靜寂SNP觀察研究論文

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人類的疾病易感性、藥物療效及毒副反應，普遍存在個體及種群間的差異。越來越多的證據表明，遺傳變異是決定這些差異的主要因素。隨著人類基因組計劃的完成，人類變異基因組計劃（HVP）、全基因組關聯性研究（Wholegenomeassociationstudy,WGAS）的開展，發現人類基因組變異遠遠超出早期估計的水平［1］。其中單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，即指基因組內特定核苷酸位置上存在兩種以上不同的堿基，其中最少一種在群體中的頻率不<1%。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。在人類基因組中發生頻率約為1/100～1/1000推測SNP的數量達到300萬～3000萬［3］。具有數量多，分布廣泛；適于快速、規模化篩查；突變率低，穩定性好等優點。被稱為繼限制性酶切片段長度多態性和微衛星重復序列之后的“第三代遺傳分子標志”。SNP是疾病易感性、藥物反應等個體間差異的主要決定因素［2］，被廣泛應用于疾病風險預測、個體化用藥指導等領域，也是腫瘤基因組學、藥物基因組學及營養基因組學等研究的重要工具。依照其在基因組中的位置分為:基因編碼區SNPs（coding-regionSNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（perigenicSNPs，pSNPs）和基因間SNPs(intergenicSNPs,iSNPs)。cSNPs比較少，變異率僅為周圍序列的1/5［3,4］，但由于它與蛋白結構和功能直接相關，長期以來受到更多關注。cSNP又可分為同義cSNPs(synonymouscSNP)和非同義cSNPs(non-synonymouscSNPs)。非同義cSNPs(non-synonymouscSNPs)密碼子變異可導致所編碼氨基酸的改變。同義SNPs改變密碼子但不改變所翻譯蛋白質的氨基酸序列，一般認為它不影響蛋白質結構和功能，因而被稱為“靜寂snp(silenceSNP)”，在疾病機理研究和遺傳分子標志篩選中往往被忽略。

然而，同義SNP真的是“沉默無聲”的嗎？是否僅僅是進化過程中，對環境壓力的適應和自然選擇而形成的“密碼子使用偏好”在基因組中的遺跡？情況并非如此，研究發現某些同義SNP與疾病風險相關，有些則影響藥物作用的特異性。例如角化粒（corneodesmosin）基因的同義SNP與牛皮癬發病相關［5］，ApoE基因和低密度脂蛋白受體相關蛋白6（Low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein6）基因同義SNP增加攜帶者阿滋海默綜合征發病風險相關［6～8］。

以往研究顯現，同義SNP或同義突變雖不改變編碼蛋白的氨基酸序列，但可能影響蛋白的表達水平，主要通過三種機理。

1影響翻譯效率

密碼子與其對應的tRNA決定翻譯速度，如果密碼子對應的tRNA的頻度高，則翻譯速率高。在自然選擇的過程中，生物體中高表達蛋白一般選擇使用頻度最高的tRNA及其對應密碼子，如變異產生罕見密碼子則翻譯效率降低［9］。同義密碼子的選擇和tRNA的頻度偏向性存在同步進化機制，即存在同義SNP與tRNA頻度的正反饋，使得二者相協調［10,11］。此種機制目前尚存在爭議，也有一些研究報道密碼子與翻譯效率沒有明顯關聯［12,13］。

2影響mRNA穩定性

由于同義SNP改變mRNA的核苷酸組成，影響mRNA的二級結構，進而影響其穩定性。當mRNA中G/C含量增加，尤其是密碼子的第三位堿基由A/U被G/C所替代時，減少酶對富含AU基序的識別，降低酶降解機會，將增加mRNA的穩定性［14,15］。例如DRD2基因同義SNP（C957T）改變mRNA穩定性，增加精神分裂癥及酒精成癮癥的發病風險［16］。角化?；蛲x改變mRNA與DNA結合蛋白的親和力而影響其穩定性，增加牛皮癬發病風險［5］。

