鎳與多基因致癌作用試析論文

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鎳是人類生產、生活中的重要金屬和人體必需微量元素，同時也是一種多系統、多器官、多細胞毒物。鎳化合物已被確認為人類確證致癌物。許多報道認為：鎳進入細胞后主要通過自由基作用、DNA-蛋白質交聯及堿基甲基化等遺傳、非遺傳方式致癌［1-5］。我們就鎳致癌過程中的多基因變異研究進行回顧，為鎳的分子致癌機制研究提供參考。

一、鎳與原癌基因的激活

就其本質而言，原癌基因是一類編碼關鍵性調控蛋白的正常細胞基因，對細胞的正常生長有極其重要的作用。當其發生突變或異常表達時，就成為導致細胞惡變的癌基因［6］。在鎳的致癌機制中，研究最多的是c-myc、c-ras、c-jun、c-fos癌基因和NFκB蛋白基因。

1.myc基因：myc基因表達DNA結合蛋白，分布于核內，參與RNA的加工、細胞周期調節及細胞分化。正常細胞中通常myc只在細胞分裂早期增加，而在許多癌細胞中均見到其異常表達。Sunderman等［7］在雄性Fisher-344大鼠單側腎臟注射20mgαNi3S2后，觀察到腎癌及多種肉瘤，腫瘤細胞中染色體畸變多見，DNA斑點雜交和圖像分析表明：N-myc基因表達明顯增強，超出正常細胞6倍。說明Ni3S2明顯誘導myc原癌基因的擴增。

2.ras癌基因：ras癌基因由4個外顯子組成，編碼p21蛋白，它定位于細胞膜內側，其功能與G蛋白類似，是細胞內重要的信息傳導分子。多數癌細胞ras通道被不正常激活。Haugen［8］及Kawanishi等［9］先后發現鎳致癌與ras癌基因有關。Kathleen等［10］用硫化鎳和硫化亞鎳誘發大鼠腎肉瘤后，用PCR方法在腎肉瘤細胞中發現k-ras基因的第12密碼子存在GGT→GTT的顛換，而其他密碼子未發現突變現象。說明ras基因的第12密碼子是鎳的選擇性攻擊位點，ras原癌基因由于點突變而激活。此外，還發現ras基因被不正常激活后，腫瘤發生的潛伏期縮短，這與ras表達蛋白的功能有關。因為p21蛋白是調控細胞生長的重要分子，ras過度表達，細胞生長加速，故潛伏期變短。

3.AP-1(fos/jun)癌基因：c-fos和c-jun癌基因表達產物為核轉錄因子，是信息通路的核內部分。DNA的轉錄和蛋白質的表達均與之有關。AP-1癌基因是c-fos和c-jun癌基因的雜合二聚體復合物，也具有上述性質［11］，許多腫瘤與之激活有關。Konstantin等［12］發現鎳誘導c-fos和c-jun基因的表達。他們用氯化鎳持續染毒BALB/c3T3細胞，結果該細胞株獲得了對濃度高達200μmol/L鎳的抵抗力(故稱B200細胞)。作者研究了鎳對B200細胞和野生型3T3細胞AP-1的DNA結合活力，結果發現野生型3T3細胞AP-1的DNA結合力比B200細胞強。由于AP-1基因是c-fos和c-jun的二聚體，故作者隨后用Northernblot法分析了c-fos和c-jun的表達，取得了與上述一致的結果。c-jun和c-fos在野生型3T3細胞中表達要強，而B200細胞表達很低。說明鎳能誘導轉錄因子AP-1(jun/fos)的表達。

4.NFκB蛋白基因：NFκB蛋白是結合于增強子的調控蛋白，參與多種細胞因子的活化。鎳能誘導該調控蛋白的表達。Konstantin等［12］在比較B200細胞和野生型3T3細胞對鎳的不同反應的實驗中發現鎳對NFκB蛋白有誘導作用。

二、鎳與抑癌基因的失活

抑癌基因與癌基因是一對矛盾的統一體，控制著細胞的生長和分化。在正常細胞中，抑癌基因通常處于一定程度的表達；而在腫瘤細胞中，抑癌基因經常丟失或失活。鎳的致癌過程與Rb和p53等多種抑癌基因的失活密切相關。

1.p53基因：在鎳誘發的人腎上皮惡性轉化細胞中，Haugen等［13］觀察到p53基因的第238個密碼子上有T→C的顛換突變，即TGT→CGT(Cys→Arg)。Mahle等［14］用鎳轉化人腎上皮細胞，用p144D6、pYNZ22.1和pYNH37.3探針發現惡變細胞17號染色體短臂(17p)缺失。由于p53基因定位于17號染色體短臂，且p53基因變異常伴17號染色體缺失，故用PCR擴增p53基因，DNA測序發現了其238位密碼子T→C的突變。Harty等［15］對職業接觸鎳化合物的肺癌患者病理標本進行基因分析，發現p53基因的5～8外顯子存在著G∶C→T∶A型顛換突變。

