多元統計分析法評價杞菊地黃丸探討

導語：多元統計分析法評價杞菊地黃丸探討一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：建立杞菊地黃丸的HPLC指紋圖譜，為評價其質量提供依據。方法：色譜柱：InertsilODS⁃3（4．6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈⁃0．3％磷酸溶液，梯度洗脫；體積流量：0．6ml·min－1；檢測波長：254nm；柱溫：40℃；進樣量：10μl。建立杞菊地黃丸的指紋圖譜，根據相似度評價，結合化學計量學方法對杞菊地黃丸進行質量評價。結果：建立25批杞菊地黃丸的HPLC指紋圖譜，共確定26個共有指紋峰，通過與對照品比對指認了8個成分；25批樣品指紋圖譜相似度為0．731～0．981，通過聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法⁃判別分析（PLS⁃DA），25批樣品分成4類，分類結果與廠家呈相關性，并發現16個差異性標記物。結論：所建立的HPLC指紋圖譜方法重復性好、專屬性強，可為杞菊地黃丸的質量控制提供依據和參考。

關鍵詞：杞菊地黃丸；高效液相指紋圖譜；相似度評價；聚類分析；主成分分析；偏最小二乘法⁃判別分析

杞菊地黃丸由枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等八味中藥組成，現收載于中國藥典2020年版一部，可用于治療肝腎不足、陰虛陽浮、頭暈耳鳴、羞明流淚、視物昏花等癥狀［1］。臨床應用方面主要用于治療高血壓、高血脂、干眼癥、慢性結腸炎、早期老年黃斑變性、腦震蕩后遺癥等［2～5］。目前關于杞菊地黃丸的質量標準研究更多地是關于莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量測定［6～8］，其他成分研究報道較少。中藥復方制劑是多成分協同發揮治療作用，僅檢測單一或幾個成分含量不能充分、全面、客觀的評價其內在質量。中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學成分的種類與含量，進而對藥品質量進行整體描述和評價，可應用于質量一致性評價、真偽鑒別等方面。指紋圖譜即可定性鑒別使用，還可體現量的大小，包含的信息量大且多維［9，10］。為了快速、全面的解析數據，指紋圖譜數據分析常結合聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判別分析等化學模式識別技術進行［11］。本研究建立杞菊地黃丸的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，同時結合化學模式識別方法對譜圖進行全面分析，為全面評價杞菊地黃丸質量提供依據。

1儀器與試藥

Waterse2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CPA225D電子天平（德國賽多利斯公司）；El⁃masonicP超聲波清洗儀（德國Elma公司）；水浴鍋（天津泰斯特）莫諾苷對照品（批號：111998⁃201602，含量以96．3％計）、馬錢苷對照品（批號：111640⁃201707，含量以99．2％計）、丹皮酚對照品（批號：110708⁃201407，含量以100％計）、綠原酸對照品（批號：110753⁃201716，含量以99．3％計）、木犀草苷對照品（批號：111720⁃201408，含量以94．9％計）、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸對照品（批號：111782⁃201706，含量以97．3％計）、木犀草素（批號：111520⁃200504）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸（批號：E⁃0451⁃19010531，含量以98．0％計）購自上海同田生物技術股份有限公司；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，液相用水為超純水。杞菊地黃丸（大蜜丸）來源于10個廠家共25批樣品，編號S1～S12（A廠家，批號：15010253、16012264、16013102、16013106、16013107、16013311、16013313、16013314、17010773、17010774、17010779、17010781）；編號S13（B廠家，批號：1710007）；編號S14～S16（C廠家，批號：161101、170401、171101）；編號S17（D廠家，批號：20161101）；編號S18～S20（E廠家，批號：5480072、5480074、5480075）；編號S21（F廠家，批號：115495）；編號S22（G廠家，批號：1704026）；編號S23（H廠家，批號：1606116）；編號S24（I廠家，批號：A17008）；編號S25（J廠家，批號：11170926）。

2方法與結果

2．1色譜條件

色譜柱：InertsilODS⁃3（4．6×250mm，5μm）；流動相：乙腈（A）⁃0．3％磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～100min，1％→35％A）；流速：0．6ml·min－1；檢測波長：254nm；柱溫：40℃；進樣量10μl。

