解析異位種植結腸癌肝轉移

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結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年超過100萬人診斷為結直腸癌［1］，近年來其發病率在歐洲躍居第1～2位［2］，我國居第4位［3］。影響患者預后的主要問題是腫瘤復發或轉移，其中肝臟是結直腸癌血行轉移最主要的靶器官［4］。大約25％的患者在診斷結直腸癌時就已出現肝轉移［5、6］。手術切除結直腸腫瘤后仍有大約20％～50％的患者出現肝轉移，其5年存活率約10％～58％［7］。研究和建立結直腸癌肝轉移的動物模型，特別是具有高轉移率的肝轉移動物模型，對研究結直腸癌肝轉移的治療以及抗腫瘤藥物的篩選等具有重要意義。結腸癌肝轉移種植性動物模型主要有腫瘤細胞原位種植和異位種植，后者主要包括腫瘤細胞肝門靜脈注射（Intraportalinjection），脾臟種植（Intras－plenicinjection）兩種方式。雖然這兩種異位種植的?動物模型應用廣泛，關于它們形成結腸癌肝轉移效率及效果的認識還不統一［8］。早在20世紀80年代初就有學者進行研究，迄今為止已有多種結腸癌肝轉移異位種植動物模型報道，各具優缺點［9］。本研究對結腸癌異位種植動物模型肝門靜脈注射法和脾臟種植法的肝轉移率及其效果進行分析比較，為結腸癌肝轉移的預防和治療提供動物模型。

1材料與方法

1．1實驗材料

1．1．1實驗動物BALB／c小鼠共60只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，雌雄各半。體重20～25g，周齡6～8周。合格證號：SCXK桂2003－0003。在II級動物實驗室飼養。

1．1．2實驗瘤株BALB／c小鼠結腸腺癌細胞株（CT26）由美國引進，第二軍醫大學曹雪濤教授惠贈。常規培養CT26細胞于含10％胎牛血清的RP－MI－1640營養液。取指數生長期的細胞（圖1），消化吹打成單細胞懸液，952g（1000rpm）離心5min，棄上清液，加適量不含血清的RPMI－1640營養液調整細胞濃度至1×106個／mL。圖1對數生長期CT26細胞（10×10）

1．2實驗方法

1．2．1脾臟種植不保留脾臟法造模30只BALB／c小鼠稱重后采用腹腔內注射法麻醉，選用0．2％的戊巴比妥鈉，劑量控制在40～50mg／kg，小鼠麻醉成功后固定于手術臺上。常規皮膚消毒，取左側腋中線縱行切口進腹腔，長約1cm，顯露柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用0．2mL注射器（31G針頭）從脾下極進針，注入瘤細胞液0．2mL。拔針后酒精棉球按壓針眼約3min，促進瘤細胞經脾靜脈進入肝臟，查無出血，結扎脾血管及胃短動靜脈，切除脾臟，再次查無出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚，關腹。術后繼續在Ⅱ級動物實驗室飼養。

1．2．2肝門靜脈注射法造模30只BALB／c小鼠稱重后采用腹腔內注射麻醉，選用0．2％的戊巴比妥鈉，劑量控制在40～50mg／kg，小鼠麻醉成功后固定于手術臺上。常規皮膚消毒，取腹正中切口進腹腔，長約1cm，顯露肝門靜脈，用0．2mL注射器（31G針頭）從肝門靜脈與水平成30度進針，注入瘤細胞液0．2mL。拔針后酒精棉球按壓針眼約15min，查無出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚，關腹。術后繼續在Ⅱ級動物實驗室飼養。

1．3觀察指標

小鼠蘇醒后常規飼養，每日觀察其飲及活動情況，所有小鼠待其自然死亡，觀察生存期。小鼠死亡后均剖腹觀察腹腔內腫瘤生長情況，肝轉移率及肝臟成瘤情況，肺轉移率，切取肝臟轉移瘤置于10％中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，HE染色，進行常規病理組織學觀察。1．4統計學方法采用SPSS13．0軟件進行數據分析，卡方檢驗比較計量資料的組間統計差別，t檢驗比較計數資料的組間統計差異，P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1大體觀察

兩組小鼠接種后大體觀察相似。術后10d內BALB／c小鼠活動如常，體形無明顯變化。10d后個別小鼠開始出現攝食量下降，行動漸遲緩，消瘦，腹部漸膨隆，但尚無小鼠死亡。20d后小鼠進一步消瘦，腹部膨隆明顯，嚴重者出現死亡，第一只小鼠自然死亡時間出現在肝門靜脈注射組術后第22d。術后第30～55d，大部分小鼠死亡，最后一只死亡時間出現在脾臟注射組術后58d。

