水產養殖多菌種混合培養分析

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摘要:研究多菌種功能微生物混合培養的條件優化，主要采取正交實驗方法，從培養基配方、pH、溫度、菌種接種等方面，研究各功能菌良好生長的混合培養條件。

關鍵詞:水產養殖；菌種；混合培養

使用微生態制劑整治養殖生存環境，成本低且沒有抗藥性以及藥物遺留等問題，因此成為21世紀養殖業的未來走向。當前，光合細菌、腸球菌等一些單一菌劑和復合菌是我國水產養殖中較為常用的菌劑。但從當前常用到的水產養殖菌劑來說，出現了多菌種菌劑種類少、菌劑耐鹽性能不理想等問題。單一菌劑限制了水產養殖水體的生物修復作用，因此在實踐應用過程中采用有一定耐鹽性能的多菌種制劑非常具有實踐性[1-3]。本文主要研究混合培養的條件與它們之間的生長關系。

1材料方法

1.1材料。1.1.1試驗材料在次試驗過程中選取的菌種有：英膜紅假單胞菌（Rspcapsulata）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）和假絲酵母菌（Candida）。1.1.2試劑Na2HP04•12H20、KH2P04、MgSO4•7H20、NaCl、NaOH、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、苯酚；蛋白胨、酵母粉、牛肉膏39、瓊脂粉、蒸餾水；結晶紫液、95%的乙醇、0.5%的番紅水溶液；PER引物、PER常規操作使用試劑和酶均購自TaKaRa公司。1.1.3儀器SPX智能生化培養箱，SW-CJ-IF超凈工作臺，YXQ-LS-75SII立式電熱壓力滅菌鍋，ZHWY211B回轉式搖床，eppendoff5417R高速離心機，578BR0349PCR擴增儀，UnitedGK-3300凝膠成像系統，CHZOBIMF200光學顯微鏡，V1TEK-32梅里埃微生物全自動鑒定儀，UV-2550紫外分光光度儀等。1.2方法。1.2.1三種功能菌的接種時間前后將地衣芽孢桿菌、假絲酵母菌與莢膜紅假單胞菌通過不同的接種時間前后融合到接種于光合細菌基礎培養基中，設置30℃、100r•min-1搖床下培養后利用分析其細胞生長數量篩查出3種功能菌混合培養的比較理想的接種時間前后順序。1.2.2三種功能菌混合培養的培養基優化在光合細菌基礎培養基條件下，分析不同碳源、氮源和無機鹽對3種功能菌混合培養的影響，在此期間利用因素輪換法進行。3種功能菌的最佳培養基方案是采用正交實驗進行篩查。1.2.3三種功能菌混合培養的條件優化利用正交實驗法，根據最佳培養基方案分析各種溫度、pH、溶氧等環境狀態下3種功能菌混合培養受到的影響，進而提出最優混合培養的理想條件。1.2.4三種功能菌混合培養的生長關系檢測3種功能菌通過混合培養以及純培養狀態下細胞生長數量，對其中2種培養條件中的細胞對數生長期時的繁殖代數（n）、生長速率常數（R）與世代時間（G）的區別，進而建立3種功能菌混合培養的生長關系。1.2.5生長量測定利用平板菌落計數法。在光合細菌培養基中對英膜紅假單胞菌進行培養，在營養瓊脂培養基中對衣芽孢桿菌進行培養，假絲酵母菌利用酵母菌培養基進行培養。1.2.6計算公式繁殖代數(n)=3.322(lgx2-1gx1)；生長速率常數(R)=n/(t2-t1)；世代時間(G)=1/R。式中，t1、t2為菌種進人對數生長期初期與末期的培養時間；x1、x2為菌種進人對數生長期初期與末期的細胞數量。

