全菌體滅活菌苗現狀分析論文

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摘要對全菌體滅活菌苗（WCV）防治傳染病已進行了廣泛的研究，WCV是預防疾病的一種經濟、安全、有效的方法，但WCV的缺點是，胃腸外免疫能引起不良反應，而口服免疫常需大劑量，縣免疫力短暫。近期研究表明，能提高WCV免疫原性和增強口服免疫應答的新方法極有希望提高這些菌苗的效力。

動物模型和人研究顯示，WCV口服或胃腸外免疫均具有免疫原性，也具有預防呼吸道、腸道和全身性細菌感染的效力。雖然僅百日咳WCV被普遍應用，但其他WCV也具有普遍應用的潛力。本文報道了WCV研制的進展，重點闡述了制備更優質菌苗制劑的可能性。

腸道菌苗

空腸彎曲菌

空腸彎曲菌是引起胃腸炎的主要原因，估計全世界每年發病4億多例。某些地區的罹患率高達2.5萬~4萬/10萬。這種病原菌感染的主要后遺癥是Guillain-Rarré綜合征。一種傳統的空腸彎曲菌菌苗已在動物中進行試驗，這種菌苗（福馬林和加熱共同滅活，3劑）通過口飼給予小鼠，每劑間隔2天，并以大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT，25μg）為佐劑。免疫后4周在口服攻擊模型中評估各種劑量的含和不含佐劑菌苗（105、107或109個細菌）的效力。用活空腸彎曲菌（108個細菌，100×半數定居量）攻擊動物，并監測排菌情況。最大劑量菌苗和較小劑量含LT菌苗能預防定居，含或不含佐劑的菌苗均能預防細菌全身播散。兩種配方的菌苗接種小鼠后，均檢得空腸彎曲菌特異性血清IgA和IgG升高，但僅在含LT菌苗免疫小鼠中檢得腸道IgA。

這種菌苗還在恒河猴中進行試驗。猴子間隔14天接種2劑1010空腸彎曲菌菌苗加0.5~1000μgLT，未見不良反應。部分動物在6周時接受1劑加強免疫。不管菌苗（福馬林滅活）是否含LT，接種者對空腸彎曲菌的特異性T細胞應答均增強。由于初免程序后已獲得最大應答，因此無需加強免疫。免疫后7天，IgA分泌細胞在含LT菌苗接種動物中增多。

第2種空腸彎曲菌菌苗已產生，目前正在進行Ⅱ期攻擊研究評估。這種菌苗是利用能生產“抗原增強”菌苗的營養信號轉導（NST）技術制備的。制備菌苗所用的細菌是通過專門方法培養的，其對INT-407和Ca-Co-2人腸上皮細胞的粘附力和侵襲力均增強，并在福馬林滅活前與剛果紅的結合力提高。這些表型被認為是空腸彎曲菌和其他腸道病原菌毒力和相關抗原表達的重要標志。為了獲得這些特征，可將細菌置于含0.1%脫氧膽酸鈉的腦心浸液肉湯中，37℃、10%CO2條件下培養至穩定期。

用上述細菌制備的NST菌苗在動物中的免疫原性強于傳統方法制備的菌苗。NST菌苗免疫鼠腸道產生的抗原特異性IgA大于傳統菌苗免疫鼠。口服含LTnST菌苗的雪貂產生的血清IgG水平比含佐劑傳統菌苗免疫雪貂高15倍。用同源泉空腸彎曲菌口飼攻擊雪貂，17%的NST菌苗免疫動物發病，而接受傳統菌苗的動物的發病率達67%。

產腸毒素性大腸桿菌

產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是造成兒童嚴重脫水性腹瀉的最主要細菌，估計每年發病4億例，死亡70萬例。ETEC是造成旅游者腹瀉的主要原因，僅美國就影響800萬人。表達定居因子CFA/Ⅰ和CFA/Ⅱ的ETEC經福馬林滅活制成的菌苗已在人中進行評估。間隔2周口服3劑含或不含霍亂毒素B亞單位（CTB）的菌苗（1011個細菌/劑，5個菌毛型），免疫后7天檢測外周血抗體分泌細胞（ASC）。對CFA/cFA/Ⅰ和CFA/Ⅱ抗原產生應答的細胞主要是產生IgA的ASC，其次是IgM-ASC，IgG-ASC極少。2劑后的免疫應答最強。CTB不能增強對CFA/Ⅰ和CFA/Ⅱ抗原的應答。檢得對CTB產生應答的IgA-ASC，IgG-ASC，未檢得IgM-ASC，盡管對CFA的局部IgA應答極少與血清抗體水平的升高有關。在埃及進行的ETEC/重組CTB菌苗的研究中，74名21~45歲成人間隔2周接受2劑菌苗或安慰劑。受試者對CTB、CFA/Ⅰ、CS4、CS2和CS1的外周血IgAb細胞應答率顯著高于對照者。對滅活WCV產生強免疫應答的發現是重要的，因為口服純化的定居因子誘發的免疫應答微弱，且無保護作用。對菌苗的特異性T細胞應答也進行了評估。從接種者分離的人外周血單個核細胞中觀察到中等度的CFA依賴性體外增殖應答，用定居因子體外刺激應答細胞可產生高水平的γ干擾素（IFN-γ），未檢得白細胞介素2（IL-2）。應答細胞主要是CD4+T細胞，CD8+細胞較少。高水平IFN-γ的產生可能具有免疫學意義。IFN-γ能刺激B細胞分泌抗體，增加腸細胞分泌組分的表達。這種類型的應答除產生IgA分泌細胞外，還能介導對ETEC攻擊的防御作用。

