ECM修復研究論文

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【摘要】研究自制的兔耳廓脫細胞軟骨基質（extracellularcartilagematrix，ecm）修復骨缺損的特點及機理。［方法］采用新西蘭大白兔共40只，隨機分A、B兩組，在其兩側橈骨干中段制作5mm的骨缺損模型。右側作為實驗側，缺損區A組植入脫細胞軟骨基質復合自體培養骨髓干細胞，B組僅植入脫細胞軟骨基質，左側為空白對照。分別于2、4、6、10周處死動物，標本行放射學及組織學檢查。［結果］X線及組織切片均證實復合體在6周時已有致密骨組織形成，10周時已有新生髓腔生成。［結論］表明兔耳廓脫細胞軟骨基質與自體骨髓干細胞復合體有良好的成骨能力，有引導組織再生、防止骨不連作用。

【關鍵詞】骨缺損骨移植脫細胞軟骨基質軟骨細胞

Abstract：［Objective］Thecharacteristicsandmechanismofthebonedefectrepairwiththeusingallogenicextracellularcartilagematrix（ECM）werestudied.［Method］FortyNewZealandwhiterubbitsweredividedintothreegroupsatrandom:AandBontherightside,thedefectwascoveredwiththecomplexofECMandautologousmesenchymalstemcells（MSCs）,theECMinthegroupsAandB,respectively.Thedefectsontheleftsideservedascontrolscorrespondingly.Therabbitswerekilledatthe2nd,4th,6th,10thweek.Samplesweretakenforradiologicalandhistologicalstudies.［Result］Intheexperimentalsidesthebonedefectswerehealed.Newboneappearedinthewayofintramembranousossificationandentochondrostosis.［Conclusion］ItissuggestedthatthecomplexofECMandautologousMSCshastheeffectsonguidingboneregenerationandpreventingfromnonunion.

Keywords:bonedefect;bonegrafting;extracellularcartilagematrix（ECM）;chondrocyte

臨床上長段骨缺損造成的骨不連較常見。骨缺損的修復材料很多，自體骨移植修復效果雖理想，但其來源有限。如何選擇一種材料來提高骨缺損修復效果，這是人們正在研究的重點。作者采用經膠原酶-去垢劑處理，去除抗原性成分的兔耳廓軟骨復合自體軟骨細胞植入兔橈骨干缺損，分別于2、4、6、10周觀察骨的修復能力。具體報告如下。

1材料和方法

1.1材料

新西蘭大白兔（購自華中科技大學同濟醫學院動物試驗中心），共40只，均為雄性，月齡為2~3個月，體重2.0~2.5kg。

1.2兔耳廓ECM的制備

切取2月齡兔的雙側耳廓，去除皮膚及軟骨膜，新鮮軟骨用PBS液沖洗3遍，采用去垢劑酶四步法〔1〕對軟骨進行脫細胞處理：（1）將新鮮軟骨置入Tris低滲緩沖液中，緩沖液中含有蛋白酶阻斷劑，4℃恒溫震蕩48h；（2）1％TritonX100、Tris緩沖劑抽提48h后，以蒸餾水連續沖洗24h；（3）DNaseⅠ和RNaseⅠ混合后，在37℃下消化2~4h：（4）再次用1％TritonX100、Tris緩沖劑抽提48h，取出后所有標本用DHanks生理鹽溶液4℃下徹底清洗24~48h。完成了對軟骨脫細胞處理后，置于無菌PBS液中保存備用。

1.3骨髓干細胞的分離和培養

按Kadiyala等〔2〕描繪的方法，取健康2個月齡新西蘭大白兔，氯胺酮和異丙嗪肌注麻醉，雙側髂部剪毛后碘伏消毒，在無菌條件下用16號骨穿刺針在髂骨翼外側穿入骨髓腔，注射器針管內預先含有0.1ml肝素鈉生理鹽水，抽吸骨髓液6ml移入Mc5A培養液5ml的離心管內混勻，1500r／min離心5min，棄上層脂肪和上清。加入適量無血清培養液懸浮細胞，緩慢移入盛有比重為1.077淋巴細胞分離液的離心管中（細胞培養液與細胞分離液之比1∶1），以2000r／min離心20min，小心吸取界面的有核細胞乳白層，加入Mc5A培養液10ml，制成細胞懸液移入25cm2培養瓶中，置于37℃5％CO2及飽和濕度培養箱中培養，倒置顯微鏡下觀察呈形態一致的均質的分布均勻的細胞，可用于MSCs收集和移植〔4、5〕，計數每瓶中含有細胞1.5×105個／ml時，收集的骨髓MSCs低溫存儲中。

1.4動物模型的制備

2~3個月齡的新西蘭大白兔40只，均為雄性，體重2.0~2.5kg，隨機分為2組，每組20只，在其雙側橈骨中段，咬去5mm橈骨造成骨缺損模型，右側作為實驗側，左側為空白對照，A組中右側缺損區植入脫細胞軟骨基質復合自體培養軟骨細胞，B組僅植入脫細胞軟骨基質，分別于2、4、6、10周處死動物，標本行放射學及組織學檢查。

