膠原在生物醫學中的作用

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1膠原作為生物材料的優勢

1.1低免疫原性

膠原作為醫用移植材料最重要的特點在于其免疫惰性,與其它具有免疫性(immunogenicity)的蛋白質相比,膠原的免疫原性非常低。特別是在膠原以膠原組織(tissue-based)和純化膠原形式使用時,這一優勢更為明顯。80年代對各種膠原產品的免疫原性進行測定時發現,所產生的免疫應答是由存在于膠原產品中的極少量的非膠原蛋白引起的。產生免疫性的另一原因是材料中存在著變性膠原,膠原的單根肽鏈比天然的未遭破壞的膠原螺旋分子表現出較高的免疫原性。

這可能是因為膠原受到破壞而變性時,將原來隱匿在內部的抗原決定簇暴露出來,從而引起了免疫應答。90年代以前,人們一直認為膠原沒有免疫原性。但后來的研究發現,膠原可表現出一定的免疫原性。例如,在制備哺乳動物膠原的單克隆抗體時,發現Ⅰ型膠原的免疫原性比Ⅲ型、Ⅴ型、Ⅵ型膠原低得多。將組織膠原的端肽(telopeptides),螺旋微區(domain),以及其它微區的免疫原性進行對比,發現端肽的免疫原性最強。因而,在制備可溶性膠原醫用產品時,應除去膠原的端肽。但對以組織基使用的膠原材料,則應保留端肽,目的是保存交聯位點,賦予組織材料所需要的完整結構。研究還發現用戊二醛交聯,可部分降低膠原材料的免疫原性。

1.2細胞—基質間的相互作用

膠原基材料另一優勢,在于它與宿主細胞及組織之間良好的相互作用。膠原基材料無論是在被吸收前作為形成新組織的骨架,還是被吸收同化進入宿主,成為宿主組織的一部分,都與細胞周圍的基質有著良好的相互作用,表現出相互影響的協調性,并成為細胞與組織正常生理功能整體的一部分。膠原可促進不同類型細胞生長,如Ⅰ型膠原可用于培養各種不同類型的細胞。細胞與膠原之間的相互作用機理取決于細胞的類型,相互作用可能直接通過特異性的受體,但更常見的是由特殊的粘結蛋白,如纖維結合素等中介的相互作用。膠原基材料的另一特點,是除了可增加細胞的粘結外,還能改善細胞的生長、分化與移動。膠原在與其它胞外基質分子的綴合中,具有可支撐多種不同類型細胞的生長與功能的特點。這一能力促進了膠原基生物材料在多個領域的應用。

1.3與血小板的相互作用

膠原對血小板有凝聚作用,可形成血栓阻止流血,因而可用于制備凝血材料。血管壁的內皮層發生損傷流血時,靠近受傷部位的血小板便與內皮下的結締組織直接接觸,進而使血小板活化、釋放出顆粒成分,進行凝血。正因為如此,在使用膠原或膠原復合物制備心血管裝置時,要特別注意防止或抑制、隱匿膠原與血小板之間的相互作用。目前采用的方法之一是用戊二醛對膠原醫用裝置材料進行交聯,這種方法可減少膠原與血小板間的相互作用。現更多采用的方法是用聚合物交聯以覆蓋膠原表面,或用如肝素的化合物涂敷膠原表面,阻止其與血小板的作用。

1.4纖維的再形成性

經純化的可溶性膠原在膠原基生物材料中占有重要地位,其主要性質之一是可在體外再次形成與天然膠原纖維相似的有序纖維狀結構。在制備可溶性膠原時,雖然已通過酶的作用除去了膠原分子的端肽,但可溶性膠原在體外的再形成過程仍然存在。使用可溶性膠原的另一優勢在于其免疫原性被大大減弱,又能形成纖維,獲得了與原有結構相似的堆砌,從而有利于細胞———基質間相互作用的分子過程。利用可溶性膠原的纖維再生性質,還可將其制備成適合于移植用的膏狀注射物或海綿等結構。

