腸道致病菌測體論文

導語：腸道致病菌測體論文一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

沙門菌屬、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌是常見的引起人類和動物細菌性痢疾和細菌性食物中毒的腸道致病菌，嚴重的危害著人類健康和牲畜的平安〔1〕。因此，建立一種快速、簡便、準確、特異地檢測方法具有重要意義。目前常見病原菌的檢驗方法存在著檢測周期長、工作量大、所需試劑多，而且假陰性率高，靈敏度低，或假陽性率高，特異性差等缺點。PCR技術提供了理想的檢測方法。本實驗采用多重PCR方法，可在同一反應體系中檢測不同的細菌，整個過程只需要2～3h，應用前景廣闊。

1材料和方法

11實驗菌株腸炎沙門菌、阿柏丁沙門菌，雞雛沙門菌，德爾比沙門菌、鼠傷寒沙菌，福氏志賀2a，福氏志賀2b，宋氏志賀菌，枸緣酸桿菌，變形桿菌，河弧菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌(四川省疾病預防控制中心)；產毒素大腸埃希菌C83921，產毒素大腸埃希菌C83902（中國獸醫藥品監察所）；侵襲性大腸埃希菌（中國生物制品探究所）。

12試劑染料、緩沖溶液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、核酸染料(GV)、瓊脂糖、Marker等(北京塞百盛基因技術公司)。

13主要設備PCR基因擴增儀、臺式高速離心機、紫外可見凝膠成像系統、核酸分析儀、微量加樣槍(德國Eppendorf公司)；電泳槽、DYY-2穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

14方法

141引物設計沙門菌組氨酸轉運操縱子基因片段具有沙門菌屬特異性〔2-4〕，根據GenebankV01373提供的基因序列設計引物，即引物1摘要:5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3′；引物2摘要:5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3′由于ipaH基因存在于所有志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌（EIEC）的質粒和染色體上〔5〕，根據GenebankM32063提供的序列設計志賀菌和EIEC引物,引物序列為摘要:引物1摘要：5′-TGTATCACAGATATGGCATGC-3′；引物2摘要：5′-TCCGGAGATTGTTCCATGTG-3′。選擇不耐熱腸毒素(LT)的編碼基因保守區〔6〕，根據GenebankS60731提供的序列設計一對引物為摘要：引物1摘要：5′-GCGTTACTATCCTCTCTATGTG-3′引物2摘要：5′-AGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3′。

142DNA模板的提取采用熱裂解法，取細菌培養液10ml,置于Eppendorf管中,8000r／min，滅菌蒸餾水洗滌2次,最后用1ml蒸餾水懸浮,隔水煮沸10min,8000r／min，離心10min,取上清,即為DNA模板溶液。

143多重PCR擴增條件的優化通過多次試驗先確定了變化較小的因素buffer,dNTP,再對影響較大的因素如MgCl2濃度、引物濃度、Taq酶用量、模板濃度，在1個范圍內做正交實驗，再進行局部微調，最后調整退火溫度和循環數參數等。取PCR產物5μl及DNAMarker參照物在含有(GV)的1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓75V,電泳40min后在紫外燈下觀察結果。

144多重PCR體系的特異性、靈敏度、樣品檢測(1)特異性檢測摘要：9株標準目的菌株和7株非目的菌株,提取DNA模板,然后進行PCR擴增，電泳后觀察有無條帶的出現。(2)靈敏度檢測摘要：將從目的菌株提取的DNA模板用核酸分析儀測定DNA含量,然后作10倍梯度稀釋,取每個稀釋度的DNA進行PCR擴增,電泳后觀察條帶的亮度,直到不出現擴增帶為止。(3)樣品的檢測摘要：從牛肉中分離的可疑菌株,提取DNA模板,進行多重PCR擴增。同時,按常規進行生化檢驗和玻板凝集試驗。

145PCR試劑盒組成經反復試驗,組裝多重PCR試劑盒。包括PCR反應管,PCR反應液［染料，緩沖溶液（Mg2+），dNTP，引物］,瓊脂糖粉,GoldView染料，Taq酶,陽性對照,陰性對照,液體石蠟。

2結果

21PCR反應條件的優化反應體積50μl,10×buffer5μl，引物各025μl（50μmol/L）,Taq聚合酶08μl(5U/μl),dNTPs2μl（10mmol/L）,粗提DNA模板各1μl。擴增條件摘要:94℃預變性4min,94℃變性45s,退火58℃40s,延伸72℃60s,32個循環，最后72℃保溫5min，見圖1。

1摘要：腸炎沙門菌；2摘要：阿柏丁沙門菌；3摘要：雞雛沙門菌；4摘要：德爾比沙門菌；5摘要：鼠傷寒沙門菌；6摘要：產毒素大腸埃希菌C83902；7摘要：產毒素大腸埃希菌C83902；8摘要：福氏志賀2a；9摘要：福氏志賀2b；10摘要：宋氏志賀；11摘要：侵襲性大腸埃希菌；12摘要：腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌；13摘要：產毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a；14摘要：腸炎沙門菌+福氏志賀2a；15摘要：福氏志賀2a+腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌；16摘要：腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a；17摘要：腸炎沙門菌+產毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a