2．2溶液的制備

2．2．1對照品溶液精密稱取莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5⁃O⁃二咖啡?；鼘幩?、4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素各對照品適量，加70％的甲醇制成濃度分別為238．63，131．82，385．13，19．82，13．68，88．32，9．36，20．51μg·ml－1的對照品混合溶液作為對照品溶液。2．2．2供試品溶液取剪碎的大蜜丸約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75％乙醇25ml，密封，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用75％乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，既得。2．2．3單味藥材供試品溶液按照樣品處方和工藝，分別取適量枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉，按“2．2．2”項下供試品溶液制備方法制備單味藥材溶液。

2．3方法學考察

2．3．1精密度試驗取杞菊地黃丸供試品（編號：S9）按“2．2．2”項下方法制備供試品溶液，在“2．1”色譜條件下連續測定6次，記錄色譜圖。結果，以馬錢苷峰為參照峰，26個共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD為分別小于0．13％和2．6％（n＝6），將6次采集的色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012．1版本）”，以精密度1為參照圖譜，6次采集的圖譜與生成的對照圖譜相似度均大于0．992，表明儀器精密度良好。2．3．2重復性試驗取杞菊地黃丸供試品（編號：S9）按“2．2．2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2．1”色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果，以馬錢苷峰為參照峰，26個共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD為分別小于0．18％和3．5％（n＝6），將6次采集的色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012．1版本）”，以重復性1為參照圖譜，6次采集的圖譜與生成的對照圖譜相似度均為1，表明該方法重復性良好。2．3．3穩定性試驗取“2．3．1”項下供試品溶液，在“2．1”色譜條件下于0，2，8，12，24h進樣測定，結果，以馬錢苷峰為參照峰，26個共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD為分別小于0．58％和3．3％（n＝5），將5次采集的色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012．1版本）”，以穩定性0h色譜圖為參照圖譜，4次采集的圖譜與生成的對照圖譜相似度均大于0．995，表明溶液在24h內穩定性良好。

2．4共有峰的歸屬及化學成分的指認取

“2．2”項下對照品溶液、供試品溶液、單味藥材供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖1～圖3，由對照圖譜共指認8個特征峰，分別為峰5莫諾苷、峰7綠原酸、峰9馬錢苷、峰15木犀草苷、峰173，5⁃O⁃二咖啡?；鼘幩?、峰184，5⁃O⁃二咖啡?；鼘幩?、峰23木犀草素、峰26丹皮酚。由單味藥材色譜圖比對可知，峰1，2，5，8，9，10歸屬酒萸肉；峰2，3歸屬熟地黃；峰1，4，6，8，11，13，15，16，24，26歸屬牡丹皮；峰7，8，12，14，15，17，18，19，20，21，22，23，24歸屬菊花；峰25歸屬山藥。

2．5指紋圖譜的建立及相似度的評價

［12］分別取25批供試品，按“2．3”項下方法制備供試品溶液，在“2．1”色譜條件進行測定，記錄色譜圖。采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012．1版本）”，以S1號樣品的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度0．2min、中位數法、多點校正、全譜峰匹配，共標定26個共有峰；計算相似度，得到25批樣品及對照指紋圖譜的疊加圖及相似度結果，見圖4和表1。25批樣品相似度結果為0．731～0．981，其中S13、S17、S22、S24相似度較差，均低于0．90；其他廠家多個批次相似度結果在0．922～0．981之間，相似度較好。