2.Rb基因：Rb基因最早在視網膜母細胞瘤的患者中發現缺失，隨后發現它有重要的抑癌功能。鎳的致癌作用也與Rb基因的變化有關。Lin等［16］用晶體硫化鎳處理人成骨細胞(HOS)，使HOS細胞發生惡性轉化。他們發現：惡變細胞中Rb蛋白(pRb)不能進行磷酸化，不能與SV40大T抗原形成復合物，而只能次磷酸化；當通過Rb表達載體將正常Rb基因轉入鎳轉化的HOS細胞后，該細胞又具有正常表型，呈現接觸抑制，且表達的pRb能被磷酸化。說明鎳轉化細胞中Rb基因失活了。

3.衰老基因：Catherine等［17］發現鎳轉化的中國倉鼠細胞X染色體長臂(xq)發生完全丟失，細胞獲得不死性，并可在裸鼠身上致瘤。將正常細胞的X染色體經微細胞融合技術轉入轉化細胞后，這些細胞出現死亡。由于X染色體上存在多個衰老基因，推測是鎳引起X染色體上衰老基因的失活。Deborah等［18］則在鎳轉化的敘利亞倉鼠皮膚細胞(SHD)里發現衰老基因的失活，觀察到是X染色體上的亞顯微間隙基因缺失(sub-microscopicinterstitialgeneticdeletion)所致。

4.血小板反應蛋白(thrombospondin)基因：血小板反應蛋白是一種可接受促分裂原的鈣結合蛋白，對血栓塊有穩定作用。它在腫瘤發生學上的意義在于能夠阻止腫瘤，具有抑制作用，故被認為也是抑癌基因［19］。Salnikow等［20］發現鎳轉化細胞中有一與血小板反應蛋白基因高度同源的DN斷丟失，血小板反應蛋白基因在鎳轉化細胞中呈低表達。單克隆抗體證明該表達蛋白存在于正常細胞，而在轉化細胞中大大減少，說明血小板反應蛋白基因被抑制或失活。

三、鎳致原癌基因激活和抑癌基因失活的機制

一般說來，原癌基因和抑癌基因在正常細胞中都只處于低水平的表達，只有在生長信號的刺激下，進入增殖時，癌基因才被激活，表達增強。例如ras基因被激活后，細胞明顯增殖，而此時p53基因、Rb基因等抑癌基因表達也增強，對細胞的生長起負調控作用，待細胞生長停止后又復下降。但是如果原癌基因非正常表達增強或抑癌基因非正常失活，結果誘導細胞持續增生或惡變。已知鎳引起多種原癌基因激活及抑癌基因失活。據分析，導致這一變化的機制主要有點突變、缺失、擴增、DNA甲基化、染色體濃縮等方式。

1.點突變：以ras癌基因為例，在鎳誘導的惡性轉化細胞中，多次觀察到鎳選擇性地引起H-ras或K-ras癌基因的第12密碼子G→T的突變［9，10］，即從GCT變為GTT，相應的編碼氨基酸由甘氨酸變為纈氨酸，單個堿基的變化使該基因處于激活狀態，ras基因表達增強。同時，氨基酸的變化改變了編碼蛋白p21的構象，使GAP(GTP酶結合蛋白)不能識別和激活p21的GTP酶，于是p21-GTP復合物不能水解成p21-GDP，p21處于持續活化狀態，使細胞持續增殖［21］。

抑癌基因的失活也可以通過堿基點突變發生。p53抑癌基因就是如此。在鎳誘導惡變細胞和鎳工肺癌細胞中均可見到該基因的點突變。例如：人腎上皮細胞受鎳轉化后，其p53基因的第238密碼子上發生T→C的顛換，即由TGT→CGT［13，14］；鎳工肺癌細胞可見G∶C→T∶A的突變［15］。這些細胞的p53基因不能表達或表達極為低下。

2.丟失：基因丟失是基因失活的主要方式之一。在腸癌、肺癌等細胞常發生APC、Rb、p53、p16等抑癌基因的丟失。在鎳惡性轉化細胞中，也常觀察到染色體缺失現象，例如17p，xq等部分缺失［14，17，18］，它們與p53及衰老基因的丟失有關。

3.基因擴增：基因擴增常常是癌基因激活及高表達的原因，染色體均染區(HSR)的出現被視為基因擴增的可見證據［22］。在鎳所致腎肉瘤細胞及轉化細胞中就見到染色體均染區。同時，N-myc基因表達比正常細胞高6倍以上［7］，與人HL-60細胞N-myc基因擴增時見到的細胞遺傳學變化一致。