2．2肝轉移率

兩組分別成功接種30只小鼠，肝門靜脈組29只有肝轉移灶形成，1只未發現肝臟表面及切面轉移灶，肝臟轉移率為96．7％。脾臟注射組24只小鼠發現肝轉移灶，肝臟轉移率為80％。兩組間差異具有統計學意義（P＝0．044，表1）。

2．3肝轉移灶成瘤情況

肝轉移灶成瘤情況描述為：成瘤級別（高）－轉移灶布滿全肝；成瘤級別（中）－轉移灶占全肝1／2及以上；成瘤級別（低）－轉移灶占全肝低于1／2。肝門靜脈組成瘤級別高、中、低的小鼠數量分別為：14只、8只、6只；脾臟種植切脾組成瘤級別高、中、低的小鼠數量分別為：9只、6只、15只。兩組相比，肝門靜脈組肝臟轉移灶高轉移和中轉移例數均比脾臟種植組多（圖2）。

2．4生存時間

肝門靜脈組30只小鼠術后自然生存時間為22～55d，平均（34．6±8．7）d。脾臟種植切脾組30只小鼠術后自然生存時間為30～58d，平均（49．3±7．8）d。兩組間差異具有統計學意義（P＝0．000）。

2．5肺轉移率

兩組分別成功接種30只小鼠，肝門靜脈組18只有肺轉移灶形成，肺轉移率為60％。脾臟種植切脾組12只發現肺轉移灶，肺轉移率為40％。兩組間差異無統計學意義（P＝0．121）。2．6病理觀察鏡下見肝轉移灶癌細胞聚集成團，伴有癌結節形成，癌細胞形狀不規則，分化差，異形性明顯，胞質少，核大，深染不規則，核分裂像易見，符合低分化腺癌的結構特征（圖3）。

3討論

研究和建立具有高轉移率的結腸癌肝轉移動物模型一直是結直腸癌研究的重點和難點之一。目前，結直腸癌肝轉移動物模型大體包括三種類型，基因工程模型，自發或誘發模型和種植性模型，而種植性模型目前應用較為廣泛，根據種植的部位又可分為腫瘤細胞株原位和異位種植模型。原位移植模型是將腫瘤組織通過手術種植在體內的相應部位，從而進行相應部位腫瘤研究的方法。原位移植模型目前應用較為廣泛，但對于研究結腸癌肝轉移的治療特別是藥物篩選而言，原位移植模型所達到肝轉移率還是不能令人滿意。結直腸癌異位種植模型腫瘤接種部位包括皮下、脾臟、肝臟、門靜脈和腸系膜靜脈等。皮下種植模型因皮下生長的腫瘤通常易被纖維膜所包裹，難以發生腫瘤浸潤和轉移，表現出極低的腫瘤轉移率［10］。肝臟種植模型是將結直腸癌細胞或組織塊直接種植于肝臟而形成轉移瘤。據國外研究報道，此法小鼠肝臟成瘤率也僅為80％［11］。脾臟和門靜脈接種均表現出極高的肝轉移率，國外研究報道均為100％［12、13］，然而他們所用的是裸小鼠。本研究采用具有免疫能力的BALB／c小鼠對比脾臟和肝門靜脈種植法的肝轉移率及肝臟成瘤效果。本研究中，肝門靜脈法具有更高的肝轉移率及肝臟成瘤效果，而脾臟種植切除脾臟法在生存時間和操作難易程度上表現出優勢，兩者的肺轉移率差異無統計學意義。肝門靜脈法模型肝轉移率為96．7％，與國外報道結果相似［14］，比脾臟種植法高；同時在肝臟成瘤效果方面，肝門靜脈法有更多的例數出現全肝或肝臟一半以上的轉移，能更好地滿足各種檢測方法取材的需要；缺點為生存時間相對較短，并且實驗時應注意不能選擇過粗的針頭，否則容易引起拔針后門靜脈不容易止血而導致小鼠死亡，不能注射過多的腫瘤細胞，否則易出現肝血管栓塞造成小鼠死亡［15］。而脾臟種植切除脾臟法雖然肝轉移率稍低，但具有更長的生存時間及更易操作，較適合驗證周期較長的藥物實驗，同時，它很好地模擬了結直腸癌根治術后因血行轉移而發生肝轉移的過程。本研究中的兩種異位種植模型均能達到很高的肝轉移，重復性好，但屬于實驗性方法產生的肝轉移的最后階段，并非研究結腸癌肝轉移的全過程。在選擇動物模型中注意實驗方案選擇適合的模型。本研究建立并對比了兩種具有高轉移率的結腸癌肝轉移小鼠模型，肝門靜脈法在肝轉移率成肝臟成瘤效果方面更具優勢，適合對肝轉移率成取材要求較高的實驗研究；而脾臟種植切除脾臟法則更適合驗證周期較長的藥物實驗。