狹霉素研究論文

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【摘要】狹霉素(angustmycin)有A、B和C三個組分，其中A和C為核苷類化合物，B組分為腺嘌呤。狹霉素A是一種特異的鳥嘌呤核苷酸(GMP)合成酶抑制劑，在實驗室中廣泛應用。近十年來，我國科學工作者發現它具有植物細胞分裂素的生物活性，在植物學研究及農業生產上也有良好的應用前景。

【關鍵詞】狹霉素A作用機制應用研究

Advancesinangustmycinsandtheirapplications

ABSTRACTAngustmycinshavethreeconstituents:angustmycinA,BandC.AngustmycinAandCarenucleosideantibiotics,andangustmycinBisidenticalwithadenine.AngustmycinA(alsocalledlingfasu)hasbeenappliedinthelaboratoryasaspecificinhibitorofGMPsynthase.Inthelasttenyears,ChinesescientistshavefoundthatangustmycinAhadbiologicalactivitiesofcytokinin.Ithasapromisingapplicationsinthebotanicalresearchandtheagriculturalproduction.

KEYWORDSAngustmycinA;Mechanismofaction;Applicationresearch

狹霉素(angustmycins)是由吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicsvar.angustmyceticus)產生的抗生素。已知它包括狹霉素A(angustmycinA)、狹霉素B(angustmycinB)和狹霉素C(angustmycinC)三種組分，其中組分B是腺嘌呤(adenine)，A和C是腺嘌呤的核苷類衍生物(Fig.1)。自20世紀50年代狹霉素被發現以來，由于其抗菌譜極窄且抗菌活性較弱，并不為人們所矚目。然而近十多年來的研究進展重新喚起了

Fig.1ThestructuresofangustmycinAandC人們對狹霉素的興趣，特別是我國農業科學工作者發現狹霉素A對植物有明顯的生物活性，被視為一種新的植物生長調節劑。研究者將其重新命名為“PGR08”(plantgrowthregulator08，植物生長調節劑08)和“靈發素”(lingfasu，LFS)，為狹霉素A的深入研究與應用開辟了新的領域。下面就狹霉素的發現、研究進展及其新用途作一概述。

1狹霉素的發現

1954年東京大學農業化學系Yuntsen等在尋找抗結核菌株的過程中從東京附近的土壤中分離到一個新菌株6A704［1］。該菌株能產生一種特異性抑制分枝桿菌的物質，對其它的革蘭陰性、陽性細菌、真菌和酵母無效。通過分離純化，得到了粗結晶，并且初步對其理化性質、生物活性和穩定性進行了測定。

1956年Yuntsen等又發現他們以前獲得的狹霉素是由三個組分組成，即狹霉素A、B和C，并對它們的分離技術、理化性質等方面做了進一步研究［2］。

狹霉素A含水結晶的熔點128～130℃，163～164.5℃降解；甲醇中的結晶不含水，172～174℃降解。在260nm處有最大紫外吸收峰(甲醇溶液中)。狹霉素A溶于水、甲醇、乙醇、吡啶、乙酸、二甲基甲酰胺、苯酚，難溶于丁醇、二氧六環，不溶于乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳、乙酸乙酯和其它有機化合物。對Schiff、ninhydrin、FeCl3、Sakaguchi、Molisch、Indole、ammoniacalAgNO3、Kossel和Fearonmitchel試劑呈陽性反應，對Fehling試劑呈陰性反應。

狹霉素B在350～355℃降解，220℃左右升華，分子式C5H5N5，260nm的紫外最大吸收、紅外光譜均與腺嘌呤相同。因此，狹霉素B即為腺嘌呤。

狹霉素熱穩定性較好，在pH5～9的條件下能保持穩定。但在100℃，pH2的條件下，5min失活。

通過連續稀釋實驗，確定狹霉素抑制Mycobacterium607和Mycobacteriumphlei生長的最低抑菌濃度為25μg/ml。對于惡性MycobacteriaH37Rv在濃度100μg/ml時也沒有活性。狹霉素是幾乎沒有毒性的物質。小鼠腹腔內注射2.5g/kg，沒有任何毒副反應。

