水稻根際固氮菌促生特點評論

時間:2022-06-28 11:53:05

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水稻根際固氮菌促生特點評論

植物根際促生細菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,簡稱PGPR)指存在于植物根際的能促進植物生長的細菌,具有固氮、解磷、產鐵載體及分泌植物激素等生理活性,不僅能夠促進植物生長,增加作物產量,還具有生物防治作用[1],因而成為許多學者研究微生物肥料的熱點對象。目前,RanjanPatra等研究鷹嘴豆根際促生菌的分類和促生特性,發現45%的根際促生菌屬于固氮菌屬,而且有些菌株同時具有2種或3種PGP(plantgrowth-promoting)特性[2]。Akhtar等研究PGPR菌株對扁豆的促生作用,發現PGPR菌株能夠抑制致病菌的生長而有效的促進扁豆生長[3]??蒂O軍等闡述了PGPR菌株誘導體系抗性和誘導體系產生忍耐力兩大促生機制[4]。部分PGPR可分泌有機酸溶解難溶磷酸鹽,或分泌胞外磷酸酶降解有機磷,提高土壤中水溶性磷的濃度,有效地促進植物的生長[5]。鐵是生物的必需元素,某些PGPR能合成各種對鐵具有高親和力的鐵載體來螯合環境中的鐵,供給植物細胞利用,改善植物的鐵營養,防治堿性缺鐵土壤植物缺鐵失綠癥的發生[6-7]。PGPR產生的鐵載體可與植物根際病原微生物爭奪有限的鐵營養,抑制病原微生物的生長,起到生物防治作用。許多PGPR可合成生理活性化合物,促進植物生長發育,或調控植物其他生命活動。植物生長激素(IAA)是由植物根際細菌產生的、研究最廣泛的植物激素,可增加根的長度,刺激根毛的增生和延伸,促進植物的生長和發育。對分泌IAA的細菌進行研究,有利于將植物促生菌應用于農業生產[8-9]。本試驗對分離自水稻根際的具有高效固氮、解磷、產鐵載體等功能的固氮菌[10]進行分類和培養,接種菌株到水稻幼苗根部,研究它們的促生特性,以期為特異性微生物肥料的開發利用提供試驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌株固氮菌(Azotobacterspp.)16株菌株可與水稻凝集素反應,對水稻根系具有一定親和性,由安徽農業大學微生物實驗室分離保藏[10]。

1.1.2水稻種子徐旱一號由安徽農業大學農學院提供。

1.1.3試驗培養基Hoagland半固體培養基、Ashby培養基、解磷培養基[10]、MKB液體培養基[11]、產生長激素IAA培養基[12]。

1.1.4實驗設備FOSSKjeltec8400全自動凱氏定氮儀;JA1103電子天平;LG10-2.4A高速離心機;VIS-7220型可見分光光度計。

1.2方法

1.2.1菌落形態特征觀察菌株菌液在Ashby固體培養基上稀釋涂平板、斜面上劃線培養3d,觀察各菌落形態特征。

1.2.2菌株生理生化特征研究[13]挑取各菌株單菌落,進行以下生理生化試驗:革蘭氏染色試驗、芽孢染色試驗、葡萄糖發酵試驗、需氧試驗、乙醇氧化試驗、固氮試驗、接觸酶試驗和類脂粒試驗。

1.2.3土壤栽培水稻幼苗在100mL小燒杯中加進100g土壤并滅菌,將水稻種子催芽后移栽至燒杯中,室外自然條件下積水培養3d得到成活的健康幼苗,將各菌株菌液按1%的接種量接種到水稻幼苗根部;在室外自然條件下培養30d;測定各類生長數據。

1.2.4半固體培養基培養水稻幼苗取Hoagland半固體培養基60mL于30mm×180mm試管中,無菌操作將催芽3d的水稻幼苗移栽試管中,3000lx光照培養箱中28℃培養15d,測定各類生長數據。

1.2.5菌株固氮能力測定Ashby培養基培養菌體,采用FOSS全自動凱氏定氮儀測定培養物中的全氮含量(參照FOSS程序)。

1.2.6菌株溶磷能力測定[14]取4mL解磷培養基分裝至試管中,接種固氮菌株,28℃160r•min-1搖床培養7d;取菌懸液至10mL離心管中,5000r•min-1離心15min;取1mL上清液到另10mL離心管中,加2mL水,加入1mL1mol•L-1H2SO4,再加1mL鐵-鉬酸試劑;混勻后反應15min,測定OD660。

1.2.7菌體產鐵載體能力測定采用MKB液體培養基培養各菌株,用CAS法[11]檢測菌株合成鐵載體能力,測定680nm波長[15]處的吸光值(A);另取2mLCAS檢測液與2mL未接種的MKB液體培養基上清液充分混勻,同法測定的吸光值即為參比值(Ar);數據處理,計算A/Ar值,參照標準得到結果。

