巨噬細胞范文
時間：2023-03-14 21:46:06
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篇1
【關鍵詞】 巨噬細胞；視神經再生；視網膜小膠質細胞
［Abstract］ The meaning of optic nerve regeneration is the regrowth reaction after optic nerve amputation.People has attached importance to the effect of macrophages in optic nerve regeneration.Retinal neural microglia/macrophages have multiple functions of phagocytosis and destruction，synthesis and secretion of a variety of factors which are closely related to the optic nerve regeneration environment.Injection of macrophages and macrophage conditional medium can promote the optic nerve regeneration.
［Key words］ macrophage;optic nerve regeneration;retinal neural microglia
視神經再生是指存活的視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC）生長出新的軸突到中樞神經系統的特定靶位置并恢復正常功能，它包含四層含義：神經保護、軸突延長、與靶組織再聯系、功能恢復。視神經切斷以后的再生反應表現為“芽生”通過損傷的部位到達遠端的靶區。功能再生是指再生的纖維進入原來的或新的靶組織，重新建立突觸聯系，恢復失去的功能。20世紀80年代以前，人們普遍認為哺乳動物成熟的中樞神經細胞和周圍神經不同，損傷后無法再生，作為中樞神經系統一部分的視神經也不例外。直到1980年Richardson等［1］研究發現絕大多數哺乳動物的中樞神經細胞能夠再生長入被埋植于大腦，脊髓或視神經內的周圍神經移植物中，并經過移植物到達靶區。這一發現推翻了以往的觀點，顯示了中樞神經系統的神經細胞能夠再生，成為中樞神經再生研究歷史上的里程碑。從此，人們對視神經再生的可能性和條件性進行了廣泛而深入的研究。
普遍認同的觀點是，中樞神經系統受損后內環境的改變阻止了神經細胞的再生。據推測［2~4］，這可能與神經細胞如星形膠質細胞和少突細胞等受損后所引起的不適當反應有關，而此不當反應被認為與巨噬細胞募集和增殖活化的延遲及受限所致。周圍神經受損后往往能引發有效的巨噬細胞激活與募集，從而自發地再生。Schwartz等［5］指出其他組織恢復的原則同樣適用于CNS包括視神經，他認為，巨噬細胞在任何受損組織中都能發揮維持、恢復和防御的基礎作用，而巨噬細胞的募集（可能也包括激活）在導致再生的一系列事件中居于最上游的位置。在損傷的周圍神經系統，再生可自然發生。其變性和再生似乎是由巨噬細胞介導和控制的。實驗［6，7］發現大鼠晶狀體受損后能使視網膜神經節細胞（RGC）的存活數量增加8倍，視神經新生軸突數增加100倍，并使得軸突生長入通常被抑制禁止的區域，其機制與神經營養因子（neurotrophic factors，NTFs）無關，而與激活的巨噬細胞有關。晶狀體受損能刺激巨噬細胞激活和聚集，且在晶狀體未受損時注射能激活巨噬細胞酵母聚糖A（Zymosan A）也促進了RGC軸突再生并長入遠處視神經斷端。因此，巨噬細胞在視神經再生中的作用開始受到人們的重視，巨噬細胞激活與聚集很可能是神經再生的關鍵步驟之一，對再生和成長支持的許多繼發步驟有重大的作用。
1 巨噬細胞的起源和視網膜中的分布
1.1 起源 早在19世紀末俄國人Metchnikoff就觀察到從海星幼體中胚層分離的一種具有阿米巴變形運動特點的細胞能夠將顆粒性異物吞入細胞內，因此提出了吞噬（phagocytosis）這個概念，至20世紀70年代Van Furth以單核吞噬細胞系統（mononuclear phagocytic systen，MPS）這一概念取代了網狀內皮系統，而單核/巨噬細胞則是MPS的基本組成部分。單核/巨噬細胞是骨髓造血干細胞發育分化而來，在骨髓中經歷多能干細胞-定向干細胞（髓樣干細胞）-單核母細胞（monoblast）-前單核細胞（promonocyte）-單核細胞的發育過程。骨髓中的單核細胞成熟后進入外周血，血腫的單核細胞穿過學館內皮細胞間隙進入組織則進一步發育分化為巨噬細胞，廣泛分布于全身所有表皮和黏膜下組織，在防御感染，自身穩定和免疫監視中都起著重要作用，可抵抗細菌、真菌和病毒等病原體的感染以及清除凋亡細胞和突變細胞。
1.2 分布 巨噬細胞廣泛分布于機體內，包括干的Kupffer細胞、結締組織的巨噬細胞、肺的塵細胞、骨組織的破骨細胞及表皮的Langerhans細胞等。目前許多證據［8］表明小膠質細胞可能是從血液中單核細胞或多能單核前體細胞演變而來，是分布于神經組織包括視神經內的屬于神經系統游走巨噬細胞中的一群。
視網膜小膠質細胞有兩種類型：基質小膠質細胞和血管周圍小膠質細胞。前者是在哺乳動物胚胎約第10周由血液單核細胞或其前體經睫狀體扁平部進入視網膜轉變而成，表面標志為CD45，MHCⅠ，MHCⅡ；后者是小膠質細胞在胚胎第14周從視神經進駐視網膜后在血管周圍形成，具有巨噬細胞表面抗原S22，CD68［9］。
2 巨噬細胞在視神經再生中的功能和作用
視神經再生的困難很多，主要有三個:（1）視神經橫斷傷后RGC會死亡。將成年大鼠的視神經在近眼球處橫斷，1周后RGC死亡50%，在1個月末時則達90%。（2）大部分成熟的橫斷后的RGC不會程序性地再開始軸突延長。（3）視神經內環境中的很多因子在橫斷傷后表達增加，對軸突生長起抑制作用;而且，許多營養因子缺乏也使軸突難以生長。因此，在神經保護使RGC存活的前提下，視神經再生的研究集中于制造一個適合的環境，主要有三方面［10］:（1）移除髓鞘及其產物如髓鞘相關糖蛋白等對軸突再生的抑制作用。（2）提供額外的神經營養因子，如:腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophin factor，BDNF），神經營養因子4/5（neurotrophin-4/5，NT-4/5），睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF），酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）等。（3）促進軸突內在的生長潛能。
像所有吞噬細胞一樣，視神經小膠質細胞具有吞噬和殺傷，合成和分泌多種活性因子等主要功能。而這些功能無一不與營造上述適合視神經再生的內環境有密切關系。
2.1 巨噬細胞的主要功能
2.1.1 吞噬功能 小膠質細胞在正常視網膜內一般處于靜止狀態，此時其氧耗量比較低，表面MHC-Ⅱ類分子水平較低，很少甚至不分泌細胞因子。在損傷早期小膠質細胞即被微小的病理變化所激活后，如中樞神經系統炎癥時小膠質細胞接受損傷信號刺激后立即以較快的速度向損傷部位遷移，并附著于受損神經元表面。若損傷輕微易修復則小膠質細胞不轉變為吞噬型；若損傷嚴重則小膠質細胞將轉變為吞噬細胞行使吞噬功能［11］。部分小膠質細胞在貼近受損神經細胞后會處于一種介于靜止和激活之間的中間狀態，它們會很快增殖，消化和降解微小生物，死亡的細胞及其他組織碎片，促進組織修復［12］。
視網膜小膠質細胞轉變為吞噬型后能吞噬鞘磷脂［13］包括MAG，并將其分解后進入脂質降解產物的循環［14］。CNS髓磷脂是髓鞘的化學成分，是由成熟少突膠質細胞的質膜生長形成的，未成熟的少突膠質細胞無形成髓鞘的能力，發育過程中其在阻止神經發芽及穩定視通路的神經纖維軸突數中起了一定作用。用X線照射或用有絲分裂抑制劑有效抑制新生大鼠脊髓內少突膠質細胞的發生和形成髓鞘，則大鼠損傷后視神經可獲成功再生［15］。體外實驗證實髓磷脂連接蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）也具抑制神經細胞軸突生長的作用。MAG是含量很高的一種髓磷脂蛋白。1994年，Mclerracher等指出在試管內MAG能抑制神經突生長。Eric等［16］用擠壓后的15d雞胚的視網膜-視神經移植物做實驗。采用CALI法消除MAG的作用，使視網膜軸突明顯再生越過了包含CNS髓磷脂的損傷區。電子顯微鏡觀察到神經橫斷處有大量再生軸突越過斷端裂口。在神經殘端用衰退性標記橫斷的視神經，未發現有被標記的視網膜神經元，與未被切斷的神經幾乎毫無區別。這些結果表明CNM是一種重要的髓磷脂源性神經再生抑制成分。除去MAG作用可顯著促軸突生長越過CNS損傷區。視網膜小膠質細胞可能是通過吞噬鞘磷脂包括MAG來促進軸突生長。
2.1.2 分泌神經營養因子 大量研究證實補充神經營養因子能改善神經再生的微環境，使視網膜神經元細胞避免損傷或死亡，促進神經再生及功能恢復。體外研究揭示，小膠質細胞/巨噬細胞可分泌生長因子如堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF），神經營養因子-3（neurotropM 3，NT-3）、轉移生長因子（transfroming growth factor，TGF）等。Batchelor等［17］在體內實驗中發現，激活的小膠質細胞能表達BDNF和膠質細胞源性神經營養因子。體外研究［18］表明，巨噬細胞分泌的物質有促進纖維增生和血管再生功能，然而未激活的巨噬細胞上清液并沒有這種功能。激活的巨噬細胞可分泌100多種蛋白質分子，其生物活性影響到細胞生長與死亡以及免疫炎癥反應的每一個方面。其分泌血小板衍生生長因子（PDGF），表皮生長因子（EGF），和胰島素樣生長因子（IGF-I）等能促進視網膜色素上皮細胞（RPE）增生［20］。Chamak等［21］發現鼠腦損傷早期會出現凝血酶致敏蛋白（一種細胞外基質蛋白）的積聚。它是由腦巨噬細胞合成和分泌的。從胚胎鼠腦分離的巨噬細胞可促進培養的CNS神經元的神經軸突生長和再生，這種作用可被凝血酶致敏蛋白抗體所抑制。他們認為，在發育或在病理情況下，巨噬細胞有助于軸突的生長或再生。Lotan等［22］發現視神經損傷后TNF和集落刺激因子1能明顯增加侵入視神經的巨噬細胞的數量，而且TNF-α可改變視神經黏附神經元的性質，增強培養的PCJ 2細胞在其上的黏附。而這種神經元的黏附與軸突的再生能力相關。這些結果提示。在CNS損傷部位增加激活的巨噬細胞小膠質細胞的數量可能有助于增強一些有利于生長的神經營養因子、細胞因子和細胞外基質（如層粘連蛋白、凝血酶致敏蛋白）的分泌，提供一個有益于促進軸突再生的環境。Lin等［23］通過體內體外實驗均發現在大鼠視神經損傷處聚集的巨噬細胞能分泌編碼EphB3的mRNA并表達可組成EphB的蛋白分子，而EphB分子能提高大鼠視神經的再生功能。
