透視肌源神經營養因子修復論文

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【摘要目的摘要：觀察肌源神經營養因子（MDNF）對大鼠四周神經損傷修復的影響.方法摘要：從成鼠骨骼肌中提取出MDNF，取10μLMDNF（0.1mg/L）注射到大鼠坐骨神經損傷段為實驗組，同時設實驗對照組（注射生理鹽水）和正常對照組.術后20d用辣根過氧化物酶示蹤法（HRP）、尼氏染色法、非凡三色染色法對再生神經進行形態學觀察和計量學統計.結果摘要：注射MDNF的四周神經損傷部有再生的神經纖維通過；MDNF組的再生神經在形態學及計量學上均優于生理鹽水組.結論摘要:肌源神經營養因子對四周神經損傷后的修復有較好的促進功能.

【神經生物學；肌源神經營養因子；四周神經損傷；四周神經再生；辣根過氧化物酶；大鼠

0引言

四周神經系統具有一定的再生能力.但是，無論怎樣精確的神經修復，其功能都很難再恢復到損傷前的水平［1］.通過提高外科手術技術、電或磁的刺激［2］、組織的摘除以及雪旺氏細胞的巧妙處理等方法來促進四周神經損傷后的修復工作已做了很多.最近，對神經營養因子的分子通路以及生理功能的理解有了重大的進展.這些因子包括神經生長因子、腦源性神經營養因子、神經營養因子3，4，5，6以及膠質源性神經營養因子等等，它們影響著不同的神經細胞亞群，在中樞和四周神經系統中均有著復雜的營養功能.許多探究表明，骨骼肌組織中也存在著對神經元有營養功能的物質.Oppenheim等將從大鼠的這種物質中分離出的Mr為10000~30000組份蛋白命名為“肌源神經營養因子”（musclederivedneurotrophicfactor，MDNF），它能促進胚胎脊髓運動神經元生長，并對其損傷具有保護功能［3］.我們通過辣根過氧化物酶示蹤法、尼氏染色法、非凡三色染色法觀察MDNF對坐骨神經損傷后修復的影響.

1材料和方法

1.1材料

Wistar大鼠（軍事醫學科學院動物中心提供）;Tyrode溶液，低溫高速離心機（上海華亭TGL16G）;中空纖維超濾器（UltrafiltrationwiththePorousFibertubers，北京宣武超濾設備廠）;電腦自動記錄儀記錄（上海滬西儀器廠）;電泳儀（北京六一電泳儀器廠）;HRP（中山公司）.

1.2方法

1.2.1成鼠MDNF的制備用80只成年Wistar大鼠，切取四肢，在手術顯微鏡下剝離骨骼肌組織塊.骨骼肌組織用Tyrode溶液浸泡（1∶5）后，再經超聲粉碎、低溫高速離心30min得上清液.經中空纖維超濾器截取Mr為10000~50000的蛋白液，然后在層析柜內過交聯葡聚糖（Sephadex）G75（Pharmacia產品）層析柱，柱長1m，用PBS平衡液洗脫，流速為0.3mL/min，自動收集器收集，紫外檢測，波長280nm，電腦自動記錄儀記錄.層析預截取的Mr10000~30000洗脫液經冷凍干燥后，進行十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺梯度凝膠，中范圍分子質量標準蛋白做對照（Pharmacia）.電壓150V，0.5~1h，硝酸銀染色.

1.2.2動物分組及手術方法雄性健康Wister大鼠18只，體質量250g左右，隨機分成實驗組、實驗對照組和正常對照組,每組6只.用異戊巴比妥鈉麻醉劑腹腔注射麻醉（2.5mL/kg），于大鼠右側股后部正中切口，在手術顯微鏡下解剖坐骨神經，自梨狀肌下緣夾傷坐骨神經30s，直至夾傷段僅有透明的神經外膜.實驗組用100mg/L的MDNF10μL注入夾傷處，實驗對照組注射生理鹽水10μL.正常對照組未經任何注射，術后各組大鼠按常規飼養20d.

1.2.3檢測方法①HRP示蹤試驗摘要：各組隨機抽取大鼠2只，于夾傷處遠端4mm處的坐骨神經干注入150g/L的HRP溶液10μL，縫合好傷口，繼續飼養72h，多聚甲醛灌注后取腰段脊髓固定，振動切片，進行四甲基聯苯胺法染色，觀察各組HRP標記的情況.②Nissl染色摘要：各組大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注，取脊髓腰段，石蠟包埋，切片，展片后進行尼氏染色，觀察神經元胞體數.③非凡三色染色摘要：各組大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注后，取坐骨神經夾傷段、坐骨神經夾傷遠端、近端，石蠟包埋連續切片，夾傷段縱切，遠、近端既縱切，又橫切，觀察神經再生、髓鞘形成情況，計量學分析遠、近端的軸索數，遠端的軸索直徑和髓鞘厚度.

2結果

2.1HRP示蹤試驗MDNF組HRP標記神經元數和其余二組均有顯著性差異（P%26lt;0.01，表1）.