1.5放射學檢查

術后第4、6、10周分別于同樣條件下拍X線片觀察骨缺損修復情況。因為ECM不顯影，如果出現密度增高影即表示有新骨形成。對12周的X線片根據骨缺損內生骨面積行X線等級療效評估〔3〕。100％為5分，75%~99％為4分，50%~74％為3分，25％~49％為2分，1%~24％為1分，0為0分。

1.6組織學觀察

分別于第2、4、6、10周各處死動物，取雙側修復的，將尺橈骨分離，福爾馬林固定1周，爾后分離出橈骨，以原缺損區為中心切取橈骨10mm，作為組織學切片檢查，HE染色。

1.7數據統計學分析

數據用x-±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2結果

2.1放射學檢查

A組實驗側（復合體側）：第4周時出現點狀陰影，部分出現毛玻璃陰影；6周時陰影密度增大，有大片鈣化，骨量增加；10周已完全骨性連接，大部分出現不規則骨髓腔，可見少量骨髓腔相通（圖1、2）。B組實驗側（ECM植入側）：4周后未見明顯鈣化影；6周時亦見少部分骨連接，鈣化影增寬；10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，一部分出現不規則髓腔（圖3、4）。C對照組10周時缺損區仍無新骨形成（圖5、6）（表1）。表1兔橈骨干骨缺損治療10周時X線片療效評分結果A組實驗側（復合體側）：術后2周可見編織骨和成團的軟骨細胞，炎性細胞較少，并可見絲團狀的纖維蛋白以及增生的小動脈，有纖維骨痂形成，新的骨小梁開始出現；4周時編織骨量增加明顯，呈灶狀；6周時出現大量新生致密的骨組織，編織骨逐漸吸收降解，極少數軟骨細胞與纖維組織充填骨缺損區、10周時形成皮質骨和成熟骨髓，伴隨骨痂生長，可見骨髓腔相通（圖7）。B組實驗側（ECM植入側）：2周時有較多軟骨細胞及纖維組織及少量炎性細胞；4周時出現少量新生骨，未見髓腔出現；6、10周時出現交織骨，有少許不規則髓腔，但仍見軟骨細胞（圖8）。C組對照組10周后大部分仍可見有缺損，少量地填充肉芽組織（圖9）。

2.3骨小梁形態計量分析

A組實驗側（復合體側）新生骨小梁面積（17.43±4.58）mm2，高于B組實驗側（ECM植入側）新生骨小梁面積（11.92±3.19）mm2，有顯著性差異，具有統計學意義（t=5.59，P＜0.05）；而A組實驗側和B組實驗側與C組對照側（8.25±5.33）的新生骨小梁面積相比較具有顯著性差異，具有統計學意義（t=6.68，P＜0.001；t=9.56，P＜0.05）。

3討論

3.1概述

骨缺損的修復方法很多，有自體骨移植、異體骨移植、人工骨移植等，最理想的修復方法是自體骨移植，但是受到供體的限制。近幾年來，長段骨缺損修復研究越來越多，用于細胞種植的骨移植材料可分為人工和天然兩種，人工材料具有較好的生物相容性、可降解性及可吸收性，但費用昂貴，降解率可塑性低，特別是其酸性代謝產物會降低聚合物周圍的pH值，從而影響細胞核組織生長〔4〕，還可以引起纖維化及可能發生周圍組織的免疫反應〔5〕；天然材料有同種異體骨、異種骨等，作者使用異體軟骨通過脫細胞處理后制作的細胞外軟骨基質（extracellularcartilagematrix，ECM）來修復兔的橈骨5mm缺損，觀察其修復的效果。結果表明：ECM復合骨髓基質干細胞（A組）效果最好，其次為B組，較差的為C組，說明ECM可作為骨缺損的修復組織材料，亦可作為細胞培養支架材料。

3.2ECM的組織結構

ECM只起支持保護細胞和維持滲透壓的作用。近年來，細胞外間質的研究發展非常迅速。現在研究認為ECM是個“蛋白信使”豐富的環境，并且軟骨細胞與ECM的相互作用調節了許多生物學過程，這包括了細胞的黏附、生長、分化及生存〔6〕。

ECM生物材料有以下優點：（1）經過去污劑酶四步法處理制作，去除了軟骨組織的細胞成分，從而去除了存在于有核細胞膜上的主要組織相容性抗原，避免了組織排斥反應。（2）ECM主要成分為膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖，這些成分有較好的親水性。（3）ECM具有一定生物活性，促進骨髓基質干細胞的增殖、分化等。本試驗中異體ECM在體內的轉歸有2種結局：（1）異體ECM部分吸收縮小，在復合自體骨髓干細胞的修復組織中，骨髓干細胞在材料支架中遷移、分化和增殖；（2）骨髓干細胞自身分泌一些活性物質，激發其向軟骨細胞及骨細胞轉化，從而形成新生骨組織。

