神經干細胞培養管理論文

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【摘要】目的探討2型重組腺相關病毒（recombinantadeno-associatedvirus2,rAAV-2）載體能否有效地轉染NSCs。方法采用含有增強型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）報告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染復數（multiplicityofinfection,MOI）分別為1×104、1×105、1×106轉染體外分離、培養的大鼠胎鼠NSCs，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達；同時檢測子代細胞的活力、增殖倍數、分化情況來評估對其存活、增殖、分化能力的影響；當EGFP表達穩定后，流式細胞儀檢測rAAV-2/EGFP對NSCs的轉染效率。結果轉染10天后各轉染組便可觀察到NSCs克隆球發出綠色熒光，起始熒光強度不一，隨MOI值的增大而增強；各轉染組熒光強度隨時間的延長而逐漸增強，至轉染21天后達高峰并維持，此時流式細胞儀檢測rAAV-2對NSCs的轉染效率：MOI為1×104、1×105、1×106時轉染率分別為25.68%、50.60%、54.72%,熒光指數（FI）分別為4.08、12.72、14.06；轉染組和未轉染組細胞培養7、14、21天時其細胞活力、增殖倍數、分化差異均無顯著性。結論rAAV-2能有效地轉染NSCs，所介導的目的基因能高效表達。

【關鍵詞】神經干細胞；2型腺相關病毒；轉染；感染復數；綠色熒光蛋白；熒光指數；細胞活力

綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一種新的報告基因，由于其表達產物GFP可被直接激發產生熒光，不需要任何底物或輔助因子，較傳統的標記基因如β2-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因等更具有明顯的優越性；在GFP的基礎上進行F64L和S65T的突變從而形成增強型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增強了GFP的熒光性能，更容易觀察、檢測［1］。2型腺相關病毒具有與人類疾病無相關性、宿主范圍廣、可整合入細胞染色體DNA介導外源基因長期表達等優點,是較理想的基因載體［2］。隨著神經干細胞（neuralstemcells，NSCs）的分離、培養、純化及生物學功能研究深入［3～5］，尋找NSCs基因修飾載體及標記分子，已成為研究NSCs在體內、外分化調控和細胞工程基因治療中樞系統疾病的研究熱點。運用基因修飾神經干細胞治療中樞系統疾病具有細胞修復和轉基因治療的雙重優勢。理想的基因轉移載體是基因修飾的關鍵。

1材料與方法

1.1病毒載體rAAV-2/EGFP購于863生物領域病毒基因載體研究開發基地、北京本元正陽基因技術股份有限公司，滴度為5×1011v.g/ml。

1.2神經干細胞分離、培養、鑒定［6］按參考文獻進行，體外分離胚胎大鼠大腦額葉皮質、懸浮培養，經Nestine鑒定為神經干細胞（見圖1），作為實驗細胞株。

1.3主要試劑、儀器DMEM/F12培養液、胎牛血清（HyClone公司產品）；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）（SIGMA公司產品）；兔抗巢蛋白Nestin抗體、羅丹明標記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋公司產品）。相差倒置顯微鏡（Cannon）、倒置熒光顯微鏡（Nikon）、細胞計數板、CO2培養箱、超凈臺、流式細胞儀（BD）。

1.4rAAV-2/EGFP體外轉染神經干細胞

1.4.1分組取生長良好的NSCs，機械反復輕柔吹打分散、200目不銹鋼篩網過濾制備成單細胞懸液，以1×105個細胞/孔接種于4塊6孔培養板中，分別按感染復數（MOI）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×106轉染，設四組，其中MOI=0作為未轉染對照組。

1.4.2轉染轉染時先按MOI值計算所需加入rAAV-2/EGFP病毒載體的體積數，在試管中將所需加入rAAV-2/EGFP病毒載體與DMEM/F12培養液混合形成轉染液，將每組對應孔中加入相應的2ml轉染液，MOI=0作為未轉染對照組，同樣操作但不轉染rAAV-2/EGFP，37℃，5%CO2培養箱培養2h后，1000r/min離心5min，如此DMEM/F12清洗細胞2次，棄病毒殘液，補充完全細胞培養液（DMEM/F12加2%B27，20ng/ml的EGF、bFGF）5ml，37℃，5%CO2培養箱培養，常規換液、傳代。在倒置熒光顯微鏡下觀察、記錄rAAV-2/EGFP轉染NSCs后EGFP的表達情況。

1.5rAAV-2/EGFP體外轉染對神經干細胞存活、增殖、分化的影響rAAV-2/EGFP轉染NSCs后，各組分別在7、14、21天細胞傳代時臺盼蘭拒染法檢測細胞活力、細胞計數計算增殖倍數。0.2%臺盼蘭溶液與細胞懸液混勻，死細胞著色，而活細胞不著色，計數活細胞數及死細胞數。細胞活力為活細胞數/（活細胞數＋死細胞數）。EGFP表達穩定時，10％胎牛血清誘導各組NSCs克隆球分化，觀察分化情況。