2結果與分析

2.1各類培養基對功能菌株生長的影響。實驗過程中，以光合細菌培養基作為對3種功能菌在培養過程中的伊始基，這也是為了研究由光合細菌為主的復合型微生態制劑。利用測定地衣芽孢桿菌在細菌肉湯培養基和光合細菌基礎培養基和假絲酵母菌在酵母菌培養液和光合細菌基礎培養基中的細胞生長量，進而掌握每個菌種中營養所需的重要區分。實驗結果表明，地衣芽孢桿菌以上兩種培養基中的生長狀態大致相同，都是以最快的速度生長，同時到9h實現最高生長數量；而假絲酵母菌在各種培養基狀態中的生長區別較為明顯：處于酵母菌培養基過程中進入到生長過程中非?？?，同進在24h后處于最大生長量（1.41×l09CFU•mL-1），當放到光合細菌基礎培養基時，通過12h之后菌體漸入到生長過程中，同時48h之后才達到最大生長量（4.7×107CFU•mL-1）。由此表明，假絲酵母菌和地衣芽孢桿菌相比下，地衣芽孢桿菌更適合在光合細菌基礎培養基中生長。2.2.3種功能菌混合培養的微生態關系地衣芽孢桿菌、假絲酵母菌與莢膜紅假單胞菌3種菌體間沒有拮抗關系。利用3種菌混合培養和自身純種培養的長征特點分析了將3種菌混合到一起進行培養，試驗結果顯示：地衣芽孢桿菌和另外兩株功能菌之間并不存在共棲關系，假絲酵母菌與莢膜紅假單胞菌之間有利于對方生長的作用。這是由于在進行混合培養過程中，英膜紅假單胞菌生長所需要的營養假絲酵母菌為其提供了小分子產物，反之英膜紅假單胞菌代謝也為其提供了生長所需的營養成分。對3種功能菌進行混合培養過程中，其細胞生長數量分別是3%～4%，明顯低于各純種培養過程中的接種量10%，3種功能菌的生長量莢膜紅假單胞菌生長量接近于純培養數值，另外兩種功能菌生長量不佳，呈現下降趨勢。由此可以看出，3種菌種之間對于一些物體可能有著競爭關系存在，也不排除是因為培養基pH的因素所致。2.3不同的接種時間前后對三種功能菌混合培養的影響。在此次實驗中分別設置3個實驗組：實驗1，在光合細菌的培養基中將3種菌株一起放入培養基中；實驗2，在光合細菌基礎培養基中先對莢膜紅假單胞菌與假絲酵母菌進行培養到48h時時再放入地衣芽孢桿菌；實驗3，先將莢膜紅假單胞菌培養到24h和48h時，再將假絲酵母菌以及地衣芽孢桿菌分別連接。在試驗過程中實時檢測以上3種功能菌各個接種順序下的細胞生長速度，檢測結果如圖1、圖2、圖3所示。實驗2的接種前后時間，3種功能菌在培養過程中都生長優良，同時培養時間到60h時都到達到了生長數量的最高值；但是使用實驗1的接種前后時間，地衣芽孢桿菌通過混合培養過程后，還沒有到72h時就已經進到了死亡過程，菌體大面積死亡；根據接種前后時間，假絲酵母菌在實驗3中的生長狀態不佳。生長曲線由圖3所示，夾膜紅假單胞菌在進行培養之后由于生長速度幾乎處于零，因為致使培養基中的pH呈快速上升狀態直到出現偏堿性，由于假絲酵母適合在偏酸性狀態下生存，因此阻礙了假絲酵母菌的生長。

參考文獻：

[1]謝航.水產養殖功能微生物的篩選與多菌種混合培養條件的研究[D].福州:福州大學,2005.

[2]尹苗.益生性微生物飼料添加劑的研究[D].濟南:山東師范大學,2000.

[3]張欣宇.復合益生菌微生態添加劑的培養條件優化及功效評價[D].長春:吉林大學,2015.

作者:孫爭榮 單位:凌海市達蓮海珍品養殖有限責任公司