1.5機械性能

以組織基膠原使用的膠原裝置,固有強度是其重要的優勢。生物體中,膠原是為結締組織提供強度的主要蛋白成分,因而可能在廣泛的范圍內滿足肌體對機械強度的要求。膠原纖維具有很高的機械強度的重要原因,在于膠原中的天然交聯,在制備組織膠原裝置時應盡量加以保留。制備過程中,還應盡可能地保留組織基膠原中的蛋白多糖,以維持膠原固有的卷曲。膠原的這種結構特點有利于組織在受到外力作用時能量的耗散,使膠原避免破裂。

2不同形式的膠原基生物材料

以膠原為主要或唯一組分制備醫用材料,已有大量的報導與專利。雖僅是部分摘錄,但也已表明膠原基產品在多個醫療領域應用的可能性。其中一部分已進入人體實驗、部分限于動物實驗,有些已步入商品階段。膠原在以上某些領域使用時,因需求量或因其它替換材料的價格低,成為商品的可能性較小。但膠原的多功能性,特別是膠原可與其它重復物因子一起成為復合體的特點,便獲得了合成高分子不可替代的應用機會。

3膠原基生物材料的制備

3.1不溶性膠原

主要指以膠原組織基形式和由碾碎的膠原制備的生物醫用膠原材料。這種膠原材料的制備比較簡單,但要把膠原的免疫原性降低到最低限度,還需要一些其它的處理。例如,可用無花果蛋白酶對膠原進行溫和處理,除去非膠原性蛋白質。處理時要防止膠原的降解,并注意不能因除去蛋白多糖而增加了膠原裝置的剛性,損害膠原固有的綜合機械性能。在用膠原組織直接制備生物裝置時,須盡可能縮短從屠宰到制備期的時間間隔,以減少膠原的自溶性與降解程度。

3.2可溶性膠原

用酶處理已絞碎的皮膚組織,通常使用的是酸性蛋白酶———胃蛋白酶。胃蛋白酶可切去膠原肽鏈端肽的交聯區,而且在胃蛋白酶作用所需的酸性pH條件下,膠原組織將發生膨脹、進而溶解。再提高反應體系pH至中性,使胃蛋白酶失活,或在對膠原進行純化的過程中除去胃蛋白酶。實驗室中最常見的純化方法是:在酸性或堿性pH條件下,用NaCl對膠原進行分級沉淀。酸或堿處理也可用來制備可溶性膠原,缺點是這種方法易引起膠原螺旋區結構的斷裂,而且不能有效地除去端肽;而酶處理卻可通過降低非膠原污染物或從膠原分子上除去端肽,從而降低膠原的免疫原性。

3.3增強膠原基材料的強度

天然的膠原組織都有很高的強度,但是當膠原基裝置由可溶性膠原制備時,強度則很低。因而通常采用交聯,在膠原分子間引入新的化學鍵,以使產品獲得適當的強度而用于特定的情況。交聯的另一目的,是減少天然的、未經處理的膠原基體的免疫原性。此外,還可用交聯來控制膠原基生物材料的使用壽命,交聯在制備實用性的膠原基生物材料中具有十分重要的作用。對膠原進行交聯可采用物理交聯與化學交聯兩種途徑。在對膠原進行交聯處理時,不僅要考慮所用方法的交聯強度,更重要的是要考慮所用方法產生的穩定性、毒性、趨鈣化以及抗酶降解性能等。

可使用的化學交聯劑有:甲醛、雙醛淀粉、戊二醛、其它雙醛、二異氰酸酯(特別是六亞甲基二異氰酸酯)、水溶性碳化二亞胺、脂肪族環氧化物、氰尿酰氯、?；B氮,以及由染料中介的光氧化反應等。與化學法相比,物理法的通用性較差,僅限于對純化膠原重組產品的交聯處理。物理交聯法的優點是沒有引入任何有毒物質。已有研究表明,采用高能輻射、紫外輻射、干熱處理等都可十分有效地實現某些反應,而且不會在蛋白分子中引入新的基團,只是作用機理還待研究。