受試者還接種了由大腸菌素E2處理滅活的ETEC菌苗。這種滅活方法能殺死菌苗，且不為化學或加熱處理所改變。間隔1個月口服2劑此菌苗（3×1010個細菌）能在77%的接種者中誘導腸道抗CFA/ⅠIgA應答，86%的接種者產生增強的抗LTigA應答。接種者均能抵御同源和異源菌的攻擊。

李斯德菌

單核細胞增多性李斯德桿菌是一種食物傳播的病原體，人群罹患率較低，但在易感人群中的死亡率很高。最常影響的人群是孕婦或其他免疫損害者。

加熱滅活的菌苗已在小鼠中進行評估。觀察到的保護性免疫應答的標志是誘導細胞毒性T細胞和IFN-γ。在具有或缺少CD4+細胞的動物中均可誘導免疫應答，通過有免疫力動物CD8+細胞的導入可把免疫力移至無免疫力動物。菌苗是用在胰酷胨豆胨培養液中培養過夜、經70℃、60分鐘加熱滅活的細菌制備的。

沙門菌

在空腸彎曲菌檢測前，沙門菌是美國引起胃腸炎的主要細菌，腸炎沙門菌仍是重要的病因。傷寒桿菌是傷寒的主要病因，全世界每年發病3000萬例，死亡50多萬例。加熱滅活的鼠傷寒桿菌菌苗已在小鼠中進行試驗，細菌在盧氏肉湯中培養至對數生長期，用沸水浴加熱45分鐘進行滅活。菌苗可經腹腔（ip）或皮內（id）途徑給予。ip接種鼠的淋巴細胞增殖應答強于id接種鼠，但在免疫后42天降至相同水平。ip接種鼠脾細胞產生的IL-4和IL-2水平亦較高。此外，T細胞免疫印跡檢測顯示，ip接種動物能對不同分子大小的抗原產生應答，而id接種鼠主要對＜18kDa的抗原產生應答。

福馬林、酚、丙酮滅活的鼠傷寒桿菌菌苗也在小鼠、大鼠和小牛中進行試驗，小鼠免疫丙酮滅活的WCV產生抗脂多糖（LPS）和全菌體（WC）抗體。小鼠免疫野型光滑株或粗糙突變株（不能產生O抗原）制備的菌苗所獲得的保護作用無差異。抵御致死攻擊的短期保護作用與WC凝集滴度密切相關，而長期保護作用與之無關。大鼠免疫福馬林滅活的菌苗能產生抗鼠傷寒桿菌抗體，且能抵御低水平的攻擊，但無胸腺大鼠卻不能，且能抵御低水平的攻擊，但無胸腺大鼠卻不能。用免疫動物的血清被動免疫無胸腺大鼠無效，而將免疫動物的脾細胞移給無胸腺大鼠則產生保護作用。這些研究提示，對菌苗的細胞介導免疫應答在抵御攻擊時起重要作用。

志賀菌

志賀菌引起的痢疾在全世界均有發生，估計每年發病2.5億例，死亡65萬例。幾項早期研究報道，一種滅活WCV能預防志賀菌病。有關這些菌苗組分的資料極少，但需口服大劑量才能奏效。其他途徑免疫有反應原性，且保護作用極小。在痢疾爆發地區給予人群口服免疫，并在這些現聲研究中比較免疫人群與未免疫人群的罹患率。雖然這些研究沒有很好的對照組，但顯然菌苗有一定的保護作用。菌苗效力不佳部分由于這些口服WCV中并不存在高水平的相關抗原和難以刺激對死菌的口服免疫應答。

目前已制成NST福氏志賀菌菌苗，并在小鼠鼻攻擊模型中進行試驗。與制備傳統菌苗的細菌相比，制備種菌苗的NST細菌具有對人腸道細胞更強烈的粘附和侵襲力，能產生較高水平的毒力相關蛋白，且與剛果紅的結合水平提高。這種菌苗由福氏志賀菌2457T株構成，2457T株被培養于含0.1%脫氧膽酸鈉的腦心浸液肉湯中，于37℃培養至對數生長早期，然后經福馬林滅活。在凝集測定時，用NST培養的福氏志賀菌免疫家兔制備的兔超免疫抗血清能與同樣培養的宋內志賀菌發生交叉反應。在小鼠模型中含LT的NST菌苗與EcSf2a-2減毒活菌苗的效力相同，且比傳統方法制備的WCV更有效。