2研究進展

1959年Eble等［3～6］對狹霉素C的研究結果顯示，狹霉素C極易溶于二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和熱水中，室溫下的溶解度為：水8mg/ml，甲醇8mg/ml，乙醇6mg/ml，1丁醇2mg/ml，乙酸乙酯0.23mg/ml。25℃的比旋度為-53.7°(c，1%的二甲基亞砜溶液)、-68°(c，1%的二甲基甲酰胺溶液)。在酸性條件下不是很穩定，pH2.0，30℃的半衰期是18h；中性條件下0到25℃很穩定。在0.01mol/L酸溶液中259nm時紫外光譜的吸收系數是508；同時證實了狹霉素C就是阿洛酮糖腺苷(psicofuranine)，結構為6amino9(βDpsicofuranosyl)purine。狹霉素C在體內有抗微生物和抗腫瘤活性，小鼠防護實驗中無論口服還是皮下給藥都能有效的抑制Streptococcushemolyticus和Escherichiacoli。對Diplococcuspneumoniae、Proteusvulgaris、Pseudomonasaeruginosa和Salmonella的感染沒有活性，對病毒和線蟲感染也不起作用。該抗生素還能降低小鼠腎細胞Micrococcusaureus慢性感染的數目。在普通的肉湯和瓊脂培養基中，狹霉素C在體外沒有活性，但在含有肝臟提取液的半合成培養基中，檢定板在檢測前冷藏4h的情況下，狹霉素C在體外對Salmonellapullorum、Staphylococcusaureus、Staphylococcusalbus、Streptococcushemolyticus和Escherichiacoli有活性。狹霉素C在體外用平板擴散法檢測的限度：水中10mg/ml，血液中3mg/ml；濁度評價的檢測限度0.5mg/ml。檢定菌均為StaphylococcusaureusFDA209P。

Yuntsen等在1958年報道了狹霉素A的結構［7］。隨著研究的深入，1964年Hocksema通過核磁共振光譜認為以前提出的結構有誤，指出在糖基中不存在C甲基基團［8］，對1958年報道的結構進行了修正，同時證明了狹霉素A就是德夸霉素(decoyinine)［8］。德夸霉素原為阿洛酮糖腺苷發酵過程的副產物，與狹霉素A具有相同的分子式，水合產物、甲醇和乙醇的溶劑化物有相同的熔點，相同的紅外光譜。通過兩者的核磁共振光譜及其相關降解產物的比較，顯示兩者同質。

1966年Chassy等推斷出德夸霉素中糖的結構為6DeoxyDerythro2，5hexodiulose，完成了糖的生物合成過程的研究，指出糖的合成直接來源于D［114C］葡萄糖或14C標記的D果糖。同時通過14C標記狹霉素C中的腺嘌呤，證實了在Streptomyceshygroscopicus發酵過程中狹霉素A、C可以相互轉化［9］。

1968年McCarthy等完成了狹霉素C到狹霉素A的化學轉化過程［10］。狹霉素C經過下面5個步驟，轉換為狹霉素A。

*與原甲酸乙酯(三乙氧基甲烷)在15℃反應48～96h；

*在純二氧雜環乙烷中與三氟化硼乙醚反應；

*在吡啶中與對甲苯磺酰氯反應；

*在叔丁醇吡啶溶液中與叔丁醇鉀反應；

*在冰乙酸中與二氧雜環乙烷在50℃反應30h

20世紀60年代末，我國抗生素工作者從我國的土壤中也篩選到了狹霉素的產生菌，獲得了狹霉素的A、B和C結晶。A組分命名為“Antibiotic8”(抗菌素8號)，被證實對黏膜炎布拉漢菌(Branhamellacatarrhalis)有很強的活性。該結果被收錄于1977年版的《抗菌素生物理化特性第1分冊》［11］。

近年來我國抗生素工作者又對狹霉素進行了現代光譜學研究，特別是通過X射線單晶衍射的測定，進一步明確了狹霉素A晶體的立體結構［12］(Fig.2)。狹霉素A晶體結構屬三方晶系，空間群為P3或P3z；晶胞參數：a=b=10.736(1)，c=10.030(1)，γ=120.000，V=1001.19(1)3，Z=3；分子式為C11H13O4N5·H2O，含一分子結晶水，不含結晶水的相對分子質量為279.26。分子的骨架有三個環，A環和B環共平面，C環呈信封式構象，A、B環與C環的二面角值為72.9(4)0。