4膠原基生物材料的應用

4.1心臟瓣膜

用機械瓣膜置換第一大動脈和左房室瓣膜的首例手術始于60年代初,不久便引入了大主動脈的同種移植瓣膜。之后,由于研制出了組織狀膠原基裝置商品,為特定的患者提供了能有效代替機械裝置的多種異種移植,豬的大主動脈瓣膜是使用最廣泛的天然組織心臟瓣膜的替代物。心包裝置主要由牛心包組織構成,切割牛的心包組織并將其排列成心瓣狀,主要為三小葉狀,并與天然的瓣膜結構相近。與大主動脈瓣膜相比,主動脈瓣前尖的厚度較大,而且聯結的輪廓清晰。這些裝置的膠原結構輪廓分明,在加工過程中也出現了與豬瓣膜相似的變化,所有組織基瓣膜都經過戊二醛的交聯化處理。為了避免產品過度硬化,戊二醛的使用濃度應比較低。

這兩種膠原基醫用裝置的主要優點是:強度高、耐久性長。雖然它們也會隨著時間的推移而出現變質現象,但變化速度緩慢,不會象機械裝置發生突然損壞。生物瓣膜的另一突出優點是引發血栓栓塞并發病的頻率比較低,患者不必進行長期的抗凝治療。在目前對心血管疾病的治療中,常同時使用生物型與機械型的裝置,到底選擇那一種裝置取決于患者的特定情況。比如為了避免抗凝治療,妊娠中的婦女傾向于使用生物型裝置,因為用于抗凝治療的藥物?？赏ㄟ^胎盤進入嬰兒。生物型裝置的缺點之一是植入人體后的鈣化問題,據統計,使用生物型裝置,易發生的事故中,86%是因鈣化所致,而且大部分起因于鈣化和瓣尖撕裂的雙重作用。鈣化一般隨著移植后時間的延長而增加。

在大多數患者中,鈣化在移植3年后便明顯起來;但在某些患者身上,移植后歷經10年還沒有任何癥狀。一般而言,組織基膠原瓣膜在頭10年使用期內性能良好?，F在,材料學家正竭力合成新的醫用瓣膜材料,目的是大幅度延長材料的使用壽命,減少二次手術,減輕患者痛苦。

4.2血管修復

由于心血管疾病日益增加,對替換血管裝置的要求越來越多。因手術需求不同,則需要不同直徑的裝置,如直徑小于1.5mm的微動脈置換器,這種置換操作需在顯微鏡下進行;可在一般手術條件下進行的直徑為1.5~4mm的小型心血管置換器;以及大直徑置換器等。目前,在胸、腹及一些外周手術中,則使用了一些由合成材料聚酯制備的性能良好的大直徑裝置。

對生物材料在這一領域使用的要求主要是制備小直徑置換器,例如,對于冠狀旁路手術來說,極有價值的途徑是采用自身隱動脈或乳動脈。但約有30%的患者,因不能采用自身材料,就需要其它生物材料。生物組織基心血管裝置的主要優勢是直徑小于5mm的心血管置換器,與合成材料相比,生物材料的多樣性為改善置換器的性能提供了有利條件。合成的生物組織基這兩類心血管導管都已被用于血管的替換。如經過改性和穩定化處理的生物導管,象臍靜脈導管、膠原導管等。但天然組織基裝置多數缺乏耐久性,如用牛動脈血管進行修復,就因其耐久性差,以及動脈瘤擴張問題而導致失敗。