霍亂弧菌

霍亂是由霍亂弧菌引起的，主要特征是嚴重的脫水性腹瀉，估計每年發病700萬例，死亡10萬多例。

已在動物和人中對霍亂WCV進行了大量的研究，用堆亂WCV+CTB胃腸外免疫小鼠能抵御霍亂毒素（CT，2.25~3LD50）的攻擊，這與免疫CVD103-Hg減毒活菌苗的結果相同：分別有100%和70%的小鼠能抵御2.25和3LD50的CT攻擊。小鼠口服CT能誘生產生IgA應答的外周血淋巴細胞（PBL）。胃腸外免疫2劑類毒素或滅活菌苗的家兔能抵御活菌的攻擊。胃腸外和口服途徑一同給予類毒素和WCV均有協同作用和保護作用。

接種者間隔2周口服3劑菌苗（含加熱滅活的稻葉型和小川型霍亂弧菌、福馬林滅活的稻葉型和小川型ElTor弧菌各2.5×1010，有時含CTB），菌苗可被很好耐受，無副作用報告?？诜?劑菌苗能誘導相似的IgA和IgG抗毒素和殺弧菌抗體應答。

用1×106個霍亂弧菌攻擊，64%的WCV+CTB接種者獲得保護，56%的WCV接種者獲得保護，而對照組則90%發病。此外，發病的接種者的癥狀減輕。在孟加拉國的一項WCV現場研究中，2年內WCV的有效率為60%。在免疫成人中，3年中預防古典型霍亂的有效率為58%~76%，預防EITor型霍亂的有效率為48%~64%。菌苗在2~5歲兒童中的有效率為40%~56%，但預防ElTor型霍亂的效果較差。免疫接種后亦可觀察到死亡率降低。霍亂菌苗含有與其他致病性弧菌發生交叉反應的抗原，但接種霍亂菌苗不能預防非霍亂弧菌感染，盡管接種組的罹患率較低。在CTB+霍亂弧菌全菌體（WC-BS）菌苗的現場試驗中，免疫接種后能短期預防ETEC引起的腹瀉。接受WC-BS菌苗的旅游者亦能預防ETEC引起的腹瀉及ETEC與其他病原體的混合感染。

還對口服霍亂菌苗的免疫應答進行了評估。在瑞典志愿者中，在67%的口服單劑WC-BS菌苗者的腸灌洗液樣本中檢得升高的抗毒素IgA抗體，在93%的血清樣本和64%的唾液樣本中檢得升高的抗毒素抗體，接種者對菌苗的應答情況與恢復期病人相仿。在孟加拉國現場試驗期間，WCV和WCV+CTB接種者的殺弧菌抗體滴度升高1.3~2.1倍，免疫后7個月滴度有所回落，但保護作用可持續3年。接受1劑和3劑者的抗體滴度相近，但僅接受3劑者獲得保護。接受CTB+WCV接種者的抗毒素滴度升高2.5~4.5倍。在其他研究中，在接受WCV者中，71%的接種者的殺弧菌抗體、57%的接種者的抗LPS和外膜蛋白（OMP）抗體、43%的接種者的抗血凝素抗體滴度升高4倍以上。在接受WC-BS者中，89%的接種者的殺弧菌抗體、68%的接種者的抗LPS和OMP抗體、32%接種者的抗毒素滴度升高4倍以上。在5~64歲接種者中，WCV+CTB均能顯著提高IgG和IgA抗毒素和殺弧菌抗體滴度，而在4~12歲的接種者中僅抗毒素滴度升高?？诜臀改c外接種WC-BS菌苗均能誘生抗霍亂毒素的各類IgG和IgA1抗體，與恢復期病人產生的抗體相仿。反復免疫能誘生高水平的抗毒素IgG4抗體。免疫后檢測接種者的PBL顯示，口服免疫后的PBL主要產生IgA抗體，而胃腸外免疫后則主要產生IgG抗體應答，免疫后1年，接種者中存在產生抗毒素的PBL，且能產生以IgA和IgM同型為主的回憶應答。

霍亂弧菌滅活菌苗的制備方法可按NST空腸彎曲菌菌苗的制備方法加以改進。將霍亂弧菌569B株培養于含膽汁或脫氧膽酸鈉的蛋白胨牛肉浸膏培養基中，于37℃培養至對數生長早期，即其對人腸道細胞的粘附水平較高時，提示粘附素產生增加。此外，應用能構建超表達重要毒力相關抗原的菌株來制備福馬林滅活的菌苗是極有希望的，在越南現場試驗期間，用表達毒素共調節菌毛的霍亂弧菌制備WCV顯示有效。

參考文獻

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