2.2 巨噬細胞抑制因子 一些研究已指出與身體內的其他組織相比（包括周圍神經），中樞神經受損后，巨噬細胞的募集功能受限，表現為巨噬細胞的缺乏和活性的抑制。事實上，在中樞神經系統內存在一個抑制巨噬細胞募集和激活的因子，而這可能是中樞神經不能再生的一個因素［24~27］，我們稱之為內在的巨噬細胞抑制因子［28］。在正常視神經，星形膠質細胞和少突膠質細胞均表達阿樸脂蛋白E，在視神經橫斷后1周星形膠質細胞的阿樸脂蛋白E表達減少，而且侵入的巨噬細胞很少，可能的原因就是因為存在這種可溶性巨噬細胞抑制因子［29］。
2.3 與雪旺細胞的相互作用 神經生長因子（NGF）是神經系統最重要的生物活性分子之一，是參與損傷神經再生和功能恢復的重要因素。如果能提高神經損傷后局部合成、分泌NGF的水平，必將有利于神經再生。神經損傷后局部趨化的巨噬細胞能促進雪旺細胞分泌NGF，Heumann等［30］發現神經損傷后在體內試驗中出現了NGF及NGFR-mRNA水平不同程度的增加，但在培養坐骨神經段則僅出現了NGFR-mRNA水平的增加，未出現NGF mttNA增加，但當在培養基中加入激活的巨噬細胞或應用巨噬細胞調理液進行培養時，NGFmRNA出現了類似于體內的增加合成，這提示NGF-mRNA在雪旺細胞內的表達增加是由巨噬細胞分泌的某種因子來進行調節的。Lindlaolm等［31］在培養基中加入白細胞介素-1（Interleukin-1，IL-1），得到了與加入激活巨噬細胞相同的結果，而巨噬細胞可以分泌IL-1，所以神經損傷后局部NGF的合成增加是由巨噬細胞分泌IL-1作用于雪旺細胞，從而引起NGF-mRNA增加合成并進行翻譯而完成的。近年來研究發現，向培養雪旺細胞中加入轉移生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF- β1），結果NGF和NGFR-mRNA的水平均明顯下降，并能激發雪旺細胞增生。巨噬細胞能合成和分泌TGF-β1，說明巨噬細胞除可對NGR-mRNA進行上調外，還可通過分泌TGF-β1對NcFmRNA進行下調，這進一步說明巨噬細胞對神經再生具有重要影響。
3 注射巨噬細胞以及巨噬細胞調理液
3.1 注射巨噬細胞 Schwartz［32~33］研究小組的一系列研究提示移植激活的自體巨噬細胞可有助于克服CNS再生障礙，促進軸突的再生，有利于脊髓功能的改善和視神經的再生。血管的形成和雪旺氏細胞的滲入也更明顯，這使層粘連蛋白增高，為軸突再生提供了一個合適的基質。Lazarov等［34］通過實驗證實在橫斷處植入活化的巨噬細胞可促進RGC軸突長入遠端的視神經，他們切斷視神經，但保留血供和神經鞘的完整，巨噬細胞在體外孵育時用坐骨神經碎片活化后以混懸液植入橫斷處，7~8周后4Di-10ASP逆行標記發現有軸突再生。Yuqin等［35］將雄性大鼠在視處鉗壓2 mm，5 s后制成視神經損傷模型。在其傷眼內損傷當日（A組）和3天后（B組）分別注射安慰劑PBS（n=4/每組）作為對照組，實驗組在實驗前7天（a組）和3天（b組），損傷當日（c組）和損傷后3天（d組），7天（e組）分別都注射酵母聚糖A（n=4/組）。提前7天注射酵母聚糖即可使局噬細胞水平大量增高并維持一至兩個禮拜，而a組和b組未見能明顯改善視神經再生水平，c組，d組平均能使受損側神經生長4.7 mm，是a，b組的2倍，這提示并非巨噬細胞的數量決定了RGCs能否被刺激產生新的軸突和程度。d組是c組提高神經軸突再生水平的1.6倍（P=0.06），是B組的9倍（P
3.2 巨噬細胞調理液（macrophage conditional medium，MCM） 將生后2~3天Swagae-Dawley大鼠視網膜組織經胰蛋白酶消化后進行培養，并設對照組。結果培養在鼠尾膠原上的視網膜神經細胞（retinal Neurol，RN）生長良好，且部分細胞伸出突起培養1、3、5天，MCM促RN存活率分別為40.7％、39.9％和51.2％。故認為MCM能明顯促進培養RN的存活和生長，表明MCM中存在某些促進RN存活的營養物質［37］。
4 展望
一些動物實驗在一定程度上說明了適度激活的小膠質細胞/巨噬細胞有利于CNS損傷后結構和功能的修復。調控小膠質細胞/巨噬細胞的功能將是未來應用小膠質細胞/巨噬細胞作為一種治療視神經損傷手段的方向。
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篇2
【關鍵詞】巨噬細胞；小鼠；吞噬功能；檢測方法
細胞吞噬作用最早是單細胞動物攝取營養物質的方式，也是原始防御作用。通過對小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬活動的觀察，可使學生加深理解細胞吞噬作用的過程及意義。本項目通過改用酵母菌作為吞噬顆粒，希望可以得到更全面、直觀、生動的巨噬細胞吞噬觀測效果。同時，改用體外吞噬法來檢測巨噬細胞的吞噬功能，使實驗更加簡便、易行、經濟。通過以上優化及改進，旨在探討建立一種更為經濟，簡便直觀的觀察小鼠巨噬細胞吞噬效果的實驗改良法。
一、材料
1．小白鼠腹腔注射液
6%淀粉肉湯。在100mL蒸餾水中加入牛肉膏0.3g，蛋白棟1g，氯化鈉0.5g，加熱后加入可溶性淀粉6g，促使溶解后煮沸滅菌，置4℃冰箱保存。用時水溶融化即可。
2．吞噬物
酵母菌菌液。將酵母菌接種于麥汁斜面培養基上，培養24小時后，用生理鹽水反復吹打沖洗斜面培養基上的酵母菌，離心收集菌體，制成菌懸液后加熱殺死菌體。用1％美藍染色，反復生理鹽水洗滌離心3次后，制成菌懸液，可長期4℃冰箱保存備用。
二、方法
在實驗前一天，給小白鼠腹腔注射6%淀粉肉湯1mL/只，輕按小白鼠腹部，使懸液分散。24h后將注射過淀粉肉湯的小白鼠腹腔注射10億/mL的酵母菌菌液1mL/只，頸椎脫臼法處死小鼠，用注射器從小鼠腹腔吸出腹腔液。在eppendorf管中各加入巨噬細胞懸液和酵母菌菌液各300µL，置37℃溫箱保溫20min。用滴管吸取混合液滴片，加蓋玻片后直接用高倍鏡觀察，并隨時滴片繼續觀察不同時期的吞噬狀態。
三、效果
本實驗與常規體內吞噬雞紅細胞法相比，具有以下特點：①改選酵母菌作為吞噬顆粒來觀察巨噬細胞的吞噬效果。酵母菌體積極較小，與雞紅細胞相比更易被巨噬細胞吞噬，因此在有限的實驗時間內更易觀察到吞噬現象的三種階段，吞噬現象觀察更為生動全面。酵母菌還可預先被染色，與其它細胞區分明顯，在顯微鏡下有更加直觀、生動的觀察，在室溫適宜時，還可作吞噬過程的連續攝影，增加了實驗的直觀性。另外，酵母菌可長期保存，活化方法簡易可行，較血細胞而言大大節省了實驗費用；②改用直觀簡便的體外eppendorf管法來達到實驗效果。在此法中，巨噬細胞和酵母菌各取適量于eppendorf管中，兩者完全處于自由懸浮狀態，有充分的接觸機會，比在體內注入酵母菌更易全面接觸，所以檢測的吞噬指數更高，觀察更為清晰直接。還可避免學生在注射雞紅細胞時常因注射部位的偏差，吸取腹腔液觀察時常有雞紅細胞量過少的等問題出現，導致實驗結果觀察失敗。③優化后實驗可與動物免疫血清制備及其檢測的實驗相結合，使得老鼠實驗成本大為降低，從而更加經濟。總之，希望采用這種方法后，使巨噬細胞吞噬實驗變得操作簡單，易于掌握，費用降低，觀察時清晰可辨，以達到較好的教學效果。
作者簡介：
篇3
關鍵詞：SRT1720 動脈粥樣硬化 泡沫化程度 氧化低密度脂蛋白
Experimental Study on the Optimal Administration Time of SRT1720 in Inhibiting the Foaming of Macrophages
JIANG Yi-hua WANG Qian CAI Jin-yu LYU Xue-yang WANG Qi ZHOU Xiao LI Jing-jing
School of Medical Imaging,Xuzhou Medical University;
Abstract：Objective To investigate the relationship between the suppression of macrophage foaming by SRT1720 and the administration time.Methods Macrophage RAW264.7 was planted on three 24 well cell culture plates. Each plate was divided into three groups to culture cells. Control group only added medium and oxLDL group added 60 μ g/ml ox-LDL, ox-LDL + srt1720 group, 60 μg/ml ox-LDL, cultured for different times(0,12, 24 h) and then added 10 μmol/L SRT1720 intervention, oil red O staining and cholesterol determination, compared macrophage foam inhibition situation. Results Compared with the control group, the cholesterol content in ox-LDL group increased at 0, 12 and 24 hours, the difference was statistically significant(P <0.05); Compared with ox-LDL group, the ratio of oil red O staining at 0 and 12 hours in ox-LDL + SRT1720 group decreased, the difference was statistically significant(P<0.05), and the ratio of oil red staining at 24 hours decreased slightly, but the difference was not statistically significant(P>0.05); The cholesterol content in ox-LDL + SRT1720 group decreased at 0 h, the difference was statistically significant(P <0.05), and decreased slightly at 12 and 24 h, but the difference was not statistically significant(P >0.05).Conclusion SRT1720 has a better inhibitory effect when administered in the early stage of atherosclerosis.
