)%and(78.6±5.5)%infixedantibodyconcentrationgroupandfixedeffector/targetcellratiogroup,respectively.Invivo,theantibodycouldsuppressthetumorgrowthinnudemicesignificantlyascomparedtothegrouptreatedonlywithCTLsandtheuntreatedcontrolgroup(P<0.0001).CONCLUSION:ThetetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3moleculehasagoodbiologicalactivityinbindingantigens,mediatinglysisofLNCaPcellsandinhibitingtumorgrowth.

【Keywords】prostaticneoplasms;antigens,CD3;antibodyaffinity;tetramer

【摘要】目的：研究抗前列腺特異抗原(PSA)/抗cd3雙特異性單鏈抗體四聚體的生物活性.方法：利用流式細胞儀和51Cr釋放試驗評價雙特異性單鏈抗體四聚體的抗原親和活性和體外介導殺傷靶細胞的效果.利用裸鼠前列腺癌模型分析其在體內介導細胞毒T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷的能力.結果：抗PSA/抗CD3雙特異性單鏈抗體四聚體可以特異性結合表達前列腺癌細胞和CD3陽性的淋巴瘤細胞，陽性結合率分別為70.4%和81%.在體外，有細胞毒T淋巴細胞存在時該四聚體可引起前列腺癌細胞的裂解，在抗體濃度固定組和效應細胞/靶細胞比例固定組，靶細胞裂解率分別隨著效應細胞/靶細胞比例和抗體濃度的增加而增加，最高裂解率分別可以達到(80.3±5.2)%和(78.6±5.5)%.與對照組比較，接種前列腺癌細胞的裸鼠在體內注射激活的細胞毒T淋巴細胞的同時接受該四聚體的治療后，腫瘤生長明顯受到抑制(P<0.0001).結論：抗PSA/抗CD3雙特異性單鏈抗體四聚體具有良好的生物學活性，具有體外殺傷腫瘤細胞和體內抑制腫瘤生長的作用.

【關鍵詞】前列腺腫瘤；抗原，CD3；抗體親和力；四聚體

0引言

免疫治療因其可以調動機體自身的免疫力，彌補患者免疫系統缺陷，達到治療腫瘤的目的而成為腫瘤治療方法中的重要組成部分.其中可以激活細胞毒T淋巴細胞并使其在腫瘤局部聚集的抗CD3/抗腫瘤特異性抗原雙特異性抗體倍受研究者矚目［1］.人p53基因表達產物以四聚體形式存在，其四價功能域表達產物可自動裝配成四聚體.我們在成功構建了人IgG3上游鉸鏈區/p53四價功能域融合基因［2］和制備抗前列腺特異抗原/抗CD3雙特異性單鏈抗體(BsAb)的基礎之上［3-4］，將四價功能域融合基因與雙特異性單鏈抗體基因拼接，制備雙特異性單鏈抗體的四聚體［5］，明顯提高了雙特異性單鏈抗體的親和力,改善了其生物活性.

1材料和方法

1.1材料抗PSA/抗人CD3雙特異性單鏈抗體四聚體(tBsAb)［5］由本實驗室制備并保存；前列腺癌細胞系LNCaP和CD3陽性的淋巴瘤細胞系Jurkat購買自美國標準培養收集所(ATCC,USA)；健康純種雌性Balb/c裸鼠（6~9wk）購買自中科院上海實驗動物中心.FITC標記的抗myc單克隆抗體(9E10)為第四軍醫大學免疫教研室謝鑫博士惠贈；其它常規試劑均為進口或國產分析純.

1.2方法

1.2.1抗體親和活性的鑒定前列腺癌細胞LNCaP和CD3陽性的淋巴瘤細胞Jurkat分別用含100g/LFCS的RPMI1640調整細胞濃度為5×109～1×1010/L，兩種細胞懸液各取2份，40μL/份，分別加入純化后的抗體（tBsAb），調整抗體終濃度為20mg/L，再加50μL1∶20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清，4℃放置30min，用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2mL，離心1000r/min，5min，棄上清，加入50μL1∶1500的FITC標記的抗myc單克隆抗體，充分振搖，4℃放置30min，用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2mL，離心1000r/min，5min，棄上清，加入1mL固定液，進行流式細胞儀(FCM)檢測.用正常鼠IgG替代抗體，按上述方法處理后作為陰性對照.

