大鼠急性肺損傷分析論文

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【摘要】目的觀察K252a（MLK3阻斷劑）對內毒素性急性肺損傷大鼠肺病理組織學改變及生存率的影響。方法采用尾靜脈注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）復制內毒素性急性肺損傷模型。90只大鼠隨機分為6組（n=15）：對照組(control組)、LPS組、K252a50μg/kg組（K50組）、K252a75μg/kg組（K75組）、K252a100μg/kg組（K100組）和溶劑對照組（DMSO組）。模型制備成功后6h取肺臟進行光鏡檢查，觀察48h內大鼠死亡情況并比較累計生存率。結果48h內LPS組、K50組、K75組和K100組以及DMSO組大鼠生存率分別為6.3%、27%、72%、57%及6.7%。光鏡下可見LPS組大鼠肺組織結構明顯被破壞，主要表現為肺泡內出血、肺間質水腫、肺泡萎陷以及肺組織內大量炎性細胞浸潤。與LPS組相比，預先應用K252a組肺組織的損傷程度較輕微、肺間隔輕度增寬、無明顯出血、少量炎性細胞浸潤，尤其K75組，減輕程度最明顯。結論K252a延遲LPS大鼠死亡時間，并呈現劑量依賴性，75μg/kgK252a劑量可以明顯提高其生存率。并可改善內毒素性急性肺損傷大鼠肺臟的病理組織學結果。

【關鍵詞】K252a;MLK3;內毒素;急性肺損傷；大鼠;生存率

ProtectiveeffectsofK252aonendotoxin-inducedacutelunginjuryinrats

endotoxin-inducedacutelunginjuryinrats

ZHANGMaoyin1,CHENLong1,CHENGQin1,ZHANGWenwen1,LIUSu2,WANGGuanglei2,LIUGongjian2

(1.JiangsuProvinceKeyLaboratoryofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China;

2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofK252a(MLK3blocker)onthepathohistologicalchangesinthelungsandthesurvivalrateinratswithendotoxin-inducedacutelunginjury.MethodsRatsmodelsofacutelunginjurywereestablishedbyadministrationoflipopolysaccharide(LPS)asendotoxininthecaudalvein.90healthymaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedinto6groups(n=15):controlgroup,LPSgroup,K252a50μg/kggroup(K50),K252a75μg/kggroup(K75),K252a100μg/kggroup(K100)andvehiclecontrolgroup(DMSO).Eachgroupwassampled6hafteradministrationofLPSforlightmicroscopyexamination.Thedeathsduring48hineachgroupwereobservedandtheaccumulatedsurvivalrateswerecompared.ResultsWithin48hours,thesurvivalratesofLPSgroup,K50group,K75group,K100groupandDMSOgroupwere6.3%,27%,72%,57%and6.7%,paredwiththecontrolgroup,inLPSgroup,lightmicroscopyrevealedobviousdamagetolungtissues,characterizedbyalveolarhemorrhage,pulmonaryinterstitialedema,paredwithLPSgroup,theK252agrouphadmildhistologicalinjurytolungtissues,withslightthickeningofalveolarseptaandnoevidenthemorrhage,andmildinflammatorycellinfiltration.InK75group,inparticular,thereliefwasmostnoticeable(P<0.05).ConclusionK252acanretardthedeathofLPS-injectedratswithdosedependenceandrelievetheendotoxin-inducedacutelunginjuryinrats.

Keywords:K252a;MLK3;lipopolysaccharide;acutelunginjury;rats;survivalrate

急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）是臨床常見的危重病，是重癥監護治療的重要課題。其本質是以炎癥介質過度釋放為特征的肺部廣泛炎癥反應［1］。由于ALI/ARDS病因與發病機制的復雜性，近年來盡管進行了大量的研究，但其病死率仍居高不下［2］。因此深入了解并研究ALI/ARDS的發病機制，具有重要意義。本實驗采用大鼠尾靜脈注射LPS復制內毒素性急性肺損傷模型，應用p38MAPK上游MLK3的抑制劑K252a對內毒素性急性肺損傷大鼠進行干預，觀察其對大鼠肺臟病理組織學改變及生存時間的影響，旨在探討K252a對急性肺損傷有無保護作用，從而為抗炎治療增添一條新的途徑，還有助于尋找對ALI/ARDS更有效的治療方法。

1材料和方法

1.1實驗動物及試劑成年雄性SD大鼠，體重200～250g，購自中國科學院上海實驗動物中心。LPS（E.coli，011:B4）、K252a、DMSO（dimethylsulfoxide，二甲基甲酰胺）均購自美國Sigma公司。

1.2模型制備和分組實驗動物隨機分為6組（n=15）：對照組（Control組），僅注射生理鹽水；LPS組，經尾靜脈注射LPS5mg/kg；K252a50μg/kg組（K50組）、K252a75μg/kg組（K75組）和K252a100μg/kg組（K100組），分別在注射LPS前30min尾靜脈注射K252a50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg；溶劑對照組（DMSO組）在注射LPS前30min尾靜脈注射DMSO0.2ml。本實驗中所選用藥物劑量及給藥方式是依參照文獻［3］、［4］及我們的預實驗結果而定。