3.3骨缺損研究發展方向

骨髓基質干細胞能夠向成骨細胞轉化，具有明確的成骨能力。但是單體內植入細胞并不能有效地形成新的組織，其主要原因在于以液態形式注入體內的細胞在局部微環境的作用下，無法保持局部有效濃度，導致新生組織數量下降。在組織工程化新生骨組織的發生過程中，生長因子不僅能夠發揮誘導成骨作用，也能夠促進種子細胞的增殖分化，直接推動骨組織的形成〔7〕。骨缺損移植ECM作為支架，其成骨來源于宿主骨周圍的骨膜〔8〕，成骨活動以軟組織侵入和形成骨吸收陷窩，陷窩內的破骨細胞和成骨細胞來源于移植骨質周圍的骨髓干細胞〔9〕，吸收和重建同時進行。陷窩逐漸形成管狀結構，周圍有新骨形成，可以觀察到活躍的骨誘導成骨現象。移植后4周可形成較為堅強的骨外痂，該結合部的主要愈合表面，特別是在骨移植早期為主要的愈合方式。

圖1A組實驗側（復合體側）：10周后標本顯示骨缺損已完全骨性連接，外形平滑，骨質比較堅硬圖2A組實驗側（復合體側）：10周時陰影密度增大，有大片鈣化，骨量增加，已完全骨性連接，大部分出現不規則骨髓腔，可見少量骨髓腔相通圖3B組實驗側（ECM植入側）：10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，周圍仍有少部分纖維肉芽組織圖4B組實驗側（ECM植入側）：10周時骨缺損處有較多的鈣化，骨量增加，均都部分骨性連接，一部分出現不規則髓腔圖5對照組：10周時缺損區大部分為纖維肉芽組織，無明顯新骨形成圖6C對照組：10周時骨缺損區顯示仍無新骨形成圖7A組實驗側（復合體側）：10周時形成皮質骨和成熟骨髓，伴隨骨痂生長，可見骨髓腔相通圖8B組實驗側（ECM植入側）：10周時出現交織骨，有少許不規則髓腔，但仍見軟骨細胞圖9C組對照組：10周后大部分仍可見有缺損，少量地填充肉芽組織目前公認的骨缺損模型為橈骨中段大于1.0cm階段性缺損。Johnson等〔10〕指出實驗性骨缺損需要在一些不利于骨生長的環境中進行，如果骨缺損超過骨干直徑3～4倍，即不能自行修復，因為骨局部肌肉覆蓋較少，紅骨髓含量少等。在短期內恢復骨的支撐作用，又可以經過一定時間的融合、再塑而實現與宿主骨相同的形態和功能。

本試驗的結果表明兔耳廓ECM與自體骨髓干細胞復合體或單純的ECM來修復兔橈骨缺損比空白對照組相比具有良好的成骨能力，說明ECM可以作為骨缺損修復的理想的修復材料，它的優點：取材容易，制作簡單，組織相容性良好，如果對此材料進一步深入的研究和在制作上進一步的改進，將大大地提高使用價值。

【參考文獻】

〔1〕CourtmanDW,PereiraCA,KashefV,etal.Developmentofapericardialacellularmatrixbiomaterial:biochemicalandmechanicaleffectsofcellextraction［J］.JBiomedMaterRes,1994,28（6）:655660.

〔2〕KadiyalaS,YoungRG,ThiedeMA,etal.Cultureexpandedcaninemesenchymalstemcellspossessosteochondrogenticpotentialinvivoandinvitro［J］.CellTransplant,1997,6:125126.

〔3〕TsuchidaH,HashimotoJ,CrawfordE,etal.Engineeredallogenicmesenchymalstemcellsrepairfemoralsegmentaldefectinrats［J］.JOrthopRes,2003,21:4455.

〔4〕SittingerM,BujiaJ,MinuthWW,etal.Engineeringofcartilagetissueusingbioresorbablepolymercowriesinperfusionculture［J］.Biomaterials,1994,15（6）:539540.

〔5〕SimsCD,ButlerPE,CaoYL,etal.Tissueengineeredneocartilageusingplasmaclerivedpolymersubstratesandchondrocytes［J］.PlustRecondtrSury,1998,101（6）:15801585.

〔6〕PlowEF,HessTA,ZhangL,etal.Ligandbindingtointegrins［J］.JBioChem,2000,275:2178521788.

〔7〕MusgraveDS,FuFH,HuardJ.Genetherapyandtissueengineeringinorthopaedicsurgery［J］.JAmAcedOrthopSurg,2002,10（1）:615.

〔8〕BauerTW,MuschlerGF.Bonegraftmaterials.Anoverviewofthebasicscience［J］.ClinOrthop,2000,（371）:1027.

〔9〕WangJ.Spatialorientationofthemicroscopicelementsofcorticalrepairbone［J］.ClinOrthop,2000,（374）:265277.

〔10〕JohnsonEE,SchmalzriedTP,ChotivichitA.Autogeneiccancellousbonegraftsinextensivesegmentalulnardefectsindogs［J］.ClinOrthop,1989,243:254265.