吸入一氧化氮對無心跳供體肺缺血思考

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【摘要】目的探討一氧化氮(NO)對大鼠無心跳供體(NHBD)肺缺血再灌注損傷(IRI)的影響。方法大鼠隨機分為Ⅰ組:有心跳供體(HBD)組;Ⅱ組:NHBD-吸氧組;Ⅲ組:NHBD-吸氧＋NO組。Ⅰ組在處死的同時灌注4℃低鉀右旋糖苷液(LPD),Ⅱ組、Ⅲ組處死后維持輔助呼吸,放置室溫中30min再灌注LPD液。供肺置于4℃LPD液中4h后行原位左肺移植術。術后維持輔助呼吸1h。Ⅲ組通氣吸氧的同時吸入濃度為40×10-6的NO。結果與Ⅱ組比較,Ⅲ組肺順應性、動脈血氧分壓高,肺組織丙二醛含量低(P<0.05)。結論吸入低濃度NO可減輕大鼠NHBD肺缺血再灌注損傷。

【關鍵詞】一氧化氮;組織供者;肺移植;缺血;再灌注損傷;疾病模型,動物

ABSTRACT:ObjectiveToevaluatetheeffectofinhalednitricoxide(NO)ontheischemia-reperfusioninjury(IRI)inratlungsfromnon-heart-beatingdonors(NHBD).MethodsSixtySprague-Dawleyratswererandomlydividedinto3groups:groupⅠ,heart-beatingdonor;groupⅡ,NHBDwith30minutesofwarmischemiatime(WIT)andoxygeninhaled;groupⅢ,NHBDwith30minutesofWITandoxygenandNOinhaled.ThedonorlungsofgroupⅠwereflushedwithlowpotassiumdextran(LPD)solutionat4℃afterasystoliawhilethelungsofgroupⅡandgroupⅢremainedventilatedattheroomtemperaturefor30minutesafterasystoliaandthenwereflushedwithLPDsolution.AllofthedonorlungsremainedinflatedwhentheywerestoredinLPDsolutionat4℃for4hours.Therecipientratsunderwentorthotopicleftlungtransplantation.Aftertransplantation1hour’sreperfusionandventilationwasmanipulated.ThedonorlungsofgroupⅢinhaledadditionalNOwiththeconcentrationof40×10-6atthetimeofventilation.ResultsComparedwiththegroupⅡ,thepulmonarycomplianceandtheoxygenpartialpressureofthearterialbloodarehigher,theMDAinthelunglower(P<0.05).ConclusionThelow-dosageofNOisaneffectivetreatmenttoattenuatetheacuteinjuryresultedfromtheischemia-reperfusionintheratlungsfromnon-heart-beatingdonors.

KEYWORDS:nitricoxide;tissuedonorslungtransplantation;ischemia;reperfusioninjury;diseasemodels,animal

肺移植是治療晚期肺部疾病的成熟方法。但肺移植例數卻一直得不到顯著提高,其中一個重要原因就是合適供體肺嚴重短缺。若能應用無心跳供體(NHBD)肺,將極大緩解供肺來源緊張的狀況。先前筆者的研究已證實NHBD肺可作為供體肺［1］。但缺血再灌注損傷(IRI)限制了NHBD肺應用。為減少IRI對NHBD肺造成的影響,保護NHBD肺的結構和功能的完善,筆者探討一氧化氮(NO)對NHBD肺的保護作用。

1材料和方法

1.1動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只,體質量(350±12.5)g(上海第二醫科大學實驗動物科學部,合格證書:醫動字第07-23-4號)。

1.2主要儀器

動物人工呼吸機(DH-140B型,浙江醫科大學醫療儀器實驗廠);低鉀右旋糖苷液(LPD,福州嘉華制藥有限公司);NO監測儀(英國MicroMedical公司);NO標準氣體(北京普萊克斯氣體有限公司);手術顯微鏡(SXP-1B型,上海醫用光學儀器廠);血氣分析儀(i-STAT便攜式,美國雅培公司);

1.3方法

1.3.1分組

大鼠隨機分為3組，供、受體各10只。Ⅰ組:有心跳供體(HBD)組;Ⅱ組:無心跳供體(NHBD)-吸氧組;Ⅲ組:NHBD-吸氧＋NO組。Ⅰ組在處死的同時灌注4℃LPD;Ⅱ組、Ⅲ組處死后維持輔助呼吸,放置室溫中30min再灌注LPD液。供肺置于4℃LPD液中4h后行原位左肺移植術。術后維持輔助呼吸1h。Ⅲ組通氣吸氧的同時吸入濃度為40×10-6的NO。

1.3.2取HBD肺

供體大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg。仰臥位,氣管插入16號穿刺針,連接動物人工呼吸機,吸入氧濃度(FiO2)50%,呼吸模式為持續容量控制,呼吸頻率80~90min-1,潮氣量1mL/100g,保持呼氣末正壓(PEEP)2~3cmH2O(1cmH2O=9.8Pa)。自左股靜脈注射肝素鈉500IU。5min后剪開胸骨及腹壁,剪斷腹主動脈放血。心臟停跳的同時于肺動脈主干插入20號穿刺針,結扎并固定,剪破左心耳,維持通氣的同時自穿刺針灌注4℃LPD液20mL,灌注壓25cmH2O,在肺吸氣末切下心肺組織,立即浸泡在4℃LPD液中5min,剪下膨脹的左肺,保存在4℃LPD液中4h。

