胃幽門螺桿菌染色質量控制研究

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經大量臨床病例證實，消化系統的胃黏膜病變、潰瘍、胃淋巴增生性病變、慢性胃炎甚至胃癌均與幽門螺桿菌(HP)感染有一定的關系。我國目前處于HP感染高發區，通常HP感染缺乏典型的臨床特征，故早期的臨床診斷及治療顯得尤為重要。病理診斷HP感染是臨床診斷的重要依據，但在常規病理HE切片中不易觀察到HP，難以明確病理診斷，因此只能用特殊染色法才能使HP更清晰的顯示出來。目前檢測HP的方法有10余種，哪些方法最好、如何進行HP染色的質量控制、使染色結果穩定可靠且準確是目前工作中的關鍵。本文就這些染色法中的關鍵問題、注意事項以及HP實驗操作問題、染色液配制及染色結果觀察判斷等問題進行探討。

1材料與方法

1.1材料。選取本院2018-05—08間臨床診斷的活動性胃炎胃黏膜活檢標本65例。1.2方法。將65例石蠟標本連續切片，制成4μm厚的切片，每例取3張，分別進行硼酸亞甲藍染色、改良Giemsa染色和硝酸銀染色。1.2.1試劑配制①硼酸亞甲藍染液配制:把1g亞甲藍和1g硼酸加入100ml蒸餾水中充分混合溶解。②改良Giemsa染液配制:Giemsa染液:Giemsa染液0.75g加甲醇50ml于50度水浴箱中使其充分溶解，其間不斷攪拌，冷卻后加入50ml甘油;石炭酸復紅液:堿性品紅50mg溶于95%乙醇100ml，再加入4%苯酚250ml及蒸餾水650m，充分混合即可。③硝酸銀液配制:醋酸貯備液:雙蒸餾水加1%檸檬酸液，調節PH值為3.6～4.0之間;5%明膠液:明膠5g加醋酸貯備液100ml溶解;③顯影液:3%對苯二酚1ml與5%明膠15ml充分混合，顯影前5min加入2%硝酸銀3ml混合。1.2.2染色步驟①硼酸亞甲藍染色:切片脫蠟至水，硼酸亞甲藍染液染色5min，水洗，烘干切片，中性樹膠封固。②改良Giemsa染色:組織切片脫臘至水，改良Giemsa染液染色20min后水洗，石炭酸復紅液染1min，不洗直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。③硝酸銀染色:切片脫蠟至水，醋酸貯備液洗切片，把切片置入1%硝酸銀于56℃水浴箱45min，切片取出不經水洗，滴入顯影液56℃水浴反應2min，切片立即取出，自來水稍洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。1.3結果判定。切片高倍鏡下，陽性的幽門螺桿菌形態彎曲，短桿狀，分布在胃黏膜凹陷內。硼酸亞甲藍染色法幽螺桿菌呈藍色;改良Giemsa染色法幽門螺桿菌呈紅色;硝酸銀染色法幽門螺桿菌呈棕黑色。

2結果

65例胃黏膜標本中，經硼酸亞甲藍檢出55例HP陽性，陽性率85%(圖1);經Giemsa染色49例陽性，陽性率75%(圖2);經硝酸銀染色檢出52例陽性，陽性率80%(圖3)。三項染色陽性的數據比較差別顯著(P＜0.05)。

3討論

本實驗顯示，3種染色方法胃幽門螺桿菌均有較高的陽性檢出率，三者陽性率相差不明顯。胃幽門螺桿菌中含有蛋白和多糖物質，在一定溫度的硝酸銀溶液作用下能夠吸附銀離子，再經過還原的顯色劑使幽門螺桿菌顯示金屬銀，銀顆粒沉淀于細菌上，結果顯示幽門螺桿菌著棕黑色，胞質與黏液著淺黃色，此法著色細菌與組織對比明顯，易鏡下觀察，但染色時間長、試劑價格昂貴、配制復雜、操作繁瑣。改良Giemsa染色法胃黏膜細胞核呈藍紫色，胞質和黏液呈紅色，幽門螺桿菌呈紅色，此法操作簡單、價格低、耗時短，但組織易被染成紅色，較難區分組織內的幽門螺桿菌。硼酸亞甲藍染色胃黏膜細胞核呈藍紫色，形態結構清晰，亞甲藍為堿性染料，溶于水中電離成有色的陽離子，與帶陰離子的幽門螺桿菌相結合而著藍色，此液耗時短、操作簡單、價格低廉、試劑來源方便、染液使用壽命長，可常溫保存2～3年。染色的操作質量是保障切片染色對比清晰的關鍵，如何提高胃幽門螺桿菌染色的質量，筆者在日常工作中總結出以下幾個要點:①硝酸銀染色:A．醋酸儲備液的配制最為關鍵，必須采用雙蒸餾水，因為自來水中含氯離子，氯離子與硝酸銀起反應產生白色的沉淀;B．酸化水的PH值調整到3.6～4.0之間，高于或低于3.6～4.0時配制出的染液無法使幽門螺桿菌著色;C．除了醋酸儲備液及5%明膠可保存較長時間，顯影液必須現配現用，5%明膠可4℃保存于冰箱，臨用前取出水浴融化即可;D．染色過程中的顯影液應嚴格把握水浴溫度，最好控制在56℃～58℃之間。顯影2min立即取出切片鏡下觀察，如顯影不足，幽門螺桿菌淺淡;顯影過度，切片背景深黑，且易出現銀粒沉淀污染切片，不利于鏡下觀察;E．顯影液必須染片前5min配制好再放入水浴，顯影液一旦配制好就會產生反應，根據筆者經驗，即使采用立式染色缸顯影1次后就應該廢棄，如果繼續染片，切片背景不清晰、銀顆粒沉淀后污染嚴重，螺桿菌與污染的切片難以分辨;F．終止顯色時最好用55℃左右的熱水將顯影液沖洗干凈，因為顯影液中含的明膠遇冷水后迅速凝結，導致未結合的顯色劑殘留在切片;G．因日光會破壞分解硝酸銀液，因此配好的染液用棕色玻璃瓶保存，染液可保存半年;H．染片可長期保存不易褪色。②Giemsa染色:Giemsa在常溫下難于溶解，因此在55℃左右與甲醇液能達到完全溶解。改良后Giemsa省去很多復雜步驟，改良添加了堿性品紅，因Giemsa染液可使細菌初染呈紫色，堿性品紅不僅作為復染的襯托，且不易被乙醇脫色，使切片對比清晰。堿性品紅對革蘭陰性菌的菌壁有親和力，加強幽門螺桿菌著染，此類染色切片長期保存不易，易褪色。③硼酸亞甲藍染色:硼酸亞甲藍染后不經乙醇脫水，而直接烤干封固，是因為乙醇會褪去亞甲藍的染色，造成切片顏色不清晰。硼酸亞甲藍染液應密閉、室溫、暗處保存，防止霉菌污染，定期過濾。染液能保存2～3年。此染色隨保存時間延長，切片易逐漸褪色。綜上所述，只要在以上操作流程中嚴格掌握和控制染色過程中的染色溫度、染色時間、PH值、試劑配制及保存等有關細節，就能保證幽門螺桿菌的染片質量，保持染色的穩定性和可靠性，從而更好地服務于臨床診斷及后續治療。

作者:黃希帆 董愉