2．6化學模式識別分析

［13］2．6．1聚類分析（clusteranalysis，CA）以25批杞菊地黃丸的26個共有峰面積為變量，將數據導入SPSS26．0軟件，采用組間連接，平方歐式距離進行聚類分析。由圖5可知，類間距離為5時25批樣品分為4類，S13（B廠家）一類、S17（D廠家）一類、S24（I廠家）一類、其他廠家一類。聚類趨勢表明大部分廠家批次的樣品質量趨于一致，但個別廠家樣品有差異性。2．6．2主成分分析（principalcomponentanalysiPCA）將25批樣品的26個共有峰面積數據導入Simca⁃P14．1軟件，以26個共有峰面積值作為變量，進行主成分分析，觀察樣品的自然聚集，PCA得分圖見圖6。由圖6可看出，S13、S17、S22、S24樣品與其他樣品分散，其他廠家樣品聚集性明顯，這一結果與相似度評價及聚類分析結果一致。2．6．3偏最小二乘法⁃判別分析（discriminantanalsisofpartialleastsquares，PLS⁃DA）CA和PCA分析僅能對樣品進行分類，無法分析25批樣品間存在差異的原因，為分析引起組間差異的差異標志物，本實驗將25批樣品共有峰面積值導入Simca⁃P14．1軟件，通過PLS⁃DA分析生成變量重要性投影值圖（VIP圖），VIP可直觀體現各化合物引起組間差異的權重大小，化合物VIP值大于1說明對樣品分類結果權重影響率大于50％，即對分類結果影響具有統計學意義，為差異標志物［10～14］。通過PLS⁃DA分析，得到差異標志物（VIP＞1）共16個，分別為峰8、13、6、17、3、7、24、16、2、10、1、4、18、26、12、21。涉及了能檢出成分的四個單味藥材。

3討論

3．1供試品溶液制備方法摸索

本試驗對比了不同的提取溶劑（50％甲醇、50％乙醇、70％甲醇、75％乙醇、95％乙醇、純甲醇）、提取方法（超聲提取、加熱回流提?。?、提取時間（30，45，60，75min）對杞菊地黃丸色譜峰數量及響應值的影響。最終確定制備方法為75％乙醇醇加熱回流提取1h。

3．2流動相選擇及優化

本試驗對比了不同種類的流動相，首先對比了乙腈、甲醇與酸液，甲醇分析時間長且峰型和分離度較差，因此有機相選擇了乙腈。后又對比了不同濃度的乙腈⁃磷酸、乙腈⁃冰醋酸溶液、不同的洗脫程序和不同的流速結果乙腈⁃0．3％磷酸溶液，梯度洗脫色譜峰數量多，峰型和分離度較好。因此最終確定，以乙腈⁃0．3％磷酸溶液為流動相，梯度洗脫。

3．3檢測波長的選擇

本試驗采用了全波長掃描測定了杞菊地黃丸樣品，結果在254nm下供試品溶液色譜峰信息豐富，色譜峰分離度較好，因此采用254nm作為杞菊地黃丸指紋圖譜的檢測波長。

3．4結果分析

本研究共分析了10個廠家25批樣品，25批樣品相似度結果為0．731～0．981，其中S13（B廠家）、S17（D廠家）、S24（I廠家）、S22（G廠家）四個廠家樣品相似度小于0．90；S1～S12（A廠家）相似度結果為0．942～0．981，S14～S16（C廠家）相似度結果為0．922～0．978、S18～S20（E廠家）相似度結果為0．934～0．974。由相似度結果看出，同一廠家相似度結果較好，且大部分廠家樣品相似度結果差別不大，個別廠家差異較大。通過聚類分析、主成分分析結果可以看出S13、S17、S22、S24與其他樣品差異較大，這與相似度評價結果一致。為了找出差異標志物，對25批樣品進行了PLS⁃DA分析，找出影響樣品組間差異標志物16個，這16個成分涉及酒萸肉、熟地黃、菊花、牡丹皮，說明其質量差異影響因素與處方中各單位藥材均相關。

3．5小結

本研究建立了25批杞菊地黃丸HPLC指紋圖譜，進行了相似度評價，25批樣品的相似度為0．731～0．981。確定了26個共有指紋峰，結合化學對照品指認出8個化合物，分別為莫諾苷、綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、4，5⁃O⁃二咖啡?；鼘幩帷⒛鞠菟?、丹皮酚；并對25批樣品進行了聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判別分析，找出了差異樣品4批和差異標志物16個。該方法簡單、專屬性強，可為杞菊地黃丸質量控制提供參考。

作者：王小芳 鄭倩倩 路麗娟 單位：石家莊市食品藥品檢驗中心