2.2Nissl染色Nissl染色后，實驗組脊髓前角運動神經元數和實驗對照組有差異（P%26lt;0.05），兩組和正常對照組均有顯著性差異（P%26lt;0.01，表1）.表1HRP標記和Nissl染色脊髓運動神經元數據(略)

2.3非凡三色染色實驗組和實驗對照組坐骨神經夾傷20d時，兩組坐骨神經夾傷段的遠端、近端都不同程度地發生了Waller變性.實驗組（圖1，2）和實驗對照組（圖3）近端的神經纖維損傷分別比遠端輕.在近端橫切面中還能看到大量的正常的有髓神經纖維，軸索被染為綠色點狀，軸索四面的髓鞘被染成紅色（圖1）；縱切面中能見到大量的正常有髓神經纖維，染成紅色的為髓鞘，在紅色髓鞘的中間有一條綠色的細線為軸索，縱切面中也能見到正在變性和已變性的沒被染成紅色的神經纖維（圖2，3）.在變性的神經纖維神經膜管的內面還能見到少量的Schwann細胞（圖2）.實驗組（圖1）、正常對照組（圖4）、實驗對照組近端軸索數沒有差異（表2）.表2有髓神經纖維組織形態學分析結果（略）

實驗組（圖5，6）和實驗對照組（圖7，8）遠端的神經纖維損傷很重.在實驗對照組橫切面上（圖7）能見到大量的變性神經纖維，綠色點狀軸索和紅色髓鞘少見；在實驗組（圖5）也能見到變性神經纖維，但綠色軸索和紅色髓鞘較多.在縱切面上，實驗組（圖6）神經纖維因損傷髓鞘腔崩解，髓鞘斷裂成為分節狀結構，在神經膜區域內仍可見大量塊狀髓鞘碎片，神經膜管有的萎縮、變窄，大量的Schwann細胞在神經膜管的內面形成Büngner帶；實驗對照組（圖8）神經纖維髓鞘碎片已不成塊狀，呈松馳狀，大部分都已消失，神經膜管都已萎縮、變窄，大量的Schwann細胞在神經膜管的內面形成Büngner帶.實驗組和實驗對照組遠端軸索數、軸索直徑和髓鞘厚度有差異（P%26lt;0.05），兩組均和正常對照組有顯著性差異（P%26lt;0.01）.實驗組損傷段（圖9，10）縱切面上能見到許多髓鞘腔和Schwann細胞，一些髓鞘腔內有少量的紅色的髓鞘（圖10）；對照實驗組損傷段（圖11，12）縱切面上幾乎見不到髓鞘腔和髓鞘，大多是疤痕、結締組織和變性的神經纖維.

3討論

神經系統的發展和維持依靠著神經營養因子.最初，人們只注重神經營養因子對神經細胞損傷后的修復功能，而很少留意它們對四周神經再生的影響.圖1實驗組近端坐骨神經(綠色點狀為軸索

近10余年來，出現了一大批有關MDNF的探究證實MDNF對神經元具有促進生長、減少死亡等功能.現已證實，大鼠MDNF對神經細胞凋亡有很好的抑制功能，它不但能夠拯救胎齡6~9d凋亡期的1/4運動神經元不死亡，而且幾乎可使新生鼠切斷后的運動神經元全部存活.大鼠MDNF是否也象其他神經營養因子一樣對四周神經損傷后的修復有促進功能呢？本實驗探究發現，坐骨神經損傷后，經MDNF孵育的實驗組遠端在軸索數、軸索直徑和髓鞘厚度均高于實驗對照組.在四周神經中，髓鞘厚度、軸索直徑、軸索數被用來評價神經再生［4］.結果說明，MDNF對四周神經損傷后的再生有促進功能.探究還發現，實驗組HRP標記的神經元數以及Nissl染色的神經元數均比實驗對照組高；非凡三色染色中，實驗組坐骨神經損傷段遠端縱切面上仍有大量的塊狀髓鞘碎片，而實驗對照組中髓鞘碎片大部分消失，且實驗組坐骨神經損傷段有新生的髓鞘生成.結果說明，MDNF對四周神經損傷的修復有促進功能.但另一方面，實驗組的髓鞘厚度、軸索直徑、軸索數、HRP標記的神經元數、Nissl染色的神經元數均低于正常對照組，MDNF對四周神經損傷的修復也是不完全的.肌源神經營養因子對四周神經再生有促進功能，至于MDNF是如何促進四周神經再生以及其促進再生的發生率均有待于進一步探究.

【參考文獻

［1］YinQ,KempGJ,YuLG,etal.Neurotrophin4deliveredbyfibringluepromotesperipheralnerveregeneration［J］.MuscleNerve,2001，24(3)摘要:345-351.

［2］ShenN,ZhuJ.Experimentalstudyusingadirectcurrentelectricalfieldtopromoteperipheralnerveregeneration［J］.JReconstrMicrosurg,1995，11摘要:189-193.

［3］周長滿,陳彪,王雪岷,等.骨骼肌組織對雞胚背根節細胞GABA表達的影響［J］.解剖學報,1997，28(1)摘要:373-378.

［4］LlewinSL,UtleyDS,ChengET,etal.SimultaneoustreatmentwithBDNFandCNTFafterperipheralnervetransectionandrepairenhancesrateoffunctionalrecoverycomparedwithBDNFtreatmentalone［J］.Laryngoscope,1997，107摘要:992-999.