3狹霉素的抗菌活性與作用機制Fig.2ThespatialstructureofangustmycinA

1961年Miyairi等［13］報道，狹霉素A、C在合成培養基中均有抗微生物的活性，在天然培養基中無活性，其活性能被鳥嘌呤、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤核苷及相關物質抑制。狹霉素A能抑制枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)核酸片段合成過程中32P的進入，通過紫外吸收法可以看到核酸數量的減少；在狹霉素A作用于枯草芽孢桿菌PCI2191h后再加入14C標記的氨基酸，可以看到狹霉素A能減弱14C標記的氨基酸進入枯草芽孢桿菌PCI219機體的蛋白質片段。根據這些生化現象與專性抑制劑化合物的結構推斷，狹霉素A在微生物的核酸及蛋白質的生物合成代謝中具有抑制劑作用，所以表現出抗微生物的活性。狹霉素C抗腫瘤轉移的作用機制也是類似情況。

1964年Bloch［14］進一步明確了狹霉素A的作用機制，指出它對磷酸核糖焦磷酸化激酶有抑制作用，從而抑制XMP(黃嘌呤核苷酸)轉化為GMP(鳥嘌呤核苷酸)。

4狹霉素A的應用

4.1在實驗室研究工作中的應用

狹霉素A在國外目前最主要的是把它作為一種特異性的GMP合成酶抑制劑，比較廣泛地用于實驗室研究工作。

(1)加入狹霉素A，枯草芽孢桿菌在營養豐富的條件下孢子的形成為指數性增長［15］。

(2)狹霉素A可以影響枯草芽孢桿菌細胞壁的必要組成成分肽聚糖(peptidoglycan)的合成和翻轉。加入狹霉素A5min后，細胞壁合成速率下降了50%。它除了可以抑制細胞壁生物合成途徑的最后一部分，還可以防止細胞的自溶和細胞壁翻轉。在氨基酸和葡萄糖存在的條件下，加入狹霉素A可以除去細胞中的鳥嘌呤核苷，從而誘導枯草芽孢桿菌孢子的形成［16］。

(3)在特定的培養基中，狹霉素A可以引起枯草芽孢桿菌中順烏頭酸激酶活性和citB基因復制的同步增長［17］。

(4)狹霉素A可以使細胞在限制性培養基中生成氣生菌絲；它還能有效地抑制液體培養基中水生孢子的形成［18］。

(5)狹霉素在其它新陳代謝副產物反饋抑制的條件下，控制枯草芽孢桿菌孢子形成的開始和進展。它不能逆轉枯草芽孢桿菌野生菌株中代謝副產物對α淀粉合成酶的抑制作用，但是可以促進突變株中合成的能力。它不影響α淀粉合成酶的活性［19］。

(6)狹霉素A誘導松弛型枯草芽孢桿菌菌株中基因comG的表達能力，同時使細胞內GTP(鳥苷三磷酸)水平的急劇降低。在指數期到穩定期之間加入狹霉素A，松弛型菌株中的轉換數提高了100倍［20］。

4.2在植物和農業上的應用

植物細胞分裂素(cytokinin，CTK)是一類普遍存在于植物界且非常重要的植物激素，直接影響植物的細胞分裂、器官建成、葉片衰老和其它一些重要的生理過程。我國科技工作者在20世紀80年代末首先證明了狹霉素A具有植物細胞分裂素的生物活性，并用研究代號PGR08發表了最初的部分研究結果［21，22］。用高壓液相層析(HPLC)技術證明，PGR08在植物組織培養基滅菌時所需要的pH及高溫高壓條件下不被破壞分解，這種穩定性為其在植物組織培養中的推廣應用提供了基本保證。為便于在農業領域推廣應用，隨后又以“08”的諧音取名為“靈發素”(lingfasu，LFS)，并在促進種子萌發、植物組織培養和蔬菜保鮮等方面成功地加以應用，取得了良好的效果。將狹霉素A的研究從醫藥學引入植物學和農學，開創了新的研究領域，并在國內獲得了發明專利［23］(專利號：ZL02154161.2)。

(1)“靈發素”對小麥種子萌發與幼苗生長的影響［24］通過PGR08浸種處理，在(25±1)℃條件下，小麥種子發芽率48h內比對照增加9.3%～19.3%，同時種子中淀粉酶的活性比對照增加106.3%～162.5%。育苗6d后，苗高與根長都相當于對照的2～4倍。25d后，麥苗的一級分蘗相當于對照的1.6～2.3倍，并有1/4～1/2的植株出現二級分蘗。同樣條件下，對照組卻無二級分蘗。上述結果證明PGR08有促進植物生長的生物活性。

(2)PGR08對小麥幼苗抗旱性的影響［25］PGR08浸種，可使4葉期的小麥幼苗在干旱脅迫下，葉片氣孔阻力增大，蒸騰強度下降，保水力提高，束縛水/自由水比值上升，而總含水量無明顯變化。同時，葉片中葉綠素、可溶性蛋白質的含量亦維持在較高水平，萎蔫系數略有下降。從而證明PGR08對植物有一定的抗逆和抗衰老作用。