Keyword：SRT1720; Atherosclerosis; Degree of foaming; Oxidized low-density lipoprotein;
巨噬細胞泡沫化（macrophage foam）是動脈粥樣硬化的重要因素，脂質的過量存積則是泡沫化的主要原因，減少細胞內己經存積的脂質對抑制泡沫化有重要作用[1-3]。去乙?；?(SIRT1）通過減少泡沫細胞的形成阻止動脈粥樣硬化[4-6]，使肝X受體（LXR）去乙酰化后可以上調后者的活性，促進膽固醇逆轉運將膽固醇從細胞內排出，通過抑制早衰防止內皮功能紊亂。已證實SIRT1在巨噬細胞中可以降低動脈粥樣硬化的發生。此外，還有研究發現SIRT1通過抑制NF-k B信號通路[7]降低凝集素樣ox-LDL受體-1(Lox-1）的表達，從而降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取[8,9]。SIRT1在穩定斑塊、降低膽固醇攝取、抑制巨噬細胞泡沫化以及減輕炎癥反應等方面的積極作用，使其成為防治動脈粥樣硬化的新靶標。SRT1720是人工合成的SIRT1特異性激活劑，SRT1720通過與氨基末端催化區的變構位點結合，連接到SIRT1酶-肽底物復合物上，降低乙?；孜锏拿资铣抵?，從而激活SIRT1[10-13]。已有研究表明[14],SRT1720可以抑制巨噬細胞泡沫化，但是對于SRT1720的干預時間對巨噬細胞的泡沫化的抑制效果的影響報道罕見，本研究分別在巨噬細胞經ox-LDL干預不同時間后加入SRT1720，觀察SRT1720的干預時間對治療效果的影響，現將結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及材料
小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購于中國科學院細胞庫（上海），氧化低密度脂蛋白ox-LDL購于上海源葉生物科技有限公司（上海），SIRT1激活劑SRT1720購于大連美倫生物科技有限公司（大連），油紅O購于上海索橋生物科技有限公司（上海），總膽固醇測試盒購于南京建成生物工程研究所（南京）。
1.2 方法
將巨噬細胞RAW264.7種植于3個24孔細胞培養板，每個培養板分3組培養細胞，Control組只加培養基，ox-LDL組加60μg/ml ox-LDL,oxLDL+SRT1720組先加60μg/ml ox-LDL，分別培養不同時間（0、12、24 h）后再加入10μmol/L SRT1720干預，采用油紅O染色和膽固醇測定，比較巨噬細胞泡沫化抑制情況。
1.2.1 油紅O染色
細胞培養終止后，去掉原細胞培養液，PBS漂洗3次，5 min/次；用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，固定結束后PBS漂洗5 min×2次；取油紅O儲備液6 ml，加入蒸餾水4 ml配成油紅O工作液，混合后靜置10 min，濾紙避光過濾后配成油紅O工作液，每孔加入油紅O工作液200μl，避光染色40 min；蒸餾水洗10 s×2次，光鏡下觀察并拍照。
1.2.2 膽固醇含量測定
細胞培養結束，光鏡下帶200μm標尺拍照，隨機取10個細胞，通過細胞與標尺的比例關系計算平均細胞直徑，細胞密度取水的密度，由球體體積計算公式和細胞質量計算公式算出細胞質量；對細胞進行消化分離，制備細胞懸液并取出，1000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀；用PBS清洗2次，取少量細胞懸液計數，計算每孔的細胞數量，計算細胞質量；清洗后以1000 r/min離心速度離心10 min；棄上清液，留細胞沉淀；加入0.2 ml無水乙醇進行勻漿，冰水浴條件下超聲破碎（功率300 W,3 s/次，間隔9 s，重復5次），制備好的勻漿直接測定；準備96孔板，以樣本工作液為1∶100比例混勻，每個樣本3個平行組加入96孔板中；37℃孵育10 min，設置分光光度計波長510 nm，測定各管吸光度值；膽固醇含量（mmol/g組織）=（樣本OD值-空白OD值）/（校準OD值-空白OD值）×校準品濃度（mmol/L）/待測樣本質量濃度（g/L）。
1.3 統計學方法
油紅O染色拍照結束后，采用Image J分析軟件計算出染紅區域面積和細胞總面積的比值，對油紅O染色的巨噬細胞進行定量分析；采用spss 25.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，用沃勒-鄧肯（W）法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 光鏡下觀察油紅O染色處理組巨噬細胞泡沫化情況
o-x LDL組及ox-LDL+SRT1720組0、12、24 h細胞泡沫化程度均高于Control組，其中0 h加入SRT1720對巨噬細胞泡沫化的抑制效果最佳，見圖1～圖3。
2.2 油紅O染色
2.2.1 ox-LDL處理不同時間加入SRT1720的巨噬細胞油紅染色比
SRT1720直接干預可以顯著抑制巨噬細胞的泡沫化，隨著泡沫化程度的增加，藥物的抑制效果呈遞減趨勢，見圖4。
圖1 ox-LDL與SRT1720同時干預后巨噬細胞的脂質沉積
圖2 ox-LDL處理12 h后加入SRT1720干預后巨噬細胞的脂質沉積
圖3 ox-LDL處理24 h后加入SRT1720干預后巨噬細胞的脂質沉積
圖4 ox-LDL處理不同時間加入SRT1720的巨噬細胞油紅染色比
2.2.2 各組細胞中油紅染色脂質沉積比較
與Control組比較，ox-LDL組0、12、24 h油紅染色比均增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與ox-LDL組比較，oxLDL+SRT1720組0、12 h油紅染色比降低，差異有統計學意義（P<0.05),24 h組油紅染色比略降低，但差異無統計學意義（P>0.05）；巨噬細胞泡沫化后，SRT1720越早期給藥其抑制效果越佳，見表1。
2.3 膽固醇測定
與Control組比較，ox-LDL組0、12、24膽固醇含量均增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL+SRT1720組0 h膽固醇含量減少，差異有統計學意義（P<0.05),12、24 h膽固醇含量均略減少，但差異無統計學意義（P>0.05）；在巨噬細胞剛開始泡沫化時SRT1720給藥有抑制效果，見表2。
表1 各組細胞中油紅染色脂質沉積比較（±s,%)
表2 各組細胞中膽固醇含量比較（±s,mmol/g)
3 討論
動脈粥樣硬化是慢性炎癥性、嚴重危害人類健康的疾病，而脂質氧化在動脈粥樣硬化的形成與發展過程中起著重要作用。有研究表明[2]，巨噬細胞參與了動脈粥樣硬化的全過程，是泡沫細胞形成過程中的關鍵因素；另有研究報道[14]，在兔主動脈晚期動脈粥樣硬化病灶中大約45%的細胞，在人冠狀動脈粥樣硬化病灶中超過50%的細胞屬于VSMC來源，且多于巨噬細胞。血液中的單核細胞會在血管內皮受損的情況下通過內皮間隙，然后在內膜下轉化為巨噬細胞，巨噬細胞可以介導滲入血管內皮下的低密度脂蛋白（LDL）發生氧化修飾，最終形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬細胞吞噬大量ox-LDL，導致細胞內脂質堆積，最終形成泡沫細胞。因此，減少膽固醇的流入或增加其流出對減少動脈粥樣硬化的發生具有十分重要的意義。
已有研究表明，SIRT1是去乙?；讣易澹⊿IRT1-7）的一員，在維持細胞能量、脂質代謝及葡萄糖穩態等方面發揮重要作用[7]。近年來，SIRT1在動脈粥樣硬化防治方面的保護作用逐漸受到研究者的關注。SRT1720是人工合成的SIRT1特異性激活劑，通過與氨基末端催化區的變構位點結合，連接到SIRT1酶-肽底物復合物上，降低乙?；孜锏拿资铣抵担瑥亩せ頢IRT1。曹小潔等[7]的研究已證明SRT1720可以抑制ox-LDL誘導的泡沫細胞的形成，但是對其最佳的給藥時間尚無研究。為了提高藥物的利用率和降低藥物對人體的傷害，不同時期的動脈粥樣硬化治療應該對應不同的藥物。SRT1720具有一定的毒性，因此通過設定準確的服藥時間，不僅可以給獲得較好的治療效果，還能降低不必要用藥給人體帶來的危害。
本研究采用在同等操作環境下，巨噬細胞經ox-LDL處理不同時間SRT1720給藥，比較巨噬細胞泡沫化的抑制情況。油紅O染色和膽固醇測定結果顯示，ox-LDL干預時間越久，其泡沫化程度越高，ox-LDL與SRT1720同時加入可以顯著抑制巨噬細胞的泡沫化，由此推測動脈粥樣硬化在此時期給予SRT1720治療，幾乎可以完全抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取。而隨著泡沫化程度的增加，相同量的SRT1720抑制巨噬細胞泡沫化的效能有所降低。因此推測SRT1720可以抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝入，對已經泡沫化的巨噬細胞發生逆向轉變的效果并不明顯。
