熒光免疫試劑研究管理論文

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［摘要］目的：合成(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，并用于構建妊娠相關血漿蛋白A固相時間分辨免疫熒光試劑。方法：用PVA作為載體結合BCPDAEu3+和生物素親和素，以雙抗體夾心法原理，結合生物素標記抗體和包被抗體建立PAPPA時間分辨免疫熒光試劑，并進行方法學評價。結果：成功的合成了活性的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，構建PAPPA試劑檢測靈敏度為0.7mIU/L；批內變異系數在3.89%～4.96%之間,批間變異系數在7.35%～9.27%之間。結論：合成的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物較高的反應活性，可以用于多種試劑的構建。構建的PAPPA試劑靈敏度高，具有潛在的臨床應用價值。

［關鍵詞］妊娠相關血漿蛋白A；固相時間分辨熒光免疫；親和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基1，10啡羅啉2，9二羧酸—銪復合物；唐氏綜合征

DevelopADirectSolidPhaseLanthaneTimeresolvedFluoroimmunoassayReagentofPAPPAutilizingPVA

Abstract:ObjectiveTodevelopadirectsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassayreagentofPAPPAbysynthesizingacomplexof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+.MethodsPolyvinylamine(PVA)waslabeledwithbiotinstreptavidinandeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA).UsinglabeledPVAcomplex,WedesignedtwositesandwichtimeresolvedfluoroimmunoassayofPAPPAandevaluatedassaycharacteristicsofPAPPAkit.ResultsWesuccessedsynthesizingaconjuageteof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+andareagentofPAPPA.Detectionlimitsachievedwere0.7mIU/L.Thecalibrationcurvewaslinear010000mIU/L.Intraandinterassayimprecision(CV)was3.89%4.96%and7.35%9.27%.Recoverywas95.8%104.2%.ConclusionsTheconjugateof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+synthesiziedwasreactive,highlyfouorescent.Asortsofkitcouldbesynthesized,takingadvantageofit.ThereagentofPAPPAwaspotentiallysuitedforuseinclinicalwithhighlyanalyticalsensitivity.

Keywords:PregnancyassociatedplasmaproteinA;Directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay;StreptavidinbiotinPolyvinylamineeuropiumchelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid;Down''''sSyndrome

妊娠相關血漿蛋白A(PregnancyassociatedplasmaproteinA，PAPPA)是一種高分子α2糖蛋白，20世紀70年代在孕婦血清中被發現［1］。在孕婦血中主要PAPPA是胎盤滋養層組織分泌，它是一種異源四聚體，由兩個分子量為200000~250000亞基構成。PAPPA亞基和兩個嗜紅細胞主要基礎蛋白(Proformofeosinophilmajorbasicprotein)以二硫鍵結合而成［2］，在孕婦血中只存在微量游離單體PAPPA。PAPPA亞基由1547個多聚核苷酸構成，包括1個拉長的鋅指結構，3個Lin—notch重復序列，以及5個短一致重復序列［3］。在體內PAPPA是一種蛋白酶，主要針對胰島素樣生長因子結合蛋白4(IGFBP4)和胰島素樣生長因子結合蛋白5(IGFBP5)起作用。胰島素樣生長因子I(IGFI)在促進細胞分裂和增殖起重要作用，它主要通過IGF1受體起作用，IGFI、II的生物活性受6個高親和性IDFBP調節［4，5］。PAPPA主要用于產前篩查唐氏綜合征(Down''''sSyndrome，DS)，迄今醫學上對此病尚無有效的治療和預防措施，只能通過產前篩查防止DS兒的出生，但目前開展的絨毛活檢,羊水穿刺及臍帶血穿刺均為侵入性檢查,有1%～3%的流產率,且方法繁瑣,出報告時間長,不適宜大范圍孕婦的普查,僅限于高危人群的診斷。大量報道認為PAPPA可作為DS胎兒產前篩查的的標志物。在15周～20周通過結合孕婦孕周、超聲診斷和FreeβHCG可以鑒別65%～75%，但要在3個月～6個月結合AFP、游離E3以及抑制素上述成分可鑒別85%～90%［6］。有文獻［7］報道PAPPA在急性冠狀動脈綜合征(ACS)的早期診斷有一定的意義，PAPPA在ACS患者血清含量＜30mIU/L，同時結構不同于孕婦體內的PAPPA且存在動態變化，必須利用超靈敏的方法進行檢測。國內PAPPA的診斷試劑大多為ELISA和PerkinElmer公司生產的解離增強時間分辨熒光免疫分析(dissociatedenhancelanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay,DELFIA)試劑，無國產PAPPA時間分辨熒光試劑。我們利用PVA(聚乙烯胺)作為載體結合BCPDA鑭系螯合物合成一種高靈敏的固相時間分辨熒光免疫分析(directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassay,DSLFIA)試劑。為提高檢測靈敏度和克服BCPDA標記抗體使抗體失活的問題，我們引入了生物素親和素(biotinstreptavidinsystem)系統。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑4,7二氯磺苯基1，10啡羅啉2，9二羧酸［4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid,BCPDA自制］；純化親和素(Streptavidin，SA，Sigma公司)；硫代琥珀酰亞氨6生物素氨基己酯類［Sulfosuccinimidyl6''''(biotinamido)6hexanamidohexanoate，SulfoNHSLCLCBiotin，pierceChemicalCompany］；聚乙烯胺氫氯化物(Polyvinylaminehydrochloride，PVA,ChemicalDynamicsCorp)；硼酸鈉、二甲亞砜(天津化學試劑有限公司)；單克隆抗體根據文獻［5］選擇Hyb234—5(StatensserumInstitut)作為檢測抗體，mAb10E1(HyTestOy，Finland)作為捕獲抗體；PAPPA標準品和質控品購于PE公司(質控血清：Control1508mIU/L，Control22325mIU/L，Control3為4952mIU/L)；鼠IgG(晶美公司)。