3影響拼接控制

同義SNP可產生隱含的拼接位點［17］或影響拼接控制元件，如外顯子拼接增強子（exonicsplicingenhancers,ESEs）、外顯子拼接寂靜子（exonicsplicingsilencers,ESSs）［18,19］，從而導致轉錄子的異常拼接。異常拼接還可能影響非同義SNP及氨基酸的使用［20,21］。這是目前受到廣泛接受的機制，有許多同義SNP通過此機制影響疾病發生的報道。例如APC基因（R623R,H652H,R653R）與家族性腺瘤樣息肉［22，23］、ATM基因(S706S,S1135S)與運動失調性毛細血管擴張癥［22］、CYP27A1基因(G112G)與腦腱黃瘤?。?2］、PAH基因(V399V)與苯丙酮尿癥［22］、TGFBR2基因(Q508Q)與馬凡氏綜合征等［24］。

值得一提的是最近Sauna等對多耐藥基因（multidrugresistance1,MDR1）的研究。MDR1編碼P糖蛋白（P-gp）參與多種藥物的吸收、分布、代謝、排泄及毒性反應(ADEMT)［25］。1236C>T/2677G>T/3435C>T是中國、印度及日本等人群中最常見的單倍體型，分布頻率可達31%～49%［26］，其中1236C>T,3435C>T為同義SNP和2677G>T為非同義SNP。此單倍體型攜帶者對環孢素A及維拉帕米的逆向轉運能力降低［27］。依照生化經典理論，“蛋白質一級結構決定空間結構,氨基酸序列相同，一般不改變蛋白質空間結構和功能。”最初推測P-gp的功能改變由其非同義SNP（2677G>T）所決定。Kimchi-Sarfaty等采用瞬時表達系統表達了多種MDR1變異體，用流式細胞儀分析不同變異體蛋白對熒光標記底物的轉運能力。結果發現單獨非同義SNP并不改其轉運能力。而且此單倍體型變異基因可轉錄完整的全長mRNA，蛋白表達水平及定位無變化，氨基酸測序完全正確。排除了因使用罕見密碼子導致蛋白翻譯速度、mRNA穩定性及拼接異常等可能機制。那么是否蛋白質的結構發生了改變？隨后，采用結構特異性抗P-gp抗體（UIC2）,發現單倍型和野生型P-gp存在抗體反應性的差異，證實存在細微的空間結構改變。這無疑對“同義SNP不影響蛋白結構和功能”的傳統觀念提出了挑戰。

蛋白質在翻譯過程中同步進行肽鏈折疊，肽鏈內已折疊和非折疊區相互接觸和相互作用，隨時影響瞬時及最終的蛋白質結構［28］。蛋白質折疊除受到熱效學控制（thermodynamiccontrol），即傳統的氨基酸組成決定相互間的能量關系，決定蛋白質折疊取向和決定空間結構。還存在動力學控制（kineticcontrol）機制，恰當的翻譯速度和翻譯停頓可能是保證正確折疊的必要條件［29］。同義SNP改變密碼子選擇和使用，可能影響蛋白折疊的動力學控制，1236C>T/2677G>T/3435C>T單倍體型可能正是由于密碼子的替換，改變了翻譯速度或節奏，引起P-gp蛋白局部結構的細微改變，改變對底物或調節分子的親和力。

同義SNP對蛋白結構的影響盡管看似微弱，但對其功能及相關臨床表型可能產生不可忽視的作用。尤其是多基因復雜性疾病，每個相關基因在發病所起作用都較微弱。疾病是多種變異效果的相互疊加和協同效應的結果。同義SNP的研究不僅從理論上對蛋白質空間結構的決定條件提出了新的觀點，同時使我們重新審視以往在基因多態性篩查、分子標志鑒定中所忽略的同義SNP，它占編碼區SNP的一半數量，極可能是被長期漠視的一個寶藏。對其進行認真研究和開發，有助于了解疾病發生機制和病因，并發現新的分子標志，應用于疾病風險預防及個體化用藥指導等領域。