農作物種子檢測分析

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摘要：種子質量是農業生產的重要因素，質量檢測是其中的關鍵環節，隨著種子檢測技術的發展，電泳方法越來越多地應用到種子質量檢測中。目前在農作物種子質量檢測中常用的電泳方法有4種，不同電泳方法的要求和適合的檢測項目不同，針對各種電泳方法的優缺點，討論其適用范圍，從而為農作物種子質量檢測技術平臺提供參考。

關鍵詞：農作物種子檢測；電泳方法；比較分析

種子是農業生產的基本資料，種子質量的優劣關系到國計民生，種子質量檢測是把好種子質量關的重要手段。隨著檢測技術的不斷發展，電泳技術在種子質量檢測中發揮著越來越大的作用。電泳是指在電場作用下，帶電顆粒向與其電性相反電極移動的現象。電泳技術是利用帶電顆粒在電場作用下移動速度不同而實現分離的技術。在農作物種子質量檢測中常會用到4種不同的電泳方法：瓊脂糖凝膠電泳、小板聚丙烯酰胺凝膠電泳、大板聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳。不同的電泳方法適合不同的檢測項目，各方法對實驗儀器、檢測技術水平、實驗室條件和操作人員的要求也不同。

1四種不同的電泳方法

1.1瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳是分子檢測中常用的檢測方法，不同濃度的瓊脂糖凝膠（0.3%~1.5%）可以將200bp~50kb的DN段分離。當用溴化乙啶（EB，熒光嵌入染料）染色，通過凝膠成像系統，能觀察到發出熒光的DNA條帶，確定DN段在凝膠中的位置及質量，或與參照DNA比較，判定被檢基因的有無。瓊脂糖凝膠電泳可以檢出1~10ng的DNA的存在[1]。通常實驗室多用電泳儀和水平槽裝置進行瓊脂糖凝膠電泳。1.2小板聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的一種電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）聚合成三維網狀結構的凝膠。由于電荷效應和分子篩效應，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將分子大小相同而帶不同數量電荷或者帶相同數量電荷而分子大小不同的蛋白質、酶或者DN段分離開[2]。小板聚丙烯酰胺凝膠通常用電泳儀和小板電泳槽進行電泳。1.3大板聚丙烯酰胺凝膠電泳。大板聚丙烯酰胺凝膠電泳原理同小板聚丙烯酰胺凝膠電泳，只是單體和交聯劑的比例不同，形成大小不同的立體網狀結構，膠更薄、移動距離長，能將小片段DNA（5~500bp）分離開，甚至相差2~5bp的DN段也能區分開。根據Marker或者參照樣品DNA譜帶的位置，可以估測出被檢樣品DN段的大小。大板聚丙烯酰胺凝膠電泳需要高壓電泳儀和大板垂直電泳槽進行電泳。1.4毛細管熒光電泳。毛細管熒光電泳是將膠灌在一種空芯的微細毛細管中，利用電泳和電滲流的電動力學原理，把PCR產物高效分離，利用熒光檢測到產物信號，通過軟件分析系統轉化成峰值圖導出結果的電泳技術。毛細管電泳檢測方法可以將相差1bp的DN段分離開，通過不同的峰值圖展示出來，經過參照樣品和基準物質的矯正，獲得相對精確的數據。在引物上標記不同的熒光信號，可以將若干組不同的PCR產物放在同一個反應孔中電泳，根據熒光信號顏色的不同和PCR產物大小的不同，分析出一個樣品在不同位點的特性值[3]。毛細管熒光電泳通常在基因分析儀上進行。