研究顯示[15]，在動脈粥樣硬化早期發現疾病的患者較少，動脈粥樣硬化疾病早期病理變化和特征性標志是斑塊內泡沫巨噬細胞的浸潤，泡沫細胞的數量和分布是引起斑塊不穩定性的重要發病基礎，與臨床急性心血管事件的發生呈顯著相關。有研究試圖通過影像學手段，實現對動脈粥樣硬化易損斑塊形態和成分性質的早期可視化診斷[16]，經過診療一體化納米粒子[17]的預治療，可以降低血管完全堵塞的風險。尤其是對斑塊內泡沫巨噬細胞進行早期識別及動態定量監測，對于預防急性心腦血管事件的發生具有重要意義，因此診療一體化納米探針的制備在預防動脈粥樣硬化斑塊形成的研究具有重要意義。
綜上所述，SRT1720對于動脈粥樣硬化的早期治療效果最好。如果可將其制成納米探針，對斑塊內泡沫巨噬細胞進行早期靶向診斷治療。由于研究表明對于中晚期的動脈粥樣硬化巨噬細胞泡沫化抑制情況并不明顯，因此其治療方法及加藥量尚不明確。SRT1720對巨噬細胞泡沫化的影響還有待進一步研究，可能對于提高其臨床的治療效果具有重要意義。
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篇4
【摘要】
目的： 檢測小鼠腹腔巨噬細胞TLRs表達情況及糖皮質激素甲基強的松龍對TLRs mRNA表達的影響. 方法： 應用RTPCR檢測正常小鼠腹腔巨噬細胞TLR113的表達；并以甲基強地松龍為免疫抑制劑，誘導小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細胞TLRs mRNA表達變化. 結果： 已發現的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細胞均有表達；小鼠腹腔巨噬細胞經糖皮質激素處理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上調. 結論： Toll樣受體是抗真菌先天免疫的重要組成部分. 甲基強的松龍對巨噬細胞有毒性作用，甲基強的松龍注射后可導致小鼠腹腔巨噬細胞明顯減少.
【關鍵詞】 小鼠；潑尼松龍；免疫抑制法；Toll樣受體
【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.
【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor
0引言
Toll受體在果蠅的發育和抗真菌免疫中具有顯著作用. 實驗證實TLRs(tolllike receptors)表達異常會使免疫炎癥反應不能正常發生，降低機體對病原微生物的清除能力［1］. 糖皮質激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎癥和抑制免疫反應［2］. 近20年來，由于應用糖皮質激素而致機體免疫機能低下的患者患侵襲性曲霉菌病日趨增多. 體內外實驗顯示糖皮質激素在免疫和炎癥應答中有促進和抑制作用，甚至出現雙向作用［3］. 為了解糖皮質激素對TLRs表達的影響，我們以甲基強地松龍為免疫抑制劑，在誘導小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細胞TLRs mRNA的表達情況.
1材料和方法
1.1材料
Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周齡，體質量20～25g（第四軍醫大學實驗動物中心）. 總RNA提取試劑TRIZOL Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基強的松龍，40 mg/支(比利時法瑪西亞普強公司).
1.2方法
1.2.1糖皮質激素誘導小鼠免疫抑制及腹腔巨噬細胞計數
將免疫抑制組小鼠12只皮下注射甲基強的松龍100 mg/kg·d， 共3 d. 正常對照組小鼠12只皮下注射同體積注射用水. 第4日脫頸處死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪開腹部皮膚，暴露腹部，用注射器吸取5 mL無血清RPMI1640培養液注入腹腔，輕揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬細胞懸液，移入離心管中計數.
1.2.2細胞總RNA的提取
收集腹腔巨噬細胞懸液，2000 g離心10 min，棄上清，RPMI1640洗滌1次. 用TRIZOL Reagent一步法提取巨噬細胞總RNA.
1.2.3TLR1~13 PCR引物
根據GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務公司合成（表1）. 表1基因名稱和序列（略）
1.2.4RTPCR擴增TLR1～13基因及內參照βactin基因按照說明書，以Random Primers為引物，將從小鼠腹腔巨噬細胞中提取的總RNA逆轉錄合成cDNA. 分別用TLR及內參照βactin兩組引物進行PCR擴增，反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循環32次，延伸7 min.
1.2.5擴增產物檢測取10 μL PCR產物，15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳40 min，隨后在凝膠成像系統中分析電泳帶的吸光度值. TLRs的相對含量為TLRs與內參βactin吸光度比值表示.
統計學處理：實驗結果以x±s表示，兩組間差異比較用t檢驗，多組間比較采用KruskalWallis H檢驗.
2結果
2.1小鼠腹腔巨噬細胞數量變化將甲基強的松龍注射后，小鼠腹腔巨噬細胞數量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比較有統計學差異（P
2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細胞的表達經RTPCR檢測，TLR113在小鼠腹腔巨噬細胞均有表達(圖1).
2.3免疫抑制狀態下小鼠腹腔巨噬細胞TLRs的表達變化糖皮質激素可上調巨噬細胞上部分TLRs mRNA表達(圖1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表達量增加約1.2～2.0倍(表2). 若
3討論
TLRs在不同組織細胞的表達各異 ，可分為廣泛表達、限制性表達或特異性表達［4］，如TLR1分布于各類免疫細胞，TLR2，4，5只在髓源性細胞表達，TLR3則主要表達于樹突狀細胞. 小鼠腹腔巨噬細胞為常駐巨噬細胞，是防御病原微生物入侵的第一道防線. Muzio 等［5］研究顯示， 單核/巨噬細胞在發育成熟的不同階段表達大多數TLRs，但不表達TLR3. 我們的結果證明TLR113在小鼠腹腔巨噬細胞均有表達，包括TLR3. 當局部受到細菌、真菌及病毒感染時，巨噬細胞上的TLRs可識別不同的病原體相關分子模式如細菌脂肽、dsRNA，LPS和細菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫應答并啟動獲得性免疫應答.
多種病原微生物成分或細胞因子可上調或下調TLRs表達，如LPS可誘導TLR2，TLR4及TLR9的表達，IL6可使TLR7的表達明顯升高，INFγ可上調TLR9的表達. Renshaw等［6］研究證實，老齡小鼠的脾細胞和腹腔巨噬細胞TLR1～9的表達顯著減少，且TLRs功能下降，這可能部分解釋老年人對各種病原菌感染的易感性增加. 糖皮質激素是廣泛應用的抗炎劑，其抗炎效應的發揮是通過下調依賴NFκB的大量炎癥應答相關基因的轉錄，而TLRs的上調可誘導NFκB的活化［7］. 研究發現，大劑量應用糖皮質激素是機會性真菌易感的主要危險因素之一，理論上推測糖皮質激素可能下調TLRs表達. 我們的結果顯示，甲基強的松龍在mRNA水平上調巨噬細胞部分TLRs表達，其調節機制還不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松對呼吸道上皮細胞TLRs家族成員表達的調節，發現地塞米松可上調TLR2～6的表達，與我們的研究結果相一致. Shuto等［7］研究證實，地塞米松協同增強非典型流感嗜血桿菌誘導的TLR2上調，是通過p38MAPK信號途徑的負調節. Franchimont等［9］將地塞米松加入LPS刺激的全血細胞培養中，發現地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，證明了糖皮質激素可強烈抑制Th1細胞促炎因子的分泌，而對Th2細胞抗炎因子的分泌有正調節作用. 糖皮質激素對巨噬細胞部分TLRs有上調作用，免疫功能低下患者易發生機會性感染，但究竟是通過對Toll樣受體信號通路中哪些環節的抑制而發揮作用的？糖皮質激素上調部分TLRs表達的準確分子機制是什么？這將有待于進一步研究.