(3)“靈發素”直接誘導馬鈴薯愈傷組織分化試管薯［26］目前國內、外都是通過誘導馬鈴薯試管苗匍匐莖或者莖段腋芽的膨大來生產試管薯。用LFS直接誘導馬鈴薯愈傷組織分化試管薯，不僅直接證明LFS具有促進植物細胞分裂和誘導植物器官分化的生物活性，而且可能為馬鈴薯試管薯的獲得提供一條更簡便的途徑。

(4)“靈發素”對三七愈傷組織發生和增殖的影響［27］以三七莖段為外植體，用以下5組MS改良培養基進行對比研究：①MS(MurashigeSkoog)+2，4D2.0(mg/L，下同)(CK)；②MS+2，4D2.0+N6BA(N6芐基腺嘌呤)2.0；③MS+2，4D2.0+KT(激動素)2.0；④MS+2，4D2.0+ZT(玉米素)2.0；⑤MS+2，4D2.0+LFS2.0。結果表明，在CK的基礎上添加LFS可以促進莖段愈傷組織早發生1～2周，誘導率達81%，比CK高出30%以上。LFS能使愈傷組織的鮮重在40d內增加360.2%，而KT、ZT和N6BA僅增加13.4%～21.8%。以平均接種1g愈傷組織計，40d內含LFS的第⑤組收獲干物質81.5mg，另外4組只能收21.6～25.9mg。特別是LFS可以使愈傷組織繼代保存3年以上未表現老化跡象，一直保持增殖能力，提示LFS有顯著促進植物細胞分裂的能力，這正是一般植物細胞分裂素典型的生物活性。

(5)“靈發素”對三七胚狀體發生及其成苗的影響［28］以MS為基本培養基，加入適量的2，4D和LFS，暗處培養，三七莖段愈傷組織可被誘導出胚狀體，2～3個月內發生機率可達90%左右。MS+2，4D1.5+LFS2.0于光下培養，約有30%以上的胚狀體能發育成健壯的全苗，說明LFS有促進植物分生組織進行器官分化的活性。

(6)在羅漢果組織培養中的生物效應［29］在羅漢果組織培養中，LFS可誘導外植體腋芽優先萌發，并迅速生長。由于營養分配利用的原因，同時抑制了愈傷組織的發生和生長，在繼代苗的增殖中也有同樣表現。愈傷組織的顯著減少對保持組織培養苗的遺傳穩定性，減少不良變異，具有積極意義。以MS為基本培養基，添加LFS0.2mg/L，可使羅漢果單節莖段外植體成苗率達90%以上；添加等量的N6BA或KT時，成苗率不足30%，且生成大量愈傷組織。

LFS還可以顯著促進不定根的發生與生長，無須添加任何生長素，即可使羅漢果組織培養繼代苗發育成根苗齊全的再生植株。這有利縮短生產周期，提高羅漢果組織培養苗的質量。目前學術界普遍認為N6BA和KT都是抑制植物不定根的發生。LFS與N6BA及KT同屬腺嘌呤類細胞分裂素，但對植物不定根的發生，卻有截然相反的作用。對此許鴻源認為，如能深究這一現象的內在原因，將有利于揭示植物不定根發生的生理機制。

(7)對蔬菜菊花腦的保鮮作用［30］菊花腦具有清熱解毒、平肝明目的功效，是一種保健型蔬菜。LFS能顯著抑制其呼吸強度，減緩葉綠素和維生素C的降解速度。在(8±2)℃時，10mg/L的LFS比同濃度的N6BA、KT和3mg/L的CPPU(N2氯4吡啶基，N苯基脲)有更好的保鮮效果，儲存10d外觀仍青綠鮮活，無任何異味。

5結束語

狹霉素A作為一種原來不太被人們重視的抗生素品種，隨著應用研究的不斷深入，逐漸擴大了它的使用范圍，特別是我國學者在農業方面的研究，使這個在醫藥界尚無大作為的抗生素搖身變成了一種新的植物生長調節劑，在植物學和農學方面展現了良好的應用前景和社會價值。但是，在國內狹霉素A(靈發素，PGR08)至今沒有工業化生產，國外的價格又十分昂貴(Alexis生產，280元/mg)。所以筆者認為，若能夠對狹霉素A進行深入的研究開發，并實現其產業化批量生產，滿足科學研究和農業上生產的需要，將會有光明前景。

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