與用合成的生物醫用材料制備的裝置相比,膠原基裝置還具有感染性低、宿主組織能向裝置中滲入生長而不需要高密度孔結構,以及可與天然血管在物理性質上較好的匹配等優點。

4.3可溶性膠原

膠原經純化后可制成注射膠原。這類膠原產品的優勢在于它的非免疫性、可再次形成與天然膠原纖維相似的纖維結構,并與宿主細胞和其它結締組織成分保持正常的相互作用?？扇苄阅z原在適當的緩沖液中,加熱至體溫時,便可在組織中原位形成纖維,或在進入組織之前形成纖維。在后一種情況下,膠原溶液還應保持適當的流變性能,以使其能以液體形式注入組織的指定部位,再形成不溶性的纖維。這種方法對軟組織的擴增、恢復,特別是對矯正各種皮膚斷面缺陷非常有用,還可用于食管括約肌聲帶的修復、牙周方面的治療。

4.4創傷、燒傷修復材料

膠原敷料有多種形式,如膜片、海綿狀及粒狀等,應能重新溶解,能吸收創傷滲出液,可與宿主細胞外基質相互作用,以促進細胞在新結締組織上的粘附、移動、生長和沉積;能誘導分化、誘導成纖維細胞的趨化性,延遲傷口收縮,加速創傷修復。本世紀初在燒傷的治療中使用了天然豬皮和羊膜,但如今更著重于重組形式的膠原,即膠原經純化處理變為可溶性膠原后再制備成多種敷料。

對膠原基創傷、燒傷修復敷料的設計,開始是以創傷閉和,減少感染,降低體液損失為主。這類敷料的特點是具有可誘發正常真皮形成的能力。之后,則對材料進行改性,以降低其免疫原性;或用粘多糖(氨基葡聚糖)替代部分膠原、改變其降解速率;控制敷料的厚度和孔徑,促進組織向內優化生長。對由Ⅰ型、Ⅲ型膠原和粘多糖組成的,未經戊二醛交聯的創傷敷料,還采用脫乙酰殼多糖改善其機械性能,提高治療效果。也可用Ⅰ、Ⅲ型膠原、彈性膠原或溶解性的彈性膠原肽鏈組成混合物,形成復雜的結締組織基質,再補充抗生素、透明質酸、纖維結合素和肝素增加劑,這些補充材料可促進創傷的愈合。

最近的研究中,還向基質中添加成纖維細胞生長因子、血小板衍生物生長因子和表皮生長因子等,這些生長因子都可有效地促進創傷愈合。

4.5膠原止血劑

膠原與血小板作用后,引起后繼的與血液聚集相關聯的一系列過程的進行,從而可迅速凝血。作為止血劑使用的膠原可以是粉狀、片狀及海綿狀等多種物理形態。與膠原類止血材料相競爭的有纖維素、明膠和纖維衍生物,其優勢是價格較低。但研究表明,膠原的止血效果明顯。用無花果蛋白酶除去牛腱不溶性膠原中的非膠原性蛋白質,再將其在酸性介質中分散并形成膨脹的纖維體,然后經冷凍干燥成為海綿狀,再用0.15%的甲醛處理,便使其具有使用穩定性和回彈性的特點。有人還采用牛皮真皮制備了“微晶”型膠原,實驗結果表明,這種產品比重組膠原在誘導絮凝的產生上更有效,因而止血作用更強。膠原止血劑在治療細胞組織器官如肝或脾的創傷上效果更明顯。由于這些組織一般缺乏結締組織的支持,在出血、滲出、細胞表面的修復過程中,十分需要纖維蛋白構架維持穩定。在這種情況下,使用膠原基止血劑可減少這些組織中血液的流失。