1.1.2儀器Wallac1420多標記計數儀(WallacOY，Finland)；HPLC硅柱TSK250尺寸排阻柱(BIORAD公司)；96白色微孔板(NUNC公司)、親和素包被板(InnotracDiagnosticsOy公司)；Amicon可濃縮離心管(Amiconmicroconcentrationunits，MW30000Cutoff)

1.2方法

1.2.1BCPDA的制備參見文獻詳細步驟［8～10］。

1.2.2生物素聚乙烯胺BCPDA［(Bio)xPVA(BCPDA)y］復合物的構建［11］用0.5M的碳酸鹽(pH9.1)緩沖液配制濃度為10mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液，將200μgNHSLCLCBiotin溶于20μl碳酸鹽緩沖液中，取200μl上述PVA溶液加入20μl上述NHSLC—LCBiotin溶液中，振蕩混勻，室溫反應1.5h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5M碳酸鹽緩沖液將混合液稀釋到1ml，將固體BCPDA研磨成粉末狀，先在上述1ml混合液中加入5mgBCPDA，用力攪拌，直到溶解，重復加3次BCPDA，5mg/次，共計20mgBCPDA，在室溫放置5h～6h，直到溶液澄清，轉移到透析袋中，用0.1MNaHCO35L透析、過夜、重復透析2次，盡可能除去沒反應的BCPDA和生物素。

1.2.3HPLC純化(Bio)xPVA(BCPDA)y復合物離心濃縮上述(Bio)xPVA(BCPDA)y復合物到0.3ml～0.5ml(用Amiconmicroconcentrationunits，MW30000Cutoff)。流動相0.05MTris緩沖液(pH7.70)，控制HPLC流速0.8ml/min，在325nm處監測層析液(325nm為BCPDA最大吸收峰)，上樣后，馬上收集，(Bio)xPVA(BCPDA)y在10管～16管約5ml左右，取10μl(Bio)xPVA(BCPDA)y層析液加入90μl水滴入親和素包被板微孔中，溫育30min，洗板，加入用Tris緩沖液配制的10M～5MEuCl3100μl，反應10min，洗板、干燥，用Wallac1420檢測Eu3+的熒光強度，沒結合復合物的被洗去了，沒結合BCPDA的復合物因無法結合Eu3+而沒有熒光，計算標記的PVA，大約每分子結合50個～100個BCPDA分子。

1.2.4構建親和素生物素PVABCPDA［(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+］復合物［11］用0.1MTris緩沖液(pH7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60g/L，同時加入EuCl3，使Eu3+濃度為10-6mol/ml，用雙蒸水配制親和素溶液濃度為1mg/ml，取上述BSA溶液1ml，加入10μl親和素溶液，再加入50μl的(Bio)xPVA(BCPDA)y復合物(通過固相免疫分析，棋盤滴定法確定最佳用量比，步驟略，結果見后)，混勻，55℃溫育1.5h，4℃保存備用。

1.2.5(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物反應活性用生物素化的各種濃度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60g/LBSA和0.1mol/LTris緩沖液(pH7.8)10倍稀釋(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，在板的微孔中加入100μl稀釋后的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，室溫反應30min，洗板、干燥，測量熒光強度(cpm)。本實驗是驗證復合物的反應活性。