1.2.2效應細胞的制備利用密度梯度離心方法從正常人肝素化血液中提取外周血單核細胞（PBMC），加入低溫PBS重懸浮后，離心1000r/min，10min，棄上清，加入含有100g/LFCS,2mmoL/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640重懸浮.PBMC懸液移入250mL細胞培養瓶，CO2孵箱孵育1d，將非貼壁細胞移入新的培養瓶，更換培養液，并加入終濃度150U/mL的IL2，孵育3d，再次更換培養液，并將IL2的終濃度調整為100U/mL.之后每3d更換培養液，連續培養8wk后做為效應細胞.

1.2.3細胞毒實驗利用51Cr釋放試驗鑒定雙特異性抗體介導的效應細胞殺傷腫瘤細胞的效果.靶細胞的標記：將5×106LNCaP細胞和7400kBq（200μCi）Na2［51Cr］O4在37℃的50mL/LCO2孵箱中孵育1d，RPMI1640洗滌2次后，加入96孔培養板中（1×104/孔）.將靶細胞分為對照組和tBsAb組，對照組中應用小鼠IgG.每組再分為抗體濃度固定組和效應細胞/靶細胞比例固定組.另設僅含標記靶細胞的自然釋放對照孔及含有標記靶細胞和10mL/LTritonX100的最大釋放對照孔.抗體濃度固定組的抗體濃度為30μg/L，效應細胞/靶細胞比例從0.5∶1至30∶1不等；效應細胞/靶細胞（E/T）比例固定組中E/T為20∶1，抗體濃度為0.1~300μg/L，相同實驗條件重復4孔.50mL/LCO2孵箱，37℃放置4h.然后，經過離心提取培養上清（150μL），γ計數器測量每份上清的cpm值.計算特異性釋放率：特異性釋放率(%)＝（實驗孔cpm-自然釋放對照孔cpm）/(最大釋放對照孔cpm-實驗孔cpm)×100%.

1.2.4裸鼠動物模型四只健康裸鼠靜脈注射tBsAb和效應細胞，驗證抗體及效應細胞毒副作用.將36只裸鼠隨機分成3組：非治療組、對照組和tBsAb組，非治療組不接受任何治療，對照組每日僅接受靜脈注射效應細胞（1×107），tBsAb組靜脈注射1×107效應細胞和200μgtBsAb.分別于裸鼠腹側皮下注射1×107LNCaP細胞，等腫瘤體積達到約100mm3時，開始各組治療方案并計時，腫瘤體積每周測量1次，體積計算：寬2×長×0.52.6wk后將裸鼠用CO2處死.

統計學處理：利用SAS8.1統計軟件分析,統計圖利用SPSS13.0制作，采用重復測量方差分析.P<0.05為具有統計學意義.

2結果

2.1流式細胞儀FMC顯示雙特異性抗體四聚體可以特異性結合前列腺癌細胞LNCaP和CD3陽性的淋巴瘤細胞Jurkat，與LNCaP細胞和Jurkat細胞的陽性結合率分別為70.4%和81%(圖1).

A:Jurkat細胞陰性對照組;B:tBsAb與Jurkat細胞的結合；C:LNCaP細胞陰性對照組;D:tBsAb與LNCaP細胞的結合.

圖1FCM分析tBsAb分別與LNCaP和Jurkat的結合活性（略）

2.2體外介導的細胞毒作用tBsAb可以有效的介導效應細胞（T細胞）對靶細胞（LNCaP細胞）的殺傷，靶細胞裂解百分比在實驗組（效應細胞/靶細胞比例固定組和抗體濃度固定組）和對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.0001）.在效應細胞/靶細胞比例固定組，隨著tBsAb濃度的不斷增加，特異性釋放率顯著增加（P<0.0001）；同樣，在抗體濃度固定組，隨著效應細胞/靶細胞比例的逐漸增加，特異性釋放率顯著增加P<0.0001,圖2).

