骨骼肌細胞腦內移植探索

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腦移植是目前治療巴金森病的重要手段之一[1，2」。這一治療能否成功的關鍵是移植物能否在被移植的腦組織內長期存活并能不斷表達化學遞質多巴胺或其前體。因此，選擇合適的組織細胞作為移植物對實現這一目標十分重要。近10余年來許多學者〔，一5」將各種不同組織細胞，如神經細胞、膠質細胞、皮膚細胞以及內分泌細胞等，植人大鼠腦內進行實驗研究?，F已有報道說明，移植胚胎腦組織細胞及自體腎上腺髓質細胞可在受體腦內有較長的存活期[6j。但用這些細胞進行移植，都存在一定問題川。如自體腎上腺髓質細胞移植的患者自身會受到較大打擊，且細胞在腦內存活受限制;用胚胎腦移植除了受免疫排斥外，還有很大的倫理道德問題?，F在發現，自體骨骼肌細胞具備作為移植物的優越性困，即:該細胞成熟后不再分裂、取材容易而對患者打擊很小、培養易存活、易于接受外源性基因而容易改變遺傳特點等。對于用骨骼肌細胞進行腦內移植能否存活及是否有不良影響的研究在國內尚未見報道。本研究擬將對這一問題進行探索，以求為用骨骼肌細胞進行腦內移植治療包括巴金森病在內的神經系統疾患提供實驗依據。

材料和方法

將新生2一5d的SD大鼠麻醉后取出四肢骨骼肌，剪碎，用胰酶及膠原酶共同消化后制成細胞懸液。用Percoll梯度法純化細胞，以1xl護細胞密度放人35mm培養皿中，經過5~7d的培養，使其中的干細胞(stemeells)發育為成肌細胞(myoblasts)和肌管細胞(myotubes)。部分培養皿中，加人熒光染料Diz(3.3，一dioctadeeyloxaearboeyanineperehlorate，M.p.Ine)以供原代肌細胞吞噬并被著色。將培養的成肌和肌管細胞按2:3比例混合后[0]，以大致lx106細胞數分兩點植人到體重220~2509的SD大鼠腦內一側紋狀體中，總量為15川。共移植大鼠38只，其中有4只所用移植細胞為被DII染色的肌細胞。移植后動物分別存活2周(n=6)、4周(n=8)、8周(n=8)、16周(n=8)、6個月(n一8)和12個月(n一4)，將動物經升主動脈先灌注0.lmol/L磷酸緩沖液(PBS)Zooml，再灌人0.lmol/LPBS(pH7.4)配制含4%多聚甲醛和15%蔗糖的固定液。灌注后立即取腦并作冰凍額狀切片(厚20拌m)。切片分3組，一組分別用抗橫紋肌動蛋白和肌紅蛋白抗體(DAKOCo.I-td)孵育12一24h(4c)，并用ABc法染色(試劑盒由vector公司提供)，再用Nissl法復染。其他兩組切片分別用Nissl法及HE染色。普通及熒光顯微鏡下觀察并記錄結果。另外將存活8周(n一2)及16周(n-2)的動物不經任何灌注直接斷頭取出腦內移植物，經胰酶消化后按上述體外培養方法重新進行培養，并觀察記錄其存活、生長情況。

結果

1.原代骨骼肌細胞體外培養

在倒置顯微鏡下觀察原代骨骼肌細胞體外培養狀況，發現在培養的前3d，這種細胞以成肌細胞的形式存在。細胞小，呈梭形。3d后細胞開始有排列現象，并逐漸形成管狀，細胞與細胞相互融合，此期細胞稱肌管細胞(圖1)，有時還可見到這些細胞有輕微的收縮現象。培養細胞經用抗橫紋肌動蛋白或肌紅蛋白的免疫組織化學染色后發現其免疫陽性細胞數占培養細胞總數的90%以上(圖2)。這些免疫陽性細胞呈明顯橫紋肌特征，即細胞內有多個細胞核。

2.移植區的組織學檢測

2.1經免疫組織化學染色的觀察:對移植后分別存活2周、4周、8周、16周及6個月的各例動物腦切片行免疫組織化學染色，結果顯示全部動物移植部位均反應陽性(圖3)。應用抗橫紋肌動蛋白及肌紅蛋白兩種抗體孵育，結果無明顯區別。在經Nissl方法復染的切片上，發現在存活2周的動物的移植物周圍有少量膠質細胞增生，移植4周可見膠質細胞浸潤有所增加。移植前經nl處理的移植物在波長4“一550nm下用熒光顯微鏡觀察，顯現強紅色(圖4)。隨著移植后時間延長，各組動物的移植區均未見明顯縮小或擴大，亦未見腫瘤形成現象。另外，在存活12個月的4例動物中，其中2例腦切片免疫組織化學染色后移植區呈陽性反應，另外2例為陰性反應。

2.2移植區組織的體外培養:對移植后8周和16周動物腦內取出的移植區組織重行體外培養，發現原代肌細胞重新生長。但這些細胞生長緩慢，早期呈梭形，到第10d后才出現細胞排列現象。12d后細胞逐漸形成肌管細胞并開始相互融合。用抗橫紋肌動蛋白和肌紅蛋白抗體行免疫組織化學反應，可見這些細胞呈陽性反應(圖5)。

討論

本研究結果說明，新生大鼠的骨骼肌較易于在體外培養成活，它們可在培養一周內表現出由成肌細胞轉化為肌管細胞的發育過程。這與傳統的認識[l0〕相一致。這些原代肌細胞植人大鼠紋狀體后能存活超過6個月以上，有些可達一年，說明骨骼肌細胞是一種能在腦內長期存活的外源性細胞，這已在一些研究中得到證實叫。盡管能在腦內較長期存活，但植人的骨骼肌細胞并不在腦內繁殖而使移植區增大。這可能是由骨骼肌細胞核不含DNA而不產生有絲分裂所決定的。本研究中，存活8周與16周的移植物可被重新行體外培養，并同時再現從成肌細胞到肌管細胞的過程，說明能自我更新的骨骼肌干細胞在腦內能長時間存活，這提示被植人腦內的骨骼肌在某種情況下仍有再更新的可能。這一機制應更有助于延長骨骼肌在腦內的存活期。已有實驗證明[l‘〕，植人的骨骼肌與神經組織之間可能缺少血腦屏障，這有助于選擇骨骼肌作為腦內移植的細胞。還有若干實驗證明[9.’2〕，在體外培養成活的骨骼肌細胞，可以被轉人外源性基因并能得到較好表達。這些都說明骨骼肌細胞可能是一種非常有價值的、可作為行基因改造后作腦內移植的細胞。也就是說，骨骼肌細胞可能是基因治療某些神經系統疾患的有用工具。smith等〔‘習曾介紹過利用肌細胞移植治療某些肌源性疾病及代謝紊亂性疾病的成功經驗。另外一些報道表明，移植原代肌細胞對受體是安全的。如Law巨“習用成肌細胞進行肌肉移植，移植物可長期存活而未發現有腫瘤形成。Huard〔‘5〕將之對人移植后，經臨床追蹤觀察也認為是安全有效的。最近Jiao叫等也報道了將新生大鼠橫紋肌細胞經轉基因后，移植到大鼠腦內，可達至少6個月的存活期，本研究所見與其結果基本一致。這些結果為進一步研究對骨骼肌細胞轉人外源性基因，并作腦內移植使其在腦內表達，奠定了基礎。