1.3.3取NHBD肺

處死供體鼠后,室溫下維持通氣30min再灌注LPD液。NHBD-吸氧組吸入氣不含NO,NHBD-吸氧＋NO組吸入濃度為40×10-6的NO。

1.3.4左肺移植

受體鼠麻醉、插管后,右側臥位,經左第5肋間切口充分暴露左肺門,盡可能靠近遠心端剪除左肺。供肺包以冰水浸泡的濕紗布,放入左側胸腔,在手術顯微鏡下9-0錦綸線依次吻合左肺靜脈、左主支氣管、左肺動脈,連續吻合主支氣管膜部,軟骨部間斷吻合,10-0錦綸線間斷吻合肺動脈,連續吻合肺靜脈。左肺獲得再灌注后,間斷加大PEEP,使其充分膨脹。Ⅲ組受體在肺移植過程中維持NO通氣(濃度為40×10－6)。

1.4觀察指標

左肺再灌注后1h,經右第5肋間結扎右肺門,采集數據。

1.4.1肺順應性

呼吸機直接讀取數據肺順應性=潮氣量/(吸氣末壓-呼氣末壓)

1.4.2動脈血氣

受體鼠結扎右肺門前后15,30min分別從頸動脈放血0.3mL,測定動脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.4.3肺組織丙二醛(MDA)含量

取1cm×1cm的肺組織,沖洗干凈,研磨成勻漿,按文獻［2］硫代巴比妥法測MDA含量。

1.4.4肺組織光鏡

LPD液灌注前取1cm×1cm右肺組織,結扎右肺門后0.5h取1cm×1cm左肺組織行光鏡組織學檢查(H-E染色×40)。

1.5統計學處理

數據以x±s表示,采用SPSS10.0統計軟件處理,組間比較采用One-wayANOVA方差分析。P<0.05為差別有統計學意義。

2結果

2.1肺組織順應性、MDA含量及動脈血氧分壓Ⅰ組與Ⅱ組比較差別無統計學意義;Ⅲ組與Ⅱ組比較差別有統計學意義(表1,2)。表13組實驗大鼠肺順應性和肺組織MDA含量比較（略）表23組實驗大鼠動脈血氣分析比較（略）

2.2肺組織光鏡檢查

Ⅰ組和Ⅱ組肺泡間質均有一定量炎性細胞浸潤(P<0.05),Ⅲ組炎性細胞浸潤相對較輕(圖1)。

3討論

當前,適宜肺供體的嚴重短缺極大制約了肺移植的開展。Egan等首次應用無心跳供體肺于肺移植研究中,發現狗肺死后尸體原位熱缺血1h、取出冷保存4h、移植1h后仍可維持完善的氣體交換和血流動力學功能［3］。本課題組早期研究顯示,與HBD移植肺相比,大鼠NHBD肺熱缺血30min,移植后肺的順應性、肺能量代謝物含量,肺氣體交換功能維持正常［1］。本次研究顯示,Ⅱ組和Ⅰ組移植肺順應性、血氣分析和肺組織MDA含量差別無統計學意義。

但是,供肺在保存過程中存在的IRI,不僅造成肺移植患者術后的早期死亡,而且增加了急性排斥反應的發生率,導致長期存活受體的移植物失功［4］。NHBD肺還存在熱缺血過程,隨著熱缺血時間的延長,術后IRI更加嚴重［1,5］。移植肺發生IRI的過程中,內源性NO明顯減少［6-7］。內源性NO可對肺IRI產生明顯的保護效果。研究人員運用多種方法處理實驗對象,包括腹腔注射曲匹地爾、鼻飼氯匹格雷、肺保護液內加入硝酸甘油(NTG)、左旋精氨酸等,以促進機體內源性NO的產生,減輕IRI,使肺功能顯著改善［8-12］。但所有這些實驗都是在有心跳供體的肺移植中所取得的成果。

為了獲取結構和功能保存更好的NHBD肺,本研究在前期工作的基礎上,給予采用外源性低濃度NO(40×10－6)于大鼠NHBD肺移植中,并貫穿于供肺保存、手術期間及術后1h整個過程。結果發現,吸入NO組(Ⅲ組)和單純吸氧組(Ⅱ組)相比,吸氣末壓分別為(19.09±0.35)cmH2O和(21.37±0.61)cmH2O,肺組織順應性分別為(0.179±0.0020)和(0.158±0.0058),兩者比較有統計學意義,提示肺的IRI得到明顯改善。結扎右肺門后15,30min的PaO2也得到很大的提升,說明移植肺氧合功能也有一定程度的提高;同時肺組織MDA含量顯著降低。MDA是氧自由基介導的細胞膜脂質過氧化產物,是氧自由基致機體組織細胞損傷的重要指標,是器官IRI最主要的因素,檢測MDA是判斷是否發生脂質過氧化反應的重要方法［2］。Ⅲ組MDA降低,提示IRI造成氧自由基對細胞的損害明顯緩解。這和肺組織病理切片上所觀察到的結果是一致的。本研究結果與文獻報道基本一致［13-15］。

筆者認為,吸入低濃度外源性NO對NHBD肺的IRI具有一定的緩解作用。

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