1.6流式細胞儀檢測基因轉染率和表達效率［7］rAAV-2/EGFP轉染NSCs后，各組在各相應的時間點細胞機械反復輕柔吹打分散、200目不銹鋼篩網過濾制成單細胞懸液，上流式細胞儀（BD），以未轉染組為對照，激發光為488nm、吸收光為530nm，進行數據獲取與分析；分析結果用轉染率和熒光指數（fluorescentindex，FI）表示。轉染率即EGFP陽性細胞的陽性率，熒光指數主要反映了目的基因的表達效率。

每一樣品收集1×104個細胞，根據細胞大小設定一個單細胞區域，該區域的細胞用于熒光分析。以未轉染組的細胞作為陰性對照，設定GFP陽性細胞區（M1區）使陰性對照M1區細胞數不超過0.1%，流式細胞儀分析結果用轉染率和熒光指數FI表示。轉染率即為GFP陽性細胞陽性率，FI主要反映了目的基因的表達效率，分別用下列公式計算：轉染率=樣品M1區細胞百分率－陰性對照M1區細胞百分率；FI=樣品M1區細胞百分率樣品×M1區平均熒光強度－陰性對照M1區細胞百分率×陰性對照M1區平均熒光強度。在上述兩個公式中，減數很小，一般情況下可忽略不計。

1.7統計學處理各組數據均用x±s表示，組間比較用單因素方差分析，實驗數據用統計軟件SPSS11.0進行統計學處理。

2結果

2.1rAAV-2介導的EGFP基因在NSCs中的表達rAAV-2/EGFP轉染NSCs，10天后EGFP開始表達，倒置熒光顯微鏡下可見各轉染組神經球受藍色光激發產生的呈團塊狀的綠色熒光，但較弱且強度不一，總體上感染復數越大熒光越強；隨后表達顯著增加，21天時達高峰，這時熒光較強（見圖2），表明細胞球中多數細胞被轉染并成功表達EGFP，細胞繼續傳代培養，仍可見大量熒光。

2．2rAAV-2對神經干細胞活力、增殖、分化的影響不同MOI的rAAV-2轉染組和未轉染對照組的NSCs在倒置顯微鏡下觀察，均生長良好，細胞透光性好，形態完整，細胞碎片少，NSCs形成克隆球速度相當，細胞穩定性好，可連續傳代，各組細胞在7、14、21天臺盼蘭拒染法檢測細胞活力差異均無顯著性（P＞0.05）（見表1）。同時各組細胞在7，14，21天細胞計數從而計算增殖倍數，轉染組與未轉染對照組在相應時間點差異亦無顯著性（P＞0.05），并在培養過程中呈指數生長趨勢（見表2）。表1rAAV-2轉染對NSCs活力的影響注：均為同一時間點轉染組和未轉染組對照比較，組間比較P＞0.05，差異無顯著性表2rAAV-2轉染對NSCs增殖倍數的影響注:均為同一時間點轉染組和未轉染對照組比較，組間比較P＞0.05，差異無顯著性。

EGFP表達穩定時，10％胎牛血清誘導各組分化后，各組均可見神經干細胞克隆球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中6h左右細胞克隆球貼壁，12h后即發現有突起從團塊邊緣長出，24h后見有少數細胞從克隆球的邊緣向外遷移，分化為有突起的細胞，有的細胞遷移速度較快，以后分化的細胞逐漸增多，從克隆球周圍遷移出，呈放射狀排列，隨著時間的推移，突起不斷增粗與延長并互相連接成網狀，1周以后，各組NSCs克隆球幾乎完全分化，形成大量胞體呈圓形或橢圓形、具有1～2細長突起的神經元樣細胞和胞體較大、形態不規則、具有多個粗突起的星形膠質樣細胞。MAP-2、GFAP免疫熒光分別鑒定分化細胞，熒光顯微鏡下各組均可見MAP-2陽性的神經元和GFAP陽性的神經膠質細胞。rAAV-2轉染的神經干細胞不僅可以分化為神經元和膠質細胞，細胞形態保持正常，且轉染不影響神經元和膠質細胞的分化比例。各組MAP-2、GFAP陽性細胞比例見表3，差異均無顯著性（P值均＞0.05）。表3不同MOI轉染組和未轉染對照組MAP-2、GFAP陽性細胞的比較注：組間比較P>0.05，差異無顯著性

2.3rAAV-2對神經干細胞的轉染效率EGFPEGFP開始表達后，于14、21、28天流式細胞儀檢測各MOI的rAAV-2/EGFP轉染NSCs的效率（見表4）：可見21天為其表達高峰，此時MOI為1×104、1×105、1×106時轉染率分別為25.68%、50.60%、54.72%（見圖3），熒光指數（FI）分別為4.08、12.72、14.06。表4不同MOI的rAAV-2/EGFP轉染NSCs的效率

