生長抑素類似物對人肝癌細胞株MHCC97

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【關鍵詞】MHCC97

InfluenceofsomatostatinanalogueonhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97H

【Abstract】AIM:TostudytheinfluenceofsomatostatinanalogueoctreotideonhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97Handitsmechanismsinvivo.METHODS:Twentysevennudemice,ofwhichMHCC97Htumormasswasplantedinliver,weredividedinto3groupsrandomly:negativecontrolgroup,lowdoseinterferedgroup,largedoseinterferedgroup,andraisedatsimilarconditionfor35dthesurvivaltime,theweightatthedeathpointwereracordedandthepathologicailchangesofliversandlungswerechanged;theexpressionofmatrixmetalloproteinases2（MMP2）inhepatocellularcarcinomawasdetectedbyimmunohistochemicaltechnique.RESULTS:Comparedwiththeanimalmodelsofnegativecontrolgroup,theanimalmodelsofinterferedgroupswereheavierinmeanweightatdeathpointandlowerinmetastasisrate(P<0.05);whiletherewasnostatisticaldifferencebetweenthe2interferedgroups(P>0.05);theexpressionofMMP2inhepatocellularcarcinomaofinterferedgroupswasgraduallyincreasedthanthatincontrolgroup（P<0.05）;whiletherewasnostatisticaldifferencebetweeninterferedgroups(P>0.05).CONCLUSION:OctreotidecanimprovethelivingqualityofanimalmodelsandinhibitthemetastasisofhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97Hinvivo,whichmightberelatedtothedownregulationoftheexpressionofMMP2.

【Keywords】MHCC97H,octreotide,inhibition

【摘要】目的：探討生長抑素類似物奧曲肽對人高轉移潛能肝癌細胞株mhcc97H的影響及可能機制.方法：MHCC97H腫瘤組織種植于裸鼠肝臟建立肝癌動物模型27只，隨機分為3組：陰性對照組和小、大劑量干預組，同等條件下飼養35d，記錄動物模型生存期，死亡時質量；觀察肝臟，肺臟病理改變；免疫組化方法檢測肝臟腫瘤組織基質金屬蛋白酶2(MMP2)表達變化.結果：奧曲肽干預組動物模型較陰性對照組動物模型死亡時平均體重增加,肝癌轉移率下降(P<0.05)；干預組間對比未見統計學差異(P>0.05)；免疫組化顯示干預組肝臟腫瘤細胞MMP2表達較陰性對照組下調（P<0.05）；干預組組間比較未見統計學差異(P>0.05).結論：奧曲肽可改善荷MHCC97H細胞裸鼠肝癌模型生存質量，抑制MHCC97H細胞肺轉移，下調腫瘤組織MMP2的表達是奧曲肽抑制MHCC97H細胞侵襲轉移的可能機制之一.

【關鍵詞】MHCC97H細胞株；奧曲肽；抑制

0引言

原發性肝細胞肝癌(primaryhepatocellularcarcinoma,PHC)PHC根治性切除后5a復發率為54.1%～61.5%，小肝癌(≤5cm)為43.5%，而局部治療的轉移復發率則更高.常規化療及放療效果不佳，副作用大，基因治療、生物治療等作用亦不明顯.因此，深入研究肝細胞癌轉移、復發機制和積極探索有效的抗復發轉移治療措施是當前PHC診治中的重點和難點.

1材料和方法

1.1材料主要試劑和儀器:善寧注射液(0.1mg/支)由瑞士諾華公司生產提供.鼠抗人MMP2抗體AntibodyDiagnosticaInc.

1.2方法

1.2.1細胞培養人高轉移潛能肝癌細胞株MHCC97H由上海中山醫院腫瘤研究所購得，100mL/L胎牛血清（fetalcalfserum,FCS）加達爾伯克改良伊格爾培養基（dulbeccosmodifiedeaglesmedium,DMEM）于50mL細胞培養瓶內37℃，50mL/LCO2及飽和濕度下CO2孵育箱內培養.