A:效應細胞與靶細胞比例固定組;B:抗體濃度固定組.

圖2tBsAb介導的特異性殺傷（略）

2.3裸鼠動物模型4只接受靜脈注射tBsAb和效應細胞的健康裸鼠無明顯異常表現，證實tBsAb和效應細胞無明顯毒副作用，裸鼠可以耐受.36只入組裸鼠中，共33只完成6wk治療，3只死亡，其中1只死于感染，2只死亡原因不明，將死亡裸鼠實驗資料剔除，最終每組實驗裸鼠數目為非治療組（n=12），對照組（n=11）和tBsAb組（n=10）.重復測量方差分析結果顯示：非治療組和對照組腫瘤體積逐漸增大，tBsAb組腫瘤生長明顯受到抑制，三組之間差異具有統計學意義（P<0.0001，圖3).

圖3tBsAb的治療作用（略）

3討論

免疫治療因其可以調動機體自身的免疫力，彌補患者免疫系統缺陷，達到治療腫瘤的目的而成為腫瘤治療方法中的重要組成部分.近年來，越來越多的研究結果顯示：腫瘤免疫治療是一種具有廣闊應用前景的治療方法.由于抗免疫效應細胞表面標志物，如CD3,CD2,CD16和CD64等抗體可以有效激活效應細胞，因此利用同時能識別免疫效應細胞及腫瘤相關抗原的雙特異性抗體可以增加腫瘤部位效應細胞的數量并激活效應細胞，使其發揮細胞毒功能.

本實驗室利用分子克隆的方法成功構建了抗PSA/抗人CD3雙特異性單鏈抗體，試圖增加并活化前列腺癌組織周圍的細胞毒T淋巴細胞，介導T淋巴細胞對前列腺癌細胞的殺傷，達到治療前列腺癌的目的.但是，其親和力和腫瘤殺傷活性不理想［4］.之后我們利用p53四價功能域可以將P53分子自動組裝成四聚體的特性，構建了人IgG3上游鉸鏈區/p53四價功能域融合基因［2］，將其融合在BsAb基因的3''''端，構建了抗PSA/抗人CD3雙特異性單鏈抗體的四聚體基因，并獲得真核表達，明顯提高了原雙特異性單鏈抗體的親和力［5］.

我們研究表明,tBsAb可以特異性識別靶細胞，與靶細胞的親和力明顯高于原雙特異性單鏈抗體（BsAb）.體外殺傷實驗結果顯示tBsAb可以介導細胞毒T淋巴細胞對靶細胞的殺傷，介導殺傷效率明顯優于BsAb［4］.同時，這一結果在裸鼠前列腺癌模型體內實驗中得到進一步證實：tBsAb基本可以達到抑制腫瘤生長的目的.當然從實驗結果中還可以看出：只有當效應細胞成倍于靶細胞，并且抗體濃度達到一定水平時，抗體介導細胞毒T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的能力才能得到發揮，并且這種能力的大小與效應細胞/靶細胞比例和抗體濃度程正相關.

【參考文獻】

［1］KontermannRE.Recombinantbispecificantibodiesforcancertherapy［J］.ActaPharmacolSin,2005,26(1):1-9.

［2］王棟，王禾，武國軍，等.人IgG3上游鉸鏈區/p53四價功能域融合基因的構建及空間構象分析［J］.細胞與分子免疫學雜志，2001,17(4)：381-383.

［3］武國軍，郝曉柯，白玉杰，等.抗人精漿蛋白單克隆抗體輕、重鏈可變區基因的克隆及序列分析［J］.第四軍醫大學學報，1998，19(5)：484-487.

［4］王棟，武國軍，王禾，等.抗前列腺癌/抗CD3雙特異性單鏈抗體的構建及表達［J］.中華醫學雜志，2003，83（15）：1292-1295.

［5］王棟，武國軍，譚建明，等.人p53四價功能域用于提高抗體功能性親和力的研究［J］.中華醫學雜志，2005，85（7）：479-482.