圖1多重PCR反應檢測結果（略）

22特異性用所建立的方法檢測沙門菌、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌均擴增出特異的、和預期結果相符的DN段,未見非特異性擴增帶，且其他的非目的菌株未擴增出條帶。

23靈敏度單獨及多重PCR體系中幾種菌的靈敏度均達到10-8fg/μl,兩體系靈敏度一致,即沙門菌屬為913×10-8fg/μl，志賀菌屬（侵襲性大腸埃希菌）為723×10-8fg/μl，腸產毒素大腸埃希菌234×10-8fg/μl，見圖2。

M摘要：DNAMarker；1～4摘要：各模板DNA稀釋度分別為10-1，10-2，10-3，10-4倍

圖2多重PCR反應靈敏度檢測結果（略）

24牛肉中志賀菌的檢測用多重PCR方法從牛肉中共檢測出9個陽性樣品。經國家標準衛生檢驗方法驗證均為陽性〔7〕。

25試劑盒穩定性和重復性除Taq酶,PCR反應液,陰、陽性模板置-20℃貯存外,其余試劑均4℃條件下貯存。在貯存時間為30，60，90，120，150，180，210，240，270和300d時取出,用已知PCR陽性樣品檢測試劑盒的穩定性,結果直到300d,樣品PCR仍呈陽性,說明該試劑盒的有效期在300d以上。此外,PCR陽性樣品用試劑盒重復試驗3次,結果均為陽性;而PCR陰性樣品重復試驗3次,均為陰性。說明該試劑盒的重復性好。

3討論

本探究在于應用多重PCR快速檢測腸道致病菌，考慮到引物間的配對、引物間的競爭性擴增、退火溫度等均可影響多重PCR的擴增效果〔8〕，因此，查找的序列均具有很強的保守性，設計的3對引物之間不能相互配對，形成二聚體或發夾結構，Tm值基本一致等。對選取的目的菌株和非目的菌株同時進行PCR擴增,結果目的菌株均顯示出特異擴增,而所有非目的菌株均不出現擴增條帶,說明引物具有很強的特異性。多重PCR影響因素復雜,不同的引物、模板、引物濃度、模板濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度及其比例、緩沖液成分和濃度、反應體系、循環參數等會產生復雜的綜合效應〔9〕。本體系中10×buffer,dNTPs,模板量等對多重擴增的影響不大,Taq酶、引物、Mg2+濃度、循環次數、退火溫度等對PCR反應的特異性和反應效率影響較大。通過優化PCR反應體系和條件,使實驗效果達到了最佳，且幾種細菌隨機組合的擴增也獲成功,未出現相互間強抑制現象。PCR試劑盒的穩定性和重復性試驗表明,該試劑盒重復性好,有效期長,特異性強，靈敏度高，結果準確,對待檢樣品要求不高,檢測時間更短等。通過對牛肉樣品的檢測,顯示PCR法陽性率明顯高于培養法,且培養法陽性的樣品,PCR法均為陽性,說明試驗結果可靠。因此,該試劑盒有一定的應用價值,可在生產生活中推廣應用。

【參考文獻

〔1〕韓文瑜.病原細菌檢驗技術［M］.長春摘要：吉林科學技術出版社,1992摘要：1-78.

〔2〕CohenND,NeibergsHL,MegruderED,etal.Genus-specificdetectionofSalmonellaeusingthepolymerasechainreaction(PCR)［J］.JVetDiagnInvest,1993,5(3)摘要:368-371.

〔3〕CohenND,WallisDE,NeibergsHL,parisonofthepolymerasechainreactionusinggenus-specificoligonucleotideprimersandmicrobiologycultureforthedetectionofSalmonelaindrag-swabsfrompoultryhouses［J］.PoultSci,1994,73(8)摘要:1276-1281.

〔4〕CohenND,McgruderED,NeibergsHL,etal.DetectionofSalmonellaenteritidisinfecesfrompoultryusingboosterpolymerasechainreactionandoligonucleotideprimersspecificforallmembersofthegenusSalmonella［J］.PoultSci,1994,73(2)摘要:354-357.

〔5〕VenkatesanMM,BuysseJM,kopeckoDY.UseofshigellaflexneryipaCandipaHgenesequenceforthegeneralidentificationofshigellaspp.andenterioinvasiveE.coli［J］.JClinMicrobiol,1989,27摘要:2671-2691.

〔6〕Stacy-phippsS,MeccaJJ,WeissJB.MultiplexPCRassayandsimplepreparationmethodforstoolspecimensdetectEnterotoxigenicEscherichiacoliDNAduringcourseofinfection［J］.JClinMicrobiol,1995,33摘要:1054-1059.

〔7〕羅雪云，劉宏道，周桂蓮，等.食品微生物檢驗標準手冊［M］.北京摘要：中國標準出版社，1995摘要：58-66.

〔8〕黃銀花,胡曉湘,徐慰倬,等.影響多重PCR擴增效果的因素［J］.遺傳,2003,25(1)摘要:65-68.

〔9〕張學敏，王宜強.靶向新基因的分子克隆策略—理論和方法［M］.北京摘要:軍事醫學科學院出版社,1999摘要：1-11.