1.2.6生物素標記10E1抗體［12］用二甲亞砜制備硫代琥珀酰亞氨6生物素氨基乙酯溶液(10mg/ml)，將抗體10E1溶于0.1mol/L硼酸鈉溶液(pH8.8)，每1mg抗體中加硫代琥珀酰亞氨6生物素氨基己酯類溶液210μg混合，室溫放置4h，在上述溶液中加入20ml1mol/LNH4Cl，室溫反應10min，將反應液進行透析，除去未結合的生物素，將抗體濃度用分析緩沖液配置成8ng/μl，-20℃保存備用。

1.2.7單克隆Hyb234—5抗體包被96孔微滴定板將抗體溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH4.9)，配置成5μg/ml抗體溶液，在每一孔中加入80μl抗體溶液，室溫反應20h，然后用生理鹽水洗3次，然后每孔加120μl0.05MTrisHcl緩沖液(pH7.4含0.9%生理鹽水、0.05%NaN3、0.5%小牛血清白蛋白BSA)浸泡2h。吸干緩沖液，干燥，密封4℃保存。

1.2.8樣本收集、定標、靈敏度、精密度和回收實驗分析過程選取懷孕8周、9周、11周婦女血清各一份，經PE公司的DELFIA試劑和D&G公司的ELISA試劑多次精確測定，值分別為：P1863.27mIU/L；P21273.63mIU/L；P32727.23mIU/L。用標準品稀釋液(6%BSATSA緩沖液：150mmol/LNaCl、60g/LBSA、50mmol/LTrisHCl，pH7.8)將標準品稀釋濃度為：S00mIU/L(稀釋液)、S120mIU/L、S2200mIU/L、S31000mIU/L、S45000mIU/L、S510000mIU/L。標準品定標根據WHOIRP78/610(WHOInternationalLaboratoryforBiologicalstandards，StatensSeruminstitut，Denmark)，單位換算：1000mIU/L=4.5μg/ml。在單克隆Hyb234—5抗體包被96孔微滴定板，每孔加入定標液10μl，作8次平行測量，加入50μl生物素標記10E1抗體50μl，混勻，36℃，室溫反應20min，洗板6次，加入100μl10倍稀釋的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，室溫反應25min，洗板6次，吹干，Wallac1420測量熒光強度(cpm)，取均值，作標準曲線。將S00mIU/L做20次重復測試，計算均值(X)和標準差(s)，以X+2s為試劑的最小檢測限。將Control1，Control2，Control3依據定標分析過程，同批測量20次，批間測量12次，用于評價精密度。對收集樣本(P1、P2、P3)依據定標分析過程進行測量，然后將Control1、Control2、Control3分別等體積加入P1、P2、P3中進行測量，用于評價回收實驗。

2結果

2.1用HPLC純化(Bio)xPVA(BCPDA)y復合物在10min～16min出現(Bio)xPVA(BCPDA)y的吸收峰，沒有結合BCPDA的吸收峰在17min～24min出現,見圖1。

圖1凈化（Bio）x－聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色譜（TSK－250過濾柱）上的變化圖。（略）

流速控制在0.8ml/min，吸光率325nm

2.2用滴定法確定親和素和(Bio)xPVA(BCPDA)y最佳配比SA量恒定0.01mg/ml，生物素標記的抗體包被分別濃度為0ng/孔、0.5ng/孔、5ng/孔、50ng/孔，緩沖液為pH7.8TrisHcl0.1M，Eu3+10-5M，(Bio)xPVA(BCPDA)y用量從40μl～55μl選擇最佳值，50μl復合物熒光強度值(cpm)最佳，如圖2。

圖2滴定鏈球菌，（Bio)x－聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3MEu3+,0.1MTris-Hclbuffer(pH7.8)緩沖液中的變化，0.01mg/ml鏈球菌，容積變動范圍40μl~55μl，觀察到最佳容積為50μl（略）

2.3驗證活性用生物素化的各種濃度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板驗證(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物的反應活性，在測定范圍內成線性分布，見圖3。

圖3IgG維生素定量法標定曲線（略）

2.4PAPPA定標曲線及靈敏度在0mIU/L～10000mIU/L范圍內定標曲線為線性分布，見圖4。S0標準重復20次檢測均值加2個標準差值代入標準曲線，計算出檢測限為0.7mIU/L(數據沒顯示)。

圖4PAPP-A標定曲線（略）

2.5批內、批間精密度對質控血清批內進行20次分析，批間進行12次分析，得到批內變異系數3.89%～4.96%,批間變異系數在7.35%～9.27%之間,見表1。

表1批內、批間變異系數比較（略）

2.6回收實驗對收集樣本(P1、P2、P3)依據定標分析過程進行測量，然后將Control1、Control2、Control3分別等體積加入P1、P2、P3中進行多次測量，分別計算回收率95.8%～104.2%,見表2。