1.2.2動物模型取對數生長期MHCC97H肝癌細胞株，充分吹打至單細胞懸液，細胞沖洗液沖洗3次，DMEM調整細胞濃度至2×107/mL，取0.2mL于4～6周齡的雄性裸鼠背部皮下注射，實驗動物于層流室內飼養28d，至皮下結節直徑約1cm，無菌條件下取出腫瘤組織保存于37℃含20g/LFCS的DMEM中，粉碎至2mm×2mm×2mm.4～6周齡的雄性裸鼠30只，戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉后，手術野皮膚消毒，左肋緣下斜切口進腹，顯露肝左葉，腫瘤組織塊2mm×2mm×2mm大小，接種于肝左外葉，壓迫止血，關腹.同等條件下，動物模型層流室內飼養3d，剔除因麻醉意外、感染及出血死亡動物模型3只，余動物模型隨機分為3組，動物模型體質量及周齡組間均衡性檢驗無統計學差異.A組：陰性對照組（等體積生理鹽水腹腔注射，n=8）；B組：小劑量干預組（Oct50μg/kg・d腹腔注射，n=9）；C組：大劑量干預組（Oct200μg/kg・d腹腔注射，n=10），同等條件下層流室內飼養35d.

1.2.3標本檢測記錄每只動物模型生存時間，死亡時體質量，取肝臟，肺臟40g/L多聚甲醛，0.1mol/L磷酸緩沖液固定48h，組織石蠟包埋，HE染色，免疫組化方法檢測對比組間肝臟腫瘤組織MMP2表達變化.染色結果判定參照Mattern方法［1］：陽性染色深度:未見染色為0，輕度染色(染成淺黃色)為1，中度染色(染成棕黃色)為2，深度染色(染成棕褐色)為3；陽性細胞百分比:未見染色為0，染色細胞<25%為1，25%～50%為2，>50%為3.將這兩方面得分相加，得分0～2分判為陰性表達，>2分(3～6)判為陽性表達，隨機選擇10個高倍視野，記數1000個細胞.

統計學處理：實驗計量結果以x±s表示,計量資料組間比較經SAS軟件進行方差分析及Dunnett檢驗，計數資料組間比較采用Fisher確切概率法.

2結果

人高轉移潛能肝癌細胞株MHCC97H種植于裸鼠皮下，層流室飼養35d后發現原注射點皮下形成約1.1×0.9cm包塊，實驗動物呈現衰竭狀態.動物模型建立后，待實驗動物自然清醒，觀察3d后，實驗動物活動靈敏，覓食積極，并未發現因出血和感染死亡動物.動物模型建立后10d發現陰性對照組動物模型較干預組動物模型活動減少，同時發現對照組動物模型死亡時體重明顯減輕（P＜0.01），生存時間組間對比未見統計學差異（P>0.05）,但是大劑量干預組動物模型中位生存期較小劑量干預組延長（26.7~21.5d），同時小劑量干預組動物模型中位生存期較陰性對照組延長（21.5~19.3d）.

肝臟病理改變可見兩種類型.A型肉眼見裸鼠肝體積明顯減小，色澤晦暗，質地變硬，表面滿布1~2mm大小結節，呈“粟?！睒?，與正常肝臟組織分界不清.鏡下見裸鼠肝細胞大量變性壞死，組織結構消失，正常肝小葉結構消失，殘存裸鼠肝細胞腫脹，胞漿內氣球樣改變，水腫明顯；腫瘤細胞胞核淡染，異型性明顯，聚集成團，呈現“癌巢”狀，可見腫瘤細胞侵入管型結構.B型肉眼見裸鼠肝變化不明顯，色澤鮮紅，質地柔軟，光滑，與正常肝臟組織分界明顯.鏡下見壞死區范圍明顯縮小，腫瘤細胞呈現“癌巢”改變，裸鼠殘存肝細胞腫脹壞死明顯減輕.肺臟病理改變：肺泡結構完整，肺泡間質內可見炎性細胞聚集，并可見肺泡間質內腫瘤細胞聚集成團，胞核淡染，異型性明顯.

陰性對照組87.5%動物模型肝臟呈現“A”型形態改變，干預組77.8%動物模型肝臟肉眼觀呈現“B”型形態改變，而且在大劑量干預組出現B型形態改變的動物比例大于小劑量干預組（44.4%~100%）.肺臟組織連續切片HE染色判斷肝癌肺轉移率可見陰性對照組轉移率87.5%，小劑量干預組轉移率33.3%，大劑量干預組轉移率10.0%（表1，P<0.05）.大劑量干預組MMP2表達明顯下調，陽性表達腫瘤細胞幾乎不可見，在小劑量干預組MMP2表達較大劑量干預組表達上調，可見少量陽性及弱陽性腫瘤細胞，散在分布；在陰性對照組MMP2表達明顯較干預組強，可見陽性及強陽性細胞出現.而干預組間未見統計學差異（表2）.