4.6明膠

明膠是膠原經溫和而不可逆的斷裂后的主要產生,明膠與膠原具有相似的氨基酸組成。據《中藥大辭典》記載,明膠具有“滋陰潤燥、止血消腫”之功,可治“虛勞肺痿,咳嗽咯血、吐衄、崩漏、跌撲損傷、癰腫、燙傷”;《本草匯言》載“黃明膠,止諸般失血之藥也?！c阿膠通用,其性平補,宜于虛熱者也。如散癰腫,調膿止痛,護膜生肌等?！弊罱难芯勘砻?明膠,特別是水解明膠,對多種皮膚病均有治療作用,其用于手足皸裂、皮膚搔癢病、魚鱗病等皮膚病,效果非常顯著。當水解明膠結合藥物配伍使用時,能夠更要效地治療某些并發性皮膚病。水解明膠在治療中未發現任何刺激性與副作用,它能滋潤皮膚、修補和促進傷口愈合。此外,水解明膠在內科病學中也有用武之地,對慢性胃炎、消化胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍有更佳的治療效果。

5展望

迄今為止,膠原基醫用材料的絕大多數均取材于動物,主要是牛。由于安全性問題和免疫原性及感染性疾病的傳播(如牛海綿狀腦類),人們對使用外源膠原懷有疑慮。共識是來自人體的膠原的生物相容性、生物功能性均優于動物膠原。人體膠原最可靠的來源是子宮,但在制備和使用人體膠原組織時,還需要對病毒和其它傳遞性的感染劑進行嚴格測試。隨著生物工程技術的發展,人類可采用重組DNA技術,進行人體膠原的表達與純化。即在建立能獲得大量的、價格低廉的重組膠原產品的可行方法后,大大促進膠原生物材料的充分開發與利用。雖然許多外源基因已在多種重組的宿主———載體系統,如細菌、酵母菌、桿狀病毒、哺乳類及其它體系中得以表達,但形成功能必膠原分子的表達則十分困難。這是因為從膠原的mRNA翻譯成膠原分子后,還需經過復雜修飾加工過程。

該過程需多種酶的參與(詳見“膠原的生物合成過程及其調節”),而表達膠原基因的宿主體系常常不產生這些酶,使分泌后膠原分子的后修飾加工過程困難化。建立一個能使膠原蛋白高水平表達的載體系統非常重要,這個載體須帶有合適的啟動子、信號肽、能傳染或轉化多種上宿主感受態細胞、并包括脯氨酰-4-羥化酶基團,此酰能將脯氨酰殘基在膠原重復結構G-X-Y的Y位羥基化成4-羥脯氨基酸,對膠原的穩定十分重要。制備人體膠原分子的另一方法是采用轉基因動物,如讓轉基因牛的乳汁中含有人的重組膠原。其方法是將牛奶蛋白的專用啟動子與膠原、以及與膠原后修飾相關的酶基因進行體外重組,再用微量注射法將重組注入受精的卵母細胞或胚胎干細胞中,最后將這些細胞移植入替代母親中。

用以上兩種方法一旦獲得了首代產品,基因重組法在生產一系列的第二代產品時就有了靈活性和很大的潛力。人們可應用在膠原的結構、功能、調節上已有的豐富知識,特別是其與生物體系相互作用的相關知識,創造出特定的分子和生物材料,它們具有增強了的,或降低了穩定性、免疫性、止血能力及特異性結合能力。由此還產生其它的兩個可能性,一是設計和表達一個完全與天然蛋白質類似的產物;二是創造出一個全新的、增強了生物功能的生物材料。對膠原基產品的進一步設計與制備也可與細胞素或生長因子相結合。細胞素和生長因子在創傷的愈合中十分重要,因為組織的修復過程涉及到細胞、基質及生長因子間不斷的相互作用。

結合生長因子、轉化生長因子β(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)以及表皮生長因子(EGF)等,它們都具有加速傷口愈合的作用。采用生物工程,把這些生長因子的基因拼合成重組體,可使基因工程化的生物材料具有所期望的生物活性。由上可知,為了使未來的膠原基生物材料具有最好的生物相容性,要考慮很多因素。將重組DNA技術及我們對于膠原和重組修復的知識結合起來,將會加強具有特定設計性質的膠原基生物材料的生物活性,使其與組織的環境相適應,產生更好的相互作用,促進其應用。