1.3病理學檢查注射LPS后6h取適量肺組織，經4%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色后，光鏡下觀察病理改變。

1.4生存率分析為了證實K252a對急性肺損傷的保護作用，觀察各組大鼠48h內的生存情況。

1.5統計學分析所有數據均以±s表示，統計分析采用單因素方差分析（ANOVA）和Student′st檢驗。死亡率分析采用Kaplan-Meier檢驗。P<0.05認為有統計學意義。所有統計均由SPSS13.0統計軟件處理完成。

2結果

2.1病理學檢查見圖1。與對照組相比，LPS組大鼠肺組織的結構破壞明顯，主要表現為肺泡內出血、肺間質水腫、肺泡萎陷以及肺組織內大量的炎性細胞浸潤（圖1-B）。與LPS組相比，預先應用K252a各組大鼠肺組織的損傷程度減輕，表現為肺間隔輕度增寬、無明顯出血、少量炎性細胞浸潤（圖1-D、1-E、1-F），尤其K75組，減輕程度最明顯。

2.2生存率分析見表1。與LPS組相比，K75組的生存率明顯提高(P<0.05)，而DMSO組與LPS組之間的生存率差異無顯著性。這表明K252a能夠限制LPS的致死率，尤其是75μg/kg劑量組。表1各組平均生存時間及生存率比較

3討論

ALI/ARDS的發生發展是一個復雜的過程，涉及了許多信號轉導途徑。在以往的研究中，人們都將注意力放在NF-κB信號通路上，因為該通路可以誘導多種炎性細胞因子的表達。然而，ALI/ARDS發生發展是一個復雜的過程，涉及了許多信號轉導過程，不僅有NF-κB信號通路，還有許多其他激酶通路。近年來，大量的離體研究顯示，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）家族均參與調節了炎性介質的產生，且參與了機體炎癥反應的發生與發展。如p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、細胞外信號調節激酶（ERK）等，其中，p38MAPK被認為是在應激信號傳遞中最重要的調節者之一，在調節細胞的凋亡以及細胞因子的產生中發揮著重要的作用。Kim等［5］曾報道p38MAPK參與調節了人肺血管內皮細胞中TNF-α誘導的IL-8的產生。還有證據顯示p38MAPK參與了LPS誘導的中性粒細胞中NF-κB的核轉位。p38MAPK介導了LPS引起的支氣管收縮和中性粒細胞的聚集。

由于p38MAPK的特異性抑制劑——SB203580的發現，又為研究p38MAPK的細胞內信號通路提供了一個有效的工具。據報道，在LPS刺激的單核細胞中，TNF-α和IL-1的產生與p38MAPK的活化密切相關［6］。還有報道指出p38MAPK抑制劑SB203580預處理可下調大鼠細胞黏附分子ICAM-1的表達，減輕肺組織的病理損害，能起到防治ALI的作用。最近，又有研究［7］表明，巨噬細胞的糖皮質激素受體通過選擇性抑制p38MAPK來抑制toll樣受體介導的炎癥反應。此外，p38信號通路還參與了大鼠急性重癥胰腺炎所導致的急性肺損傷的發生，抑制p38MAPK，能明顯地降低其肺損傷的程度［8］。盡管大量研究顯示，p38MAPK信號通路對炎癥介質的調節起著重要的作用，但是有關p38MAPK信號通路對LPS導致的ALI的調節作用的在體研究還很少，并且，其作用機制也尚未明確。

本實驗中我們探討了人為阻斷MLK3-MKK3/6-p38MAPK信號通路對內毒素誘導急性肺損傷大鼠的影響，選擇K252a作為MLK3的抑制劑。本研究發現：K252a能延遲內毒素誘導急性肺損傷大鼠的死亡時間，并呈劑量依賴性，K252a75μg/kg劑量組可明顯提高其生存率，并能明顯改善內毒素性急性肺損傷大鼠肺臟的病理組織學結果。提示K252a對內毒素誘導急性肺損傷大鼠有保護作用，其機制可能是：抑制MLK3的磷酸化能有效地阻止LPS引起的肺損傷的級聯反應。

在此基礎上，我們認為，p38MAPK信號通路的活化可能是急性肺損傷發生發展的機制之一，在信號通路水平阻斷和調控MLK3及p38MAPK的表達和活性，將可能成為治療急性肺損傷的一條新途徑。而且尤為重要的是，MLK3抑制劑可能比p38MAPK抑制劑更具有臨床應用前景，其更加強對休克、創傷、感染、炎癥的早期處理，以消除產生過度炎癥反應的條件，否則一旦病情發展到失控性炎癥反應階段，現有的一切手段都會顯得蒼白無力。

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