以往研究認為，糖皮質激素可明顯改變單核巨噬細胞的功能，能抑制巨噬細胞的吞噬和加工處理抗原功能，阻止單核細胞分化為巨噬細胞. 我們在實驗中觀察到糖皮質激素甲基強的松龍對巨噬細胞的毒性作用，甲基強的松龍注射后可導致小鼠腹腔巨噬細胞明顯減少，RAW264.7細胞經甲基強的松龍作用后細胞生長受到抑制甚至死亡. 尚未見文獻報道糖皮質激素對巨噬細胞的直接毒性作用，甲基強的松龍抑制巨噬細胞生長或誘導死亡可能是免疫抑制小鼠對煙曲霉菌易感的機制之一.
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篇5
巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種重要的前炎癥因子，主要作用為抑制巨噬細胞的游走移動，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強其黏附、吞噬作用，還能促進多種炎性細胞因子的生成。MIF廣泛參與機體多種生理及病理生理學反應，包括炎性反應、腫瘤生成和皮膚創傷修復等。MIF在病毒性心肌炎發病機制中起重要作用。近年來，隨著克隆MIF cDNA的成功及其結構的闡明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎癥性疾病中的重要作用已日益為人們所重視。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由親心肌病毒感染所致以心肌炎癥病變為主的疾病，MIF是一種重要的促炎因子，MIF在VMC發病機制及治療中的作用成為目前研究的熱點。因此，本文將MIF的最新進展及其與VM的關系作一綜述。
1 MIF的細胞和組織學來源
MIF既產生于激活的T細胞、單核巨噬細胞及腦垂體前葉，也產生于多種組織細胞，哺乳動物的MIF mRNA和蛋白廣泛表達于各種各樣的造血細胞、中樞和外周神經細胞、具有內分泌和外分泌功能的上皮細胞、脂肪細胞、表皮細胞、汗腺細胞、腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、血管內皮細胞、角膜上皮細胞及內皮細胞、皮膚角質細胞、肝細胞、肺、前列腺及等[1]。單核巨噬細胞是血液中MIF的主要來源。
2 MIF的膜受體
細胞因子通常需要與其相應的受體結合，活化信號傳導途徑而發揮生理作用。目前大量研究證實MIF激活絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成員之一的細胞外信號調節激酶（ERK1/ERK2）傳導通路，而對其激活方式是受體依賴型還是非受體依賴型的研究也是近年來的熱點。2003年Leng等[2]研究發現，CD74是MIF的可能膜受體。MIF可能通過與細胞膜表面蛋白CD74的細胞外基團結合而發揮作用。CD74為MHCⅡ類相關恒定鏈，是一種跨膜蛋白。MIF與CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸殘基高親和力結合后，激活ERK磷酸化級聯反應，從而引起各種細胞的增生及炎性介質的合成與釋放，產生各種生理效應，而兩種抗CD74抗體（LN2或M-B741）可明顯阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗體均可抑制細胞膜上的CD74分子與MIF的結合，從而阻抑MIF的促炎作用。
3 MIF的基因與蛋白結構
人類基因組中MIF定位于21號染色體(21q22，3)，為單拷貝基因。但在小鼠基因組中，則是由10個以上假基因組成的多拷貝基因，定位于10號染色體上。MIF的基因較小，人和小鼠的MIF mRNA長度大約為0.8 kb。1995年，美國Duke大學醫學中心Picower醫學研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全長約2 119 bp，其編碼區由3個外顯子和2個內含子組成，啟動子區域有幾個保守的DNA序列可以和轉錄因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP結合元件反應蛋白等結合，從而受其調控。在MIF cDNA序列中，第173位堿基G或C的變化構成了MIF的單核苷酸多態性。MIF蛋白結構獨特，為α/β結構，以同源三聚體形式存在，通過單體內的β2片層及α2螺旋C末端之間氫鍵相互作用加以穩定[3]。人和嚙齒類動物MIF蛋白質的一級結構為115位氨基酸殘基，相對分子量為12.5 kD。不同種動物的MIF蛋白質分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的為大鼠和小鼠的MIF蛋白質，僅差1個氨基酸，人和小鼠的同源性也高達90%。人和大鼠的MIF蛋白質三維結構基本相似，差別僅在于C末端的11氨基酸堿基上。
4 MIF的生物學功能
4.1 免疫調節功能：MIF是先天性免疫和獲得性免疫的重要調節因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系統和應激反應系統中不可缺少的成員。在免疫過程中，MIF不僅有抑制巨噬細胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，還促進其在炎癥局部浸潤、增生、激活及通過調節細胞信號轉導，促進某些細胞因子的表達，分泌細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同時使NO釋放增加和磷脂酶A2的表達增強，產生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗體則對過度炎癥反應具有顯著的保護作用；反義MIF可以下調Toll蛋白樣受體4-LPS受體復合物的信號轉導分子，減少Gˉ細菌LPS誘導的TNF-α產生，同時負性調節NF-κB調節的相關細胞因子基因的轉錄。
4.2 對腫瘤的作用：有報道發現肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神經母細胞瘤、前列腺癌、結腸癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌以及顱咽管瘤等細胞上有MIF mRNA及蛋白表達，并且多數呈高表達[6]。進一步研究可證實轉移生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上調MIFmRNA及蛋白表達，說明MIF可直接或通過協助其它生長因子而間接地促進腫瘤細胞生長。近期又有發現，抗MIF抗體可有效地抑制腫瘤細胞在淋巴細胞系和血管內皮細胞系中的生長及新血管的形成，從而有效地減慢腫瘤的生長速度。另外，有研究提示，癌細胞的MIF高表達可能影響了腫瘤細胞間的黏附性，使腫瘤細胞更加容易相互分離移動，并向周圍鄰近組織侵襲，從而促進惡性腫瘤的浸潤轉移。目前，關于MIF促進腫瘤發生發展的機制還不清楚，有研究認為MIF對抑癌基因P53的抑制作用可能與其致癌作用有關[7，8]。另外，MIF也可以通過促進基質金屬蛋白酶MMP-9的表達增加，從而促進癌細胞向淋巴結的轉移。
4.3 神經內分泌功能：MIF作為垂體激素和糖皮質激素的一種負反饋調節劑。某些促甲狀腺素垂體細胞通過下丘腦-垂體-腎上腺軸起始宿主應答時伴有MIF的釋放，在下丘腦切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后發現垂體細胞釋放MIF的量與血清中MIF的量基本接近。在下丘腦-垂體-腎上腺軸受刺激后，垂體以“激素樣”方式分泌MIF。MIF可能是一種對糖皮質激素起負調節作用的細胞因子。
4.4 酶學功能：MIF能催化互變異構反應和氧化還原反應，具有3種催化活性作用[9]：為多巴色素異構酶；羥苯丙酮酸互變異構酶，能催化羥苯丙酮和羥苯丙酮酸的酮基-烯酸的互變異構；谷光甘肽（GSH）和二羥酯酰胺作為MIF生理性氧化還原底物，并且它還作為一種新型蛋白質-巰基氧化還原酶參與氧化還原反應。但MIF明確的生理和病理生理功能與催化特性間的關系并未確定。
4.5 損傷修復功能：有研究發現在角膜損傷的愈合過程中，伴隨著角膜細胞浸潤和內皮細胞的分化，MIFmRNA的表達水平也相應增加。隨后發現，在小鼠皮膚損傷愈合過程中，MIF表達有增加趨勢，而應用抗MIF抗體可推遲損傷的愈合。近期Mitchell 等發現內源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纖維細胞的增殖，MIF的這種促增殖效應與P44/P42有絲分裂原激活的蛋白激酶的活性有關。此外，他們還發現MIF可通過蛋白激酶A來調節胞質中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF還可逆轉糖皮質激素對胞質中磷脂酶A2的抑制作用，
5 MIF與VM
VM是臨床較常見的疾病之一，患病率達21.83/10萬，且年齡越小，發病率越高。病毒感染后所致的心臟炎癥可累及心肌細胞、間質組織、血管成分及心包，而導致急性、亞急性和慢性病變。VM急性期可引起心衰、心律失常等癥狀，極少數患者因嚴重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎癥持續，轉為慢性心肌炎，出現進行性心臟擴大、心功能減退、頑固性心律失常，經過數年或更長時間后死于并發癥。引起VM的病原體有20余種，但最常見的為柯薩奇病毒B組（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM與之有關，其次為腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的發病機制至今尚未完全闡明，目前多數認為是病毒直接損害和免疫變態反應所致。目前臨床上VM常采用支持治療、中藥、抗心力衰竭和抗病毒藥物、免疫抑制劑等治療方法，但療效欠佳，部分預后不良[10]。因此，深入研究該病的發病機制，闡明其病理生理過程，尋找有效的藥物治療和生物治療靶點，成為國內外學者研究的熱點和難點。
近年來VM發病率呈增長趨勢，現已知CVB是VM的主要病原，并認為CVB誘導的心肌炎可能在感染過程中依賴細胞因子的釋放，細胞因子在VM發病機制中占有主導地位。MIF是新發現的一種多效型細胞因子，是一種重要的前炎癥因子，由單核巨噬細胞、激活的T細胞、角質細胞等產生，其主要作用為抑制巨噬細胞的游走移動，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強其黏附、吞噬作用，此外，還能促進IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多種細胞因子的生成，從而間接增強巨噬細胞的功能，參與機體炎性反應和免疫應答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到廣泛關注。Matsui等[11]在實驗性自身免疫性心肌炎中發現，心肌組織MIF mRNA和蛋白水平明顯增加，此外，血清MIF濃度也顯著升高，而通過MIF中和抗體阻斷MIF的表達則可以明顯減輕心肌的病變程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管細胞間黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表達。同樣，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨細胞性心肌炎時發現，當注射MIF中和抗體后，心肌炎癥病變也顯著減輕。郭富強等[13]的研究亦發現，MIF在柯薩奇病毒性心肌炎小鼠心肌表達上調，與心肌損害程度密切相關。張小佛等[14]報道急性VM患兒血清MIF水平明顯升高，并與CK-MB呈正相關。這些研究提示，MIF可能與VM的形成有密切關系，有望成為治療和預防VM的一種關鍵靶分子。
6 展望
MIF作為機體的一種多效性的細胞因子，在炎癥應答、免疫調節、神經內分泌和細胞增殖中發揮作用，近年來其在VM發生中的致病作用倍受人們關注。盡管目前對其致病機制還不完全清楚，但MIF的中和抗體已經在動物實驗和臨床上取得較好的療效，另外，其他拮抗MIF的藥物也相繼被發現，如維生素E和西替利嗪等。因此，隨著研究的深入，針對MIF的干預治療將為臨床治療VM提供一個新的思路和方法。
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篇6
【關鍵詞】 β葡聚糖 胞內游離鈣 環磷酸腺苷 RAW264.7細胞系 增殖
［Abstract］ Objective: To explore the effect of βglucan on proliferation， intracellular calcium and cAMP levels of RAW264.7 macrophage cell line.Methods： Cell growth and proliferation were detected by neutral red colorimetric assay， protein synthesis by Lowry′s test， and the concentration of cytosolic calcium and cAMP were determined continuously. Results： Cell growth and protein synthesis were enhanced by βglucan; the concentration of cytosolic calcium was elevated 3～5 min after treatment with βglucan cAMP level increased 1 min after the treatment and maintained at high level. Conclusion： Cytosolic calcium and cAMP were important signal molecules in evaluating effect of βglucan on RAW264.7 cell line.