2不同電泳方法適合不同的檢測項目

瓊脂糖凝膠電泳在農作物種子質量檢測中多用于轉基因檢測和DNA質量檢測。在轉基因檢測中通過分析樣品中目標DN段的有無與陽性對照基因比較，確定檢測樣品是陽性還是陰性；在分子檢測中用于檢測DNA的質量，觀察DNA譜帶的位置、整齊度和亮度來判斷DNA質量的好壞。圖1是一個棉花種子樣品CaMV35S啟動子基因的檢測結果圖。棉花種子樣品1、2、3檢測出CaMV35S基因，與陽性參照結果相同，其余樣品均未檢出該基因，試驗中陽性參照樣品和Marker條帶清晰，陰性參照和空白對照樣品均無條帶，試驗結果可靠。小板聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于種子樣品的純度檢測。在電泳圖譜中觀察分析各個泳道電泳譜帶的差異，判定樣品的純度，或根據參照樣品的信息估測DN段的大小。圖2是一個玉米種子樣品鹽溶蛋白電泳的結果圖，該圖顯示，此樣品種子一致性較好，無異品種。大板聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于種子樣品SSR分子標記真實性檢測和一致性檢測。根據不同品種在各個位點的典型特異譜帶，進行樣品之間比較或者與DNA指紋數據庫比對，判斷分析種子樣品的一致性和真實性。圖3是一個玉米種子樣品SSR分子標記方法檢測引物bnlg2291k4大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果圖，該圖顯示，這個位點出現4種不同的特異型譜帶，將20個不同的玉米雜交種分成4種不同的類型。毛細管電泳熒光檢測方法主要用于農作物種子的真實性檢測和一致性檢測。分析軟件導出的峰值圖，進行合并與整理，比對指紋數據庫的指紋，判定被檢種子樣品的身份信息。圖4是20份玉米種子樣品SSR分子標記引物bnlg1671y17毛細管電泳熒光檢測結果圖，在這個位點出現5種不同大小的特異峰，把20個不同的玉米品種分成5種不同的類型。

3不同電泳方法的優缺點比較

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分離的DN段范圍較廣，且能較好地分離長度相差較大的DN段，操作簡單，對實驗室條件和操作技術人員的要求低；但是該方法需要用到EB，即一種高致癌性的強誘變劑，對操作人員和環境的污染較嚴重，雖然可以用EB替代物（GoldView、GelRed和GelGreen、SYBRGreenⅠ），但易受到替代物的染色效果和穩定性的影響；另外這種方法的精確度較低，要區分大小相近的DN段比較困難。小板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作過程中灌膠、點樣、電泳、染色等程序操作相對簡單，對實驗室條件、儀器設備和技術人員要求不高，但是該方法的檢測分辨率較低，不能清晰地區分大小相近的DN段。大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測精確度比小板聚丙烯酰胺凝膠電泳高，成本相對較低，但凝膠制備與電泳、染色等操作程序比較費時費力，對操作人員技術要求較高，仍無法讀出譜帶的精確數據，只能與參照樣品比較，估測它的大小，實驗室間結果的比對誤差較大。毛細管電泳熒光檢測方法結果精確度高，操作簡單，通量高，省時省力，但是儀器購置、維護、熒光引物、耗材等試驗成本較高；并要求儀器處于適合的溫度條件下，供給穩定的電源，實驗室有一定的潔凈度以及有經驗的技術人員，以保證儀器的正常運行，確保檢測數據的結果準確。

4小結

在種子質量檢測中，不同的檢測項目選擇不同的電泳方法。瓊脂糖凝膠電泳是一種理想的檢測被檢基因有無和檢測DNA質量的方法；小板聚丙烯酰胺凝膠電泳能區分親緣關系較遠的品種，但由于近年來品種間親緣關系越來越近，該方法的應用率也在逐年降低；大板聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前種子樣品純度檢測和真實性檢測中較常用的檢測方法，成本相對較低；毛細管電泳熒光檢測是種子檢測中精確度較高的一種技術，但檢測成本較高，推薦有一定經濟實力的實驗室使用。隨著檢測技術的發展，試驗成本的降低，毛細管電泳熒光檢測方法是一種自動化程度較高、試驗結果準確可靠、人們較信賴的檢測方法。

參考文獻

[1]葉正祥，瓊脂糖凝膠電泳技術．遺傳工程，1984（3）：95-105

[2]夏春蘭，衛澤，張雪鈺，文香丹，王沛政．改良測序聚丙烯酰胺凝膠和普通聚丙烯酰胺凝膠技術在玉米分子標記中的應用研究．海南熱帶海洋學院學報，2014，21（5）：64-68

[3]易紅梅，王鳳格，趙久然，王璐，郭景倫，原亞萍．玉米品種SSR標記毛細管電泳熒光檢測法與變性PAGE銀染檢測法的比較研究．華北農學報，2006，21（5）：64-67

作者:鄭戈文 單位:山西省農業種子總站