4.堿基甲基化及染色質濃縮：基因的甲基化狀態是調節基因表達的重要方式。DNA甲基化和染色體濃縮后造成的空間障礙，既不利于DNA的解鏈和解旋，又不利于轉錄因子與模板的結合，故基因表達失活或低下。一般而言，甲基化的基因常不表現活性，而表達的基因常處于非甲基化或低甲基化狀態［23］。鎳可以通過堿基甲基化而影響基因的表達。例如，鎳轉化的中國倉鼠細胞的X染色體長臂缺失，呈永生性。當往培養液中加入去甲基劑5-氮胞苷后，細胞逐漸衰老而死亡［17］。說明DNA甲基化是關閉衰老基因的原因。此外，由于鎳與異染色質的H1組蛋白有特異性親和力，能誘導染色質濃縮和甲基化。Lee等［24］證實鎳通過這種方式導致G12細胞的gpt基因關閉。他們觀察到：在鎳處理的培養細胞和游離核中，均可見到gpt基因特殊序列上DNA甲基化和染色質濃縮，相關基因gpt表達失活。若激活gpt基因表達，則DNA甲基化和染色質濃縮現象消失。

5.鋅指(zincfinger)結構的改變：鎳改變癌基因的表達可能與鋅指蛋白有關。鋅指蛋白是基因轉錄中反式作用因子結構上的DNA識別或結合結構域，包括鋅指、鋅扭(twist)和鋅簇(cluster)。其共同特點是通過α螺旋結合于DNA雙螺旋結構的主溝中，參與基因轉錄，其活性依賴于鋅離子［25］。鋅指結構富含半胱氨酸和組氨酸。由于鎳對半胱氨酸和組氨酸具有特殊的親和力，且與鋅同屬二價離子，故能與鋅競爭性結合氨基酸殘基，使鋅指變為“鎳指”，結果該結構發生扭曲，不能折疊，失去原有的立體結構，不能識別DNA特異位點，不能與之結合［26］。這可能是導致一些鎳轉化細胞中原癌基因失活不能表達的原因。此外，Sarker等［27］也發現鎳能取代鋅指結構中的鋅，不過作者認為鎳取代鋅是為了與DNA結合，并通過產生自由基等損傷DNA，從而誘發腫瘤。從空間構象上來說，前者更有說服力。

四、多基因變異與鎳致癌的關系

從以上研究可見，鎳不但激活原癌基因如c-ras、c-myc、c-fos、c-jun等的表達，而且能抑制抑癌基因如p53、Rb、衰老基因等的表達。它們在鎳致癌過程中如何起作用呢?

已經知道細胞的增殖遵循細胞周期，即從G1→S→G2→M→G1。在細胞周期中至少存在兩個重要的“生長控制點”(checkpoints)，一是G1→S轉變期；一是G2→M轉變期。這兩控制點都由一些重要癌基因蛋白調控。它們不僅能監控細胞數量的增加，而且能監視DNA損傷情況，阻止DNA損傷的細胞進入分裂期。例如：c-myc基因的表達能使細胞獲得通過生長控制點的能力，而c-ras的表達則加強c-myc的這種作用。p53蛋白能使DNA損傷細胞停留在G1期，不進入復制。在正常細胞中，癌基因的表達受細胞生長的調節，也是周期性的。但腫瘤細胞中，基因表達程度和次序發生紊亂，不再具有周期特異性。例如：在苯并(a)芘轉化細胞中，c-myc持續性高表達，不具周期性，故細胞持續增殖。再如p53等抑癌基因失活，則損傷細胞仍可復制、增殖。鎳誘導染色體畸變和DNA損傷已從許多方面得到了證實，而且由于多方面的作用，鎳能引起原癌基因的激活和抑癌基因的失活。這樣，一方面使得受損細胞能越過第一生長控制點(G1→S)，同時由于p53、Rb等監控基因的失活，具有DNA損傷的細胞也進入分裂期(G2→M)，使細胞癌變成為可能，并且在原癌基因大量表達的情況下，腫瘤的演變加速。

五、結語

綜上所述，鎳引起培養細胞的惡性轉化和鎳工肺癌的過程是一個多基因參與和多基因變異的過程。這些研究為進一步尋找與鎳致癌相關的基因提供了依據。已經發現的癌變相關基因就有100多種，而在鎳致癌的研究中，前后發現的相關基因也不過10來種。很顯然，就鎳誘發的染色體、DNA損傷的復雜、多樣性來看，與鎳致癌相關的基因遠不只上述幾個，還有更多的基因有待研究。

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