［Key words］ βglucan; intracellular calcium; cAMP; RAW264.7 cell line; proliferation
隨著免疫抑制劑、激素、廣譜抗生素的大量應用，器官移植技術的廣泛開展、各種導管的廣泛應用及腫瘤治療的廣泛應用，真菌感染尤其深部真菌性醫院感染日益增多。 β葡聚糖是真菌細胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為觀察對象，觀察不同濃度及不同時間的β葡聚糖對RAW264.7細胞的直接影響， 特別是對細胞內第二信使傳遞的影響， 以探討β葡聚糖對RAW264.7細胞的作用機制。
1 材料與方法
1.1 試 劑
RPMI1640、胎牛血清購自Gibco公司；Fura2 AM 購自中國科學院藥物所；β葡聚糖和EGTA購自Sigma公司；其余試劑均為進口分裝或國產分析純。
1.2 細胞培養
小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院上海生命科學研究院。于37℃，5%CO2濕潤環境中培養， 每3天更換1次培養液， 細胞生長匯合成單層細胞時及時傳代， 常規培養液為含10%胎牛血清的RPMI1640。
1.3 細胞生長曲線和蛋白質含量的測定
取對數生長期的細胞按3×103 個/孔接種于96孔板(Cellstar)，共接種16板。待細胞貼壁后，吸出孔內的培養液和未貼壁的細胞。各給藥組分別給予含12.5，25，50，100，200和400 μg/ml β葡聚糖的培養液200 μl，進行培養。每板上作對照，每個β葡聚糖濃度作3個平行孔。每天定時取上述培養板2塊， 于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況， 然后將其中1塊板以中性紅比色法［1］檢測細胞生長情況，另1板用lowry法測定蛋白質含量［2］。以培養時間(d)為橫坐標， 中性紅比色法測得的D值和蛋白質含量為縱坐標， 分別繪制細胞生長曲線和蛋白質變化曲線。
1.4 胞內游離鈣濃度測定
細胞內游離鈣濃度的測定按文獻［3］方法進行。
1.5 cAMP濃度測定
于100 ml培養瓶內接種RAW264.7細胞， 待細胞生長接近匯合時給予不同濃度β葡聚糖刺激， 分別于刺激后1，5和15 min 3個時間點取樣。取樣時棄培養液， 立即向瓶內加入1 ml 預冷的0.24 mol/L 高氯酸溶液， 用橡皮刮收集細胞，冰浴下超聲破碎細胞， 離心取上清， 以KOH中和至pH 6.3左右， 去除沉淀的高氯酸鉀， 取上清液冷凍干燥后于-20℃保存備用。cAMP濃度測定按試劑盒(上海中醫藥大學)說明書進行。
1.6 數據處理
實驗結果用±s表示， 以方差分析作統計學處理。
2 結 果
2.1 β葡聚糖對RAW264.7細胞生長的影響
在相差顯微鏡下觀察， β葡聚糖對RAW264.7細胞形態無明顯影響。對生長曲線和培養液內蛋白質含量的作用均呈雙相性(圖1，圖2)。低濃度β葡聚糖對RAW264.7細胞具有促進作用， 隨著β葡聚糖濃度的逐漸增大， D值也不斷升高， 至β葡聚糖濃度100 μg/ml時達最高峰， 與對照組(不加β葡聚糖)比較差異有統計學意義(P
2.2 β葡聚糖對RAW264.7細胞游離鈣的影響
加入β葡聚糖刺激后胞內游離鈣迅速上升， 在5 min時反應達高峰， 游離鈣上升幅度與β葡聚糖濃度有關(圖3)。以EGTA螯合培養環境中鈣離子的結果顯示，細胞外鈣離子存在與否對β葡聚糖刺激引起的細胞游離鈣波動有明顯影響(圖4)。提示升高的游離鈣來自細胞外Ca2+的內流。
2.3 β葡聚糖對RAW264.7細胞內cAMP含量的影響
β葡聚糖刺激1 min時細胞內cAMP明顯增高(P
3 討 論
巨噬細胞是機體免疫系統專職吞噬細胞之一，源自血液單核細胞，廣泛分布于所有組織中，成為機體抗入侵微生物的第一道防線，在機體抗真菌感染中也起著重要作用。它通過免疫球蛋白受體和補體受體識別并吞噬受調理素作用的微生物;對于未經調理作用的微生物，則通過一組胚系編碼的蛋白-模式識別受體(PRRs)［4］迅速識別表達于微生物表面的稱作病原相關微生物模式（PAMPs)的保守微生物分子，如主要存在于革蘭陰性菌的脂多糖、革蘭陽性菌的磷脂酸以及真菌的葡聚糖等［5］ 。β葡聚糖是真菌細胞壁含量最高的多糖， 具有廣泛的生物學效用。已有研究表明， β葡聚糖可促進多種細胞活化［6］。我們注意到微量β葡聚糖雖可促進RAW264.7細胞增生， 但對細胞結構形態無明顯作用。通過對細胞內第二信使傳遞系統的觀察發現，β葡聚糖可明顯增加細胞內游離鈣和cAMP。胞內游離鈣和cAMP是細胞內重要的信使分子， 介導許多重要的生理功能。通過觀察細胞游離鈣和cAMP的變化， 可以了解β葡聚糖信號在靶細胞內的傳導機制。
本實驗結果表明，β葡聚糖刺激可在2～5 min內使細胞內游離鈣迅速升高， 而且在一定范圍內其上升幅度與β葡聚糖劑量相關。細胞外Ca2+存在與否對β葡聚糖刺激后胞內游離鈣波動有明顯影響， 提示胞內游離鈣的升高主要來源于細胞外Ca2+的內流而非細胞內鈣庫的動員。β葡聚糖使細胞內cAMP濃度升高是否與β葡聚糖促細胞增生作用有關， 尚有待進一步研究， 但我們的實驗結果提示， cAMP含量變化與細胞蛋白合成的量相關。
參考文獻
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篇7
作者：王燕 鄧正照 郭艷紅 于海奕 高煒
【摘要】 目的： 探討晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products， AGE)及葡萄糖對THP1巨噬細胞CXCL16 mRNA表達的影響. 方法： ①選擇合適的培養時間；②不同濃度的AGE與THP1巨噬細胞共同孵育；③不同濃度葡萄糖與THP1巨噬細胞共同孵育；分別用AGE、葡萄糖及同時加入AGE和葡萄糖與THP1巨噬細胞孵育；⑤采用RTPCR檢測孵育后CXCL16及CD36mRNA的表達量，觀察和比較各組孵育后CXCL16及CD36 mRNA的表達情況. 結果： ①隨著培養液中AGE濃度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表達增加；②隨培養液中葡萄糖濃度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表達增加；③AGE及葡萄糖同時作用于THP1巨噬細胞時，對CXCL16及CD36 mRNA的表達上調作用大于AGE或葡萄糖單一因素的影響. 結論： AGE及葡萄糖呈時間和濃度依賴性上調THP1巨噬細胞CXCL16 mRNA的表達，并且AGE及葡萄糖兩者合用可以進一步增加這種表達. 這可能為糖尿病動脈粥樣硬化機制的探討提供新的線索.