表2回收實驗結果比較（略）

3討論

臨床化學家最關心的問題是分析技術靈敏度，這也是臨床診斷試劑的核心。近來，在臨床化學檢測物質的濃度的范圍10-3mol/L～10-16mol/L。PCR以及其他的體外擴增技術使DNA、RNA檢測方便、高效、特異。不幸的是蛋白不能復制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之間的特異性結合如抗原抗體反應。一個提高蛋白檢測靈敏度的方法就是信號放大，即在蛋白上標記可以檢測的標記物，通過標記物的信號放大而達到更容易檢測的目的。時間分辨免疫學技術是80年代迅速發展起來的的一種公認的最有發展前途的非放射免疫標記技術，其中熒光鑭系螯合物具有較大的Stokes位移(275nm)，較窄的發射光譜(10nm)，較長的熒光壽命(10us～1000us)，而被廣泛構建時間分辨熒光免疫試劑。臨床運用最廣泛的是PE公司生產的解離增強鑭系時間分辨熒光免疫分析(dissociationenhancedlanthanidefluoroimmunoassay，DELFIA)試劑，它必須使Eu3+與螯合物分離，由于其信號較弱，必須加入增強液來發大信號，操作煩瑣且在加樣的過程中可能引起外源性的污染，這些弊端影響了它的應用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一種新的螯合物BCPDA，開創了固相時間分辨免疫熒光技術，解決了DELFIA上述問題［8，9］，但是BCPDA的較大分子量、表面特性和直接標記蛋白容易引起蛋白的失活對它應用帶來一些問題，解決的辦法就是連接一個載體。我們實驗中引入了PVA作為載體，連接BCPDA和生物素親和素。PVA直接連接蛋白技術難度較大，而生物素標記蛋白技術比較成熟，同時親和素有4個生物素結合位點，可以起到信號放大作用，而提高檢測靈敏度。我們實驗中成功的合成了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，用它去識別生物素標記的抗體(見圖3)，結果顯示親和力非常高。實驗關鍵問題是選擇SA和(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物最佳比，我們實驗中做了7個濃度梯度，選取結合后熒光強度最大的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物濃度。利用HPLC層析純后的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物回收率是68%。通過實驗選擇最佳檢測抗體濃度、生物素化抗體濃度和標本用量。Jackson［13］分析了提高靈敏度的因素即兩個關鍵的因素與最終的結合分析靈敏度相關：我們監測標記分子(放射性同位素、化學發光劑、熒光團)的能力；結合試劑的質量和實驗條件，在臨床化學存在一種誤導是特別敏感的監測方法(化學發光、時間分辨熒光)能獲得好的結果。其實這是錯誤的，如果實驗試劑和條件(抗體的親和性和特異性，固相結合物的自然特性以及清洗效率)不被選擇，很難達到理想的檢測效果。為達到較高的靈敏度，需要選擇高靈敏度的標記技術、高親和力的試劑和最好的分析條件(可將試劑的非特異性結合降到最小)。利用鑭系螯合物的時間分辨熒光免疫分析是一種高靈敏的標記技術，關鍵是實驗條件的選擇，我們驗證不同孵育時間下，(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物產出率，以及和生物素化抗體的結合能力(數據不能顯示)。經過大量的實驗選擇了Eu3+的濃度，使其能和BCPDA形成最佳比例(數據不能顯示)。反應條件的建立中，我們篩選實驗反應溫度(18℃～56℃，每5℃選擇一次)和反應時間(10min～24h)，考慮到臨床結果的報告時間，選擇了20min(數據不能顯示)。經過實驗條件選擇，形成了PAPPA的定標曲線，通過定標曲線確定最低檢測限(見圖3)。我們構建的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物可以用于多種像PAPPA這樣利用雙抗體夾心法檢測的試劑，如AFP等。我們選擇構建PAPPA主要考慮到我國產前篩查項目的自產試劑較少，而且DS篩查尤為重要，由于科研經費的問題，沒有進行最佳單抗配對實驗，只是參考了國外的相關文獻。不過我們實驗的核心是構建(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物，為以后構建其他試劑做一定的前期工作。我們構建的PAPPA試劑,回收實驗和精密度試驗顯示，完全滿足試劑盒要求。在今后的工作中，我們主要驗證(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物和成品試劑盒的穩定性，以及進一步和PE公司的PAPPA的DELFIA試劑做大量的臨床對比實驗。總之，我們成功構建了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復合物和PAPPA的成品試劑，它有較高的靈敏度、準確度和精密度，又克服了DELFIA試劑的缺點。

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