3討論

近年來，神經干細胞的研究發展迅速，但仍存在許多問題，如細胞移植時常常不能區別供體細胞與宿主細胞，不能較精確地觀察植入細胞的存活及生長分化情況，也就難以對腦內移植的功效作出一個客觀評價。隨著基因工程技術的發展，人們可根據不同的科研及治療目的，對神經干細胞進行不同的遺傳學修飾，以期制成基因工程細胞，這些細胞極具科研和應用價值，受到廣泛關注。病毒載體和非病毒載體是目前基因修飾中常用的兩大類載體。非病毒載體有脂質體、質粒、分子偶聯載體等，基因轉移效率低。病毒載體應用最廣泛，約占85%，其中腺相關病毒、逆（反）轉錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒是基因治療中最常用的4種病毒載體，病毒載體安全性問題至關重要［8］。各種病毒載體都有自己的優點和不足，但是逆（反）轉錄病毒是隨機整合入宿主DNA、可能會引起“插入誘變”、也有可能產生具有復制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色體DNA上，表達時間短暫，所以不能持續表達所需產物，且可能刺激免疫反應［10］；單純皰疹病毒對人類具有明顯的致病性，能夠從潛伏狀態激活［11］。而AAV-2是一種單鏈的微小DNA病毒，需要輔助病毒才能有效地復制，具有與人類疾病無相關、宿主范圍廣，并能整合入宿主細胞DNA，去除其復制蛋白Rep和包裝蛋白Cap基因,僅具有感染宿主的功能,安全性較高,成為較理想的基因修飾載體,倍受矚目。其具有下列優點:目前尚未發現該病毒在人體中致病,所以比較安全；感染宿主細胞廣泛,包括非分裂細胞和分裂細胞,特別是神經元和神經膠質感染性較強；能特異整合于人的第19號染色體長臂末端，減小了插入突變激活原癌基因的可能性，rAAV雖然失去了整合特異性，但反向末端重復序列中沒有轉錄調控組件，因而減少了插入突變的可能性；外源基因表達穩定，可長達2年［2，12］。NSCs具有自我復制、增殖分化的能力，是基因修飾、基因治療的靶細胞。

AAV-2能否有效地轉染神經干細胞，且轉染rAAV-2對神經干細胞存活、增殖、分化能力等有無影響，值得探討。因為如果轉染rAAV-2對神經干細胞存活、增殖、分化能力等天然性能產生影響，都會對細胞、機體造成嚴重后果，那么將會極大地限制其在基因修飾、基因治療方面的應用。許多學者采用AAV轉染神經干細胞，得到的結果各不相同。Hughes等［13］研究認為rAAV-2對神經干細胞球略有效率低下的轉染能力，其僅觀察5天轉入基因的表達情況，而腺相關病毒轉染細胞后基因表達的高峰期為1個月左右，轉入基因5天時可能沒有表達或者表達量很少。本實驗分離培養了大鼠胚胎源性神經干細胞，用rAAV-2/EGFP轉染NSCs，對其進行基因修飾，我們的結果提示：轉染rAAV-2對神經干細胞存活、增殖、分化能力等未產生影響，rAAV-2對神經干細胞沒有毒性作用，不影響神經干細胞的生物學特性，是神經干細胞間接體外法基因治療的理想載體；MOI=1×104、1×105、1×106轉染10天后，EGFP開始表達，熒光顯微鏡下可見彌漫于整個NSCs克隆球中的綠色熒光，起始表達強度不一，隨MOI值的增大而增強，而且EGFP的表達強度隨著時間的延長而逐漸增強，至轉染后第21天達到高峰并維持,此后熒光指數不再增大；此時行流式細胞儀檢測：MOI為1×104、1×105、1×106時轉染率分別為25.68%、50.60%、54.72%,熒光指數（FI）分別為4.08、12.72、14.06。僅以轉染率不能夠全面衡量一個基因載體的轉移效率，無法反映多拷貝基因轉移，也不能反映目的基因的表達效率。熒光指數能更為全面地反映基因轉移和表達效率；以GFP基因為報告基因，用流式細胞儀分析基因轉移效率（轉染率和熒光指數）優于傳統人工計數法，并且還可用流式細胞儀進一步篩選表達EGFP陽性的細胞。AAV是通過靶細胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surfaceheparinproteinofglycans,SHPG）為受體介導轉染的［14］，而受體的數目和功能是有限的，當AAV與受體結合達平衡時，發揮最大生物效應，再增大MOI也不會提高轉染效率。因此我們可以解釋rAAV-2/EGFP轉染NSCs的效率隨MOI值的增大而增強，但MOI為1×105、1×106轉染效率相差不大，可能是AAV與受體結合達到了平衡，轉染達到了穩定，結合實驗經濟因素，因而MOI=1×105為最佳MOI。另外，還有可能是由于神經干細胞AAV受體表達強弱、培養方法、轉染時間、檢測方法的不同等因素，引起不同學者實驗研究結果上的差異。

GFP相對分子質量小，這也是它作為報告基因的一大優點；GFP與目的基因融合后對目的基因的結構功能沒有影響，大量表達對細胞也無毒性作用。在我們的研究基礎上，將rAAV-2/EGFP與一些促進NSCs存活和定向分化的營養因子，如GDNF、VEGF等目的基因構建成融合基因，以GFP基因為報告基因，rAAV-2為載體，一起轉染移植的NSCs，不需用其他檢測方法，只需熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，便可針對另一基因作相關研究，將對中樞系統的研究手段有更好的應用價值。

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