【關鍵詞】 CXCL16；糖基化終產物，高級；葡萄糖；糖尿病
0引言
結合磷脂酰絲氨酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， oxLDL）的清道夫受體（scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized lipoprotein， SRPSOX)是一種新發現的清道夫受體， 克隆分析證實其在分子結構上與趨化因子CXCL16是同一分子［1］. 作為清道夫受體，CXCL16可以介導巨噬細胞吞噬oxLDL，形成泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化的發生. 作為趨化因子，它可以參與炎癥細胞的趨化及炎癥細胞間的相互作用［2］. CXCL16的這種雙重作用增強了炎癥與動脈粥樣硬化間的直接聯系，也預示其在動脈粥樣硬化性疾病中的重要作用. 多種炎性刺激因子如脂多糖、白介素18、干擾素γ及腫瘤壞死因子α等可使巨噬細胞、平滑肌細胞和血管內皮細胞的CXCL16表達增加 ［3］，同時也有報道AGE及高葡萄糖對其他清道夫受體如CD36的表達有上調作用［4-5］，但AGE或高葡萄糖是否影響CXCL16的表達國內外少見報道. 我們通過研究AGE及高葡萄糖對巨噬細胞表達CXCL16的影響，同時對AGE及高葡萄糖上調巨噬細胞表達CD36的作用加以驗證，為糖尿病動脈粥樣硬化并發癥的發病機制的探討提供新的線索.
1材料和方法
1.1材料佛波酯（PMA）、AGE購自美國Sigma 公司；葡萄糖購自北京泛基諾科技有限公司；TRIzol及其它RNA提取試劑為Gibco公司產品；所有引物由上海生工公司合成；cDNA 合成酶（MMLV）及Taq酶購自北京天為時代公司；其他試劑均為進口或國產分析純.
1.2方法
1.2.1THP1細胞株培養人單核細胞系THP1株購于中科院上海細胞生物所細胞中心. THP1細胞生長于含有低糖（5.6 mmol/L），100 mL/L 胎牛血清，10 mmol/L HEPES，1×105 U /L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640 完全培養基中，置于37℃，50 mL/L CO2 飽和濕度培養箱內培養.
1.2.2實驗分組取對數生長期THP1細胞（1×106個/皿）進行實驗，每次實驗前用100 nmol/L PMA孵育THP1細胞48 h，使其誘導分化為巨噬細胞［6］. ①單獨AGE處理組：首先確定合適的培養時間，即用100 mg/L AGE與THP1巨噬細胞孵育不同時間（0，6，12，24，48，72 h），根據培養結果，選擇72 h為合適孵育時間，不同濃度的AGE（ 0，50，100，150 mg/L）與THP1巨噬細胞共同孵育72 h；②單獨葡萄糖處理組：用高濃度葡萄糖培養液（30 mmol/L）與THP1巨噬細胞孵育不同時間（ 0，6，12，24，48，72，96 h），確定72 h為合適培養時間后，用不同濃度葡萄糖（5.6，10，20，30 mmol/L）與THP1巨噬細胞共同孵育72 h；③AGE和葡萄糖聯合作用組：分別用AGE(100 mg/L)、高濃度葡萄糖（20 mmol/L）及同時加入AGE(100 mg/L)和葡萄糖（20 mmol/L）與THP 1巨噬細胞孵育72 h.
1.2.3逆轉錄 聚合酶鏈反應檢測CXCL16及CD36 mRNA的表達TRIzol試劑提取細胞總RNA，cDNA反應總體系為20 μL：10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL，500 mg/L Random primer 0.25 μL，6.7×108 nkat/L RNasin 0.5 μL， 3.3×107 nkat/L MMLV 1 μL，5×緩沖液2.0 μL. 以cDNA為模板，分別使用下述3對引物進行PCR，擴增CXCL16基因的引物序列為：上游5′ACTCAGCCAGGCAATGGCAAC 3′，下游5′GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC 3′，擴增片段長度為693 bp. 擴增CD36基因的引物序列為：上游5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA 3′，下游5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA 3′，擴增片段長度為246 bp. 擴增內參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的引物序列為：上游5′CTGGTCACCAGGGCTGCTTTT 3′，下游5′CATGAGGTCCACCACCCTGTT3′，擴增片段長度為936 bp. PCR反應條件為：95℃ 5 min 預變性，95℃ 30 s 變性，60℃ 30 s 退火，72℃ 30 s延伸，30 個循環，72℃ 繼續延伸10 min. PCR反應總體系為20 μL： 無RNA酶水14.75 μL，10×緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL， 100 g/L引物各1μL，8.3×107 nkat/L Taq酶0.25 μL，cDNA模板1 μL.
1.2.4RT PCR產物檢測及半定量分析反應結束后，取5 μL PCR產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠恒壓80 V電泳30 min， 溴化乙錠染色. 利用紫外投射分析儀對電泳結果進行觀察并拍照. 運用軟件SynGene Tools Analysis Software對PCR電泳結果進行灰度值掃描并半定量分析. 每例樣品的CXCL16和CD36基因PCR產物的灰度值分別除以它們相應的內參GADPH基因PCR產物的灰度值， 從而得到上述兩種受體基因mRNA的相對表達水平.
統計學處理：由SPSS13.0 統計軟件完成，組內比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用StudentNewmanKeuls (q) 檢驗，P
2結果
2.1AGE作用于THP1巨噬細胞不同時間對CXCL16，CD36mRNA表達的影響THP1巨噬細胞與100 mg/L AGE孵育不同時間（ 0，6， 12，24，48，72 h），RTPCR 檢測THP1巨噬細胞CXCL16及CD36 mRNA的表達. 隨著孵育時間的延長，THP1巨噬細胞中CXCL16及CD36 mRNA的表達上調，孵育72 h CXCL16及CD36 mRNA表達與孵育0 h相比上調最明顯（P
圖1AGE作用于THP1巨噬細胞不同時間對CXCL16，CD36 mRNA表達的影響(n=4)
2.2不同濃度AGE對THP1巨噬細胞中CXCL16，CD36 mRNA表達的影響THP1巨噬細胞與不同濃度AGE（ 0，50，100，150 mg/L）孵育72 h后，RT PCR檢測THP1巨噬細胞中CXCL16及CD36 mRNA的表達. 各濃度組CXCL16 mRNA的表達除在50 mg/L組與未加刺激因素的對照組（0 mg/L組）之間差異無統計學意義（P> 0.05）之外，其他各組之間的差異均具有統計學意義(P
aP
圖2不同濃度AGE對THP 1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA表達的影響
2.3葡萄糖作用于THP1巨噬細胞不同時間對CXCL16，CD36mRNA表達的影響THP1巨噬細胞用30 mmol/L的高濃度葡萄糖培養液孵育不同時間（0，6，12，24，48，72，96 h），RTPCR檢測THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA的表達. 隨培養時間的延長，THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA的表達上調，與孵育0 h相比，孵育72 h時THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA的表達上調最明顯（P
2.4不同葡萄糖濃度對THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA表達的影響THP 1巨噬細胞與不同葡萄糖濃度（5.6，10，20，30 mmol/L）培養液孵育72 h后，RT PCR檢測THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA的表達. CXCL16 mRNA的表達除在20 mmol/L組與30 mmol/L組之間的差異無顯著性（P>0.05）之外，其他各組之間的差異均具有顯著性(P
圖3葡萄糖作用于THP 1巨噬細胞不同時間對CXCL16，CD36 mRNA表達的影響(n=4)
aP
圖4不同葡萄糖濃度對THP 1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA表達的影響
2.5AGE和葡萄糖同時作用于THP1巨噬細胞對CXCL16，CD36mRNA 表達的影響THP1巨噬細胞分別與葡萄糖（20 mmol/L）、AGE(100 mg/L)、同時加入葡萄糖（20 mmol/L）和AGE(100 mg/L)孵育72 h，RTPCR檢測THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA的表達. 高葡萄糖和AGE分別作用于THP1巨噬細胞時均可使CXCL16，CD36 mRNA表達上調. 二者同時作用時THP 1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA表達上調的程度大于單一因素的作用（P
3討論
CXCL16是一種新發現的清道夫受體，表達在巨噬細胞、血管平滑肌細胞和血管內皮細胞上. 它是繼CX3CL1之后發現的第二個既能以膜結合形式存在又能以分泌型的可溶性分子存在的趨化因子. 以膜結合的形式存在時，CXCL16發揮清道夫受體的功能，結合并吞噬磷脂酰絲氨酸包被的顆粒如凋亡小體和oxLDL ［7］. 在金屬蛋白酶10(metalloproteinase 10)的水解作用下CXCL16的細胞膜外部分脫離細胞膜表面成為游離的分子，發揮趨化因子的功能［8-9］.