1.2.8菌株分泌生長激素IAA能力測定參考文獻[12]測定菌株分泌生長激素IAA能力。

2結果與分析

2.1菌株菌落形態特征

菌株在選擇性平板上培養的菌落基本形態特征:形狀均為圓形,菌落表面光滑,顏色有透明狀、半透明狀、白色、乳黃色和黃色。

2.2菌株生理生化特征

菌株的各生理生化特征如下:均為革蘭氏陰性菌,均無芽孢和類脂粒,葡萄糖發酵、乙醇氧化結果均為陰性,生長均需氧,均有固氮能力,接觸酶試驗結果為陽性。根據菌株的形態特征和生理生化特性,參照文獻[16-18]等對細菌進行分類,可以把菌株簡單的分類鑒定到屬(genus)的水平。本試驗對分離自水稻根際土壤中的16株菌株進行分類,初步鑒定這16株菌株菌屬于固氮菌屬(Azotobacter)。

2.3固氮菌株對水稻幼苗生長的促進作用

經過半固體培養基培養試驗,測定16株固氮菌對水稻幼苗生長的影響,發現固氮菌株R-N00、R-N1110和R-N1112對水稻的促生長作用較明顯。與對照相比,接種菌株的水稻幼苗株高比對照分別增加23.48%、7.10%和17.97%,苗干重分別提高16.60%、9.23%和9.37%,根干重分別提高38.00%、30.00%和55.00%(表1);其他菌株作用效果與對照相比差異不顯著(略)。這些結果初步說明這3株菌對水稻的生長具有明顯的促進作用。土壤栽培試驗也獲得類似的結果,菌株R-N00、R-N1110和R-N1112對水稻的促生長作用很明顯。與對照相比,接種菌株的幼苗株高分別增加11.30%、8.79%和12.69%,苗干重分別提高93.25%、90.18%和97.21%,根干重分別提高71.25%、72.21%和74.92%。這些結果說明在近似自然條件下這3株菌對土壤中的水稻幼苗生長具有非常顯著的促進作用。本試驗采用半固體培養基和土壤培養水稻幼苗均是在實驗室小規模條件下進行,與田間試驗相比,有數據采集方便、影響因素少等優點,但也存在差異,需要進一步進行田間試驗以驗證所選菌株在田間的促生生理活性。

2.4固氮菌株的促生生理活性

本試驗采用單位mg•L-1來表示3株菌的全氮含量,凱氏定氮法測得3株菌的全氮含量分別為13.37、11.93和13.57mg•L-1(表2)。3株菌的溶磷能力分別為41.63、37.76和39.78mg•L-1。按照文獻方法測定這3株菌產鐵載體能力均達到5+,但此結果不能比較這3株菌的產鐵載體能力,因此本試驗將3株菌上清液稀釋后再測定,得到3株菌產鐵載體能力分別為16+、24+和64+,說明這3株菌產鐵載體能力均很強,菌株R-N1112產鐵載體能力最強,而R-N1112的促生效果較好。供試3株菌分泌IAA的能力分別為6.79、8.60和3.39mg•L-1,菌株R-N1110分泌IAA的能力較強,但其促生效果卻較低。

3討論

目前,國內外很多研究植物根際促生菌(PGPR)的報道[19-21],從各個方面研究PGPR及其作用機理。本試驗從半固體培養基栽培和土壤栽培兩方面說明,接種水稻根際促生菌后水稻幼苗的生長情況得到了不同程度的提高。并從固氮能力、溶磷能力、產鐵載體能力和分泌生長激素IAA能力這4個特性初步說明其促生機理。試驗測定3株固氮菌的固氮能力均在10mg•L-1以上,比同類報道的固氮菌的固氮能力[22]高很多;3株菌的溶磷能力均在35mg•L-1以上,比已報道的固氮菌株的溶磷能力[23]也強,但比溶磷PGPR菌株的溶磷能力弱[24]。已有文獻報道固氮菌也具有一定的溶磷能力[25],PGPR菌株同時具備固氮和溶磷能力,可改善水稻幼苗生長期的氮素和磷素營養[26],達到促進水稻幼苗生長的效果。CAS檢測法作為微生物鐵載體室內檢測的常規技術,但按照原程序,評價標準只有5級,比較粗糙;本試驗對該方法加以改進,稀釋菌液檢測3株菌的產鐵載體能力,最高能達到64+,結果相對客觀準確。這一結果說明產鐵載體能力強弱可以作為評價PGPR株菌促生效果的重要指標。菌株分泌的適量IAA可以有效地促進植物根系新陳代謝,有助于植物吸收土壤中的營養。本試驗測得的3株菌分泌IAA的能力不超過10mg•L-1,同時也發現產生較高濃度IAA的菌株反而抑制水稻幼苗生長(數據略),與文獻報道結果一致[27-28]。

試驗結果顯示,水稻PGPR菌株只具有某一種生理活性時,對水稻幼苗生長的促進效果較差或者極不顯著,但是,當水稻PGPR菌株同時具有三方面或者更多促生活性,促生效果將很明顯。本試驗采用對水稻具有親和性的特異性PGPR菌株,評價其中固氮菌R-N00、R-N1110和R-N1112各種促生生理活性,初步揭示這些菌株的促生機理,為研制水稻特異性生物肥料提供參考。