表1組間動物模型一般狀況(略)

aP<0.05vs陰性對照.

表2MMP2,MMP9在肝癌組織中的表達（略）

aP<0.05vs陰性對照.

3討論

HCC的高復發高轉移特性嚴重影響HCC的遠期療效,部分腫瘤在體積很小時就已發生遠處轉移，臨床就診者多屬中晚期，因此如何控制HCC的高侵襲性，降低復發率和轉移率是當今治療HCC的重點.SS及其類似物對腫瘤的抑制作用近來受到關注.Oct為人工合成的生長抑素類似物，臨床上發現Oct對多種實體腫瘤存在抑制作用，包括胃癌，肺癌，胰腺癌等［2］.隨著臨床研究的進展，Oct被逐步應用于HCC治療領域，眾多實驗表明在人肝癌細胞表面存在SSTR表達［3］，而且這一現象已被利用于腫瘤的診斷［4-5］.

文獻報道［6］于裸鼠肝內種植MHCC97H細胞株建立肝癌模型，飼養35d后，肝癌肺轉移率高達100%，而且MHCC97H細胞株體外連續培養傳代120余代，生物性狀保持穩定，是研究肝癌復發轉移的良好模型.試驗中發現在組間均衡性檢驗未見統計學差異以及同樣的飼養條件下，陰性對照組動物模型肝癌肺轉移87.5%，明顯高于小劑量干預組(33.3%)和大劑量干預組(10.0%)，Oct對肝癌肺轉移存在抑制作用.

MMP2在癌組織內表達于肝癌細胞胞漿內，呈淡黃色至棕褐色細顆粒狀.MMP2陽性細胞常散在分布，也有呈巢團狀，在浸潤灶前沿處MMP2表達加強，陽性及強陽性細胞數目增多.而位于腫瘤邊緣、近血管處、浸潤灶前沿等處腫瘤細胞常是高侵襲性克隆聚集處，提示MMP2可能于高侵襲性克隆中表達加強.在組間比較中發現陰性對照組MMP2表達明顯強于干預組，干預組組間比較未見統計學差異；MMP2主要降解作為基底膜的主要成分的Ⅳ型膠原、同時也具有降解明膠、Ⅶ和Ⅹ型膠原的能力，MMP2的異常高表達與腫瘤的惡性程度和腫瘤的血管生成呈正相關，二者均與腫瘤的生長轉移密切相關，Oct可以降低動物模型肝癌轉移率，可能通過下調促轉移相關蛋白MMP2的表達得以實現，是其抑制HCC遠處轉移的機制之一［7］.

【參考文獻】

［1］MatternJ,KoomagiR,VolmM.AssociationofvascularendothelialgrowthfactorexpressionwithintratumoralmieroveSSaldensityandtumoralproliferationinhumanepidermoidlungcarcinoma［J］.BrJCancer,1996,73(2):931-934.

［2］SmithAB,CharnleyAK,MesarosEF,etal.Design,Synthesis,andBindingAffinitiesofPyrrolinoneBasedSomatostatinMimetics［J］.OrgLett,2005,7(3):399-402.

［3］RadererM,HejnaMH,MullerC,etal.Treatmentofhepatocellularcancerwiththelongactingsomatostatinanaloglanreotideinvitroandinvivo［J］.IntJOncol,2000,16(6):1197-1201.

［4］MannavolaD,PersaniL,VannucchiG,etal.Differentresponsestochronicsomatostatinanaloguesinpatientswithcentralhyperthyroidism［J］.ClinEndocrinol(Oxf),2005,62(2):176-181.

［5］AcostaGomezMJ,MurosMA,etal.Theroleofsomatostatinreceptorscintigraphyinpatientswithpituitaryadenomaorpostsurgicalrecurrenttumours［J］.BrJRadiol,2005,78(926):110-115.

［6］LiY,TangY,YeL,etal.EstablishmentofahepatocellularcarcinomacelllinewithuniquemetastaticcharacteristicsthroughinvivoselectionandscreeningformetastasisrelatedgenesthroughcDNAmicroarray［J］.JCancerResClinOncol,2003,129(1):43-51.

［7］王賢輝,陳志南,郭曉楠,等.CD147分子與MMPs在肝癌細胞系中表達的相關性［J］.第四軍醫大學學報,2001;22(3):217-219.