我們的實驗結果表明AGE和高葡萄糖對THP1巨噬細胞CXCL16 mRNA的表達有上調作用，且二者共同作用可使CXCL16 mRNA表達進一步增加. 是否影響蛋白的表達（包括膜結合形式和分泌形式）還需要進一步的研究. 我們同時觀察了AGE和高葡萄糖對CD36 mRNA的表達，結果與文獻報道的結果基本是一致的，能夠上調CD36 mRNA的表達［4-5］. 已有研究證明巨噬細胞CXCL16表達的增加促進了對oxLDL的吞噬和泡沫細胞的形成，組化分析也表明CXCL16主要表達在動脈粥樣硬化的斑塊處，而無動脈粥樣硬化斑塊的血管未見有表達［10］. 由此可見AGE和高葡萄糖能夠刺激巨噬細胞CXCL16表達的增加，對解釋糖尿病患者過高的動脈粥樣硬化疾病危險性有重要意義.
AGE及高葡萄糖促進CXCL16mRNA表達的機制尚不清楚. AGE可以上調多個清道夫受體的表達，包括清道夫受體A、清道夫受體B1，CD36和血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（ lectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor1，LOX1，對不同受體AGE調控機制不同. 就CD36來說，AGE與其特異性受體（晚期糖基化終末產物受體）結合，通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ而促進CD36的表達［4］. 高葡萄糖對CD36表達的上調作用可能是通過影響巨噬細胞內的氧化應激張力，增加脂質過氧化實現的［5］. 高葡萄糖也可以上調LOX1的表達，可能的機制是高葡萄糖增加細胞內活性氧基，啟動蛋白激酶C/促分裂原活化蛋白激酶通路，最后通過激活核因子κB和活化蛋白1上調 LOX1的表達［11］. 本研究發現AGE和高葡萄糖同時刺激THP1巨噬細胞時，使CXCL16，CD36mRNA表達上調的程度大于兩種因素單獨作用也提示AGE和高葡萄糖可能是通過不同的作用機制上調THP1巨噬細胞CXCL16，CD36 mRNA的表達.
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篇8
摘要：目的探討二至丸免疫調節作用的活性組分構件。方法運用中藥復方組合化學、血清藥理學和細胞藥理學方法，觀察女貞子、墨旱蓮系列提取物及其組合物對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞的作用。結果女貞子乙醇提取物、墨旱蓮乙醇提取物、女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）具有較強的絲裂原樣作用，可以促進小鼠外周血、脾淋巴細胞增殖和腹腔巨噬細胞的吞噬功能。結論二至丸對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞作用的活性組分構件是女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）。
關鍵詞：二至丸； 中藥復方組合化學； 血清藥理學； 細胞藥理學； 免疫調節； 活性組分構件
Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in Mice
Abstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water，alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions， blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC)，the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (1∶1) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (1∶1).
Key words：Erzhi Pill;
Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmacology; Immunoregulation; Active components
二至丸是中醫臨床的經典名方，《醫便》（明?王三才）記載：“二至丸，清上補下第一方，價廉而功極大?！保?］它由女貞子、墨旱蓮各等份組成，組方簡單，藥性平和，功效確切，作為補益肝腎良藥。數百年來，倍受歷代醫家推崇?，F代還用于衰老、神經衰弱、疲勞綜合癥及更年期綜合癥等疾病的治療。中成藥二至丸先后被歷版《中國藥典》（Ⅰ部）和“第二批國家非處方藥目錄”收載。一些學者相繼從現代藥理學角度對其進行了研究，證明二至丸對機體免疫功能具有多方面的調節作用，但研究中多以水煎劑、女貞子多糖及方中單味藥提取物給藥［2～5］。由于目前對其復方藥效物質基礎及作用機理還缺乏系統規范的研究，致使制劑工藝粗放，日用劑量過大［6］，劑型落后，不符合現代中藥要求，影響了它的公眾認知度。作者在遵從復方配伍規律的前提下，以活性評價為導向，運用中藥復方組合化學、血清藥理學和細胞藥理學方法，對其免疫調節作用的有效組分構件進行探討，以期進一步組成精簡方劑，從而為二至丸的二次開發和臨床應用提供科學實驗數據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物普通級 KM種小鼠，8周齡，體重22～24 g，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究室（許可證號：310101001）。
1.1.2 試劑RPMIl640培養液 (Gibco產品)、無酚紅 RPMIl640培養液 (Sigma產品)，配制時加青霉素1×105 IU/L、鏈霉素100 mg/L，過濾，使用時加體積分數為15% 的胎牛血清（FBS，超級，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，Fluka產品；LPS(脂多糖)，Sigma產品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 μm過濾，分裝，20℃凍存，臨用前稀釋。MTT(噻唑藍)，Sigma產品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，過濾，4℃避光保存。硫代羥基乙酸鈉 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所產品。其余試劑均為市售分析純。
1.1.3 儀器Napco6lOO型CO2培養箱，美國。96孔板，Nunclon，丹麥。微量可調加樣器，Labsystems，芬蘭。多頭細胞收集儀，ZTⅢ型，上海醫科大學。550型酶標儀，BioRad，美國。恒溫水浴搖床，Yamato，日本。
1.1.4 藥物女貞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱蓮 E clipta prostrata L.（EPL），購于重慶市中藥材公司，符合《中國藥典》2005年版Ⅰ部規定。
1.2 方法
1.2.1 女貞子、墨旱蓮提取物的制備取女貞子或墨旱蓮藥材，粉碎，過20目篩，依次用不同溶劑，10倍量提取2次，2 h/次，過濾，合并提取液，回收溶劑，制備女貞子或墨旱蓮的石油醚提取物（簡稱 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（簡稱 NYSYZ或 HYSYZ）、乙醇提取物（簡稱 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（簡稱 NSJZ或 HSJZ）。臨用前，分別用生理鹽水（NS）制備藥液，必要時可加少量 Tween80助溶，濃度相當于1 mg生藥/ml。
1.2.2 含藥血清的制備［7］小鼠按體重隨機分組，每組10只，雌、雄各半。ig給藥，給藥2次，間隔2 h。ig容積10 ml/kg，空白血清組ig NS，各含藥血清組 ig相應組分6.7 g生藥 /kg（組合組分13.4 g生藥 /kg）。末次給藥1 h，深度麻醉，心臟無菌采血，3000 r/min離心10 min，收集血清。同組分血清混合，56℃水浴30 min，-20℃凍存，臨用前4℃凍融。
1.2.3 細胞懸液的制備［8］小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），隨即脫頸椎處死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同時無菌取脾。常規方法制備細胞懸液，PBS液洗滌，離心，細胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培養液，調整濃度為2×106 cells/ml，臺盼蘭排除法檢查細胞存活率大于95%。
1.2.4 淋巴細胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）實驗［9］96孔細胞培養板，各給藥組每孔加入50μl淋巴細胞懸液、20 μl含藥血清和120 μl RPMI164010%FBS培養液（對照組、刺激組分別用20 μl空白血清），混勻后預孵1 h，再加入10 μl ConA或 LPS（終濃度為5 μg/ml）刺激（對照組用10 μl PBS），各設8個復孔。5% CO2培養箱（Forma.USA）37℃培養48 h后，加入 MTT 10 μl/孔（10 mg/ml）培養8 h，棄上清，加入 DMSO 100 μl/孔，MTT結晶充分溶解后，酶標儀570 nm處測定A值。
1.2.5 腹腔巨噬細胞（PMф）吞噬活性實驗［10］96孔細胞培養板，各給藥組每孔加入50 μl腹腔巨噬細胞懸液、20 μl含藥血清和120 μl無酚紅 RPMI164010% FBS培養液（對照組用20 μl空白血清），各設8個復孔。5% CO2培養箱（Forma.USA）37℃培養24 h，棄孔內培養基，加0.075%中性紅溶液100 μl/孔，培養1 h，棄上清液，預溫的 PBS液洗3遍，加入細胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：無水乙醇）100 μl/孔，室溫放置，過夜。次日，取上清液于酶標板中，酶標儀540 nm處測定A值。
1.2.6
統計學處理采用 SPSS11.0統計軟件包。運用單向方差分析（OneWay ANOVA），選用 Dunnett法進行組間顯著性分析。實驗數據以±s表示。
2 結果
2.1
女貞子或墨旱蓮提取物對小鼠 LP和PMφ活性的影響結果見表1。
表1 女貞子或墨旱蓮提取物對小鼠 LP和PMφ活性的影響（略）
與正常對照組比較，1）P＜0.01，2) P＜0.05；與刺激劑組比較，3) P＜0.01，4) P＜0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖從表1可以看出，女貞子或墨旱蓮提取物對 ConA或 LPS誘導的小鼠外周血和脾淋巴細胞增殖、對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性均有較明顯的促進作用。強度順序依次為，NYC＞NYSYZ＞NSJZ＞NSYM；HYC＞HYSYZ＞HSJZ＞HSYM。提示，女貞子或墨旱蓮促進小鼠LP和PMф活性作用最強的組分分別是 NYC或 HYC，即女貞子乙醇提取物或墨旱蓮乙醇提取物。
表2 女貞子墨旱蓮提取物組合對小鼠 LP和PMφ活性的影響（略）
與正常對照組比較，1) P＜0.01，2) P＜0.05；與刺激劑組比較，3) P＜0.01，4) P＜0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖
2.2 女貞子墨旱蓮提取物組合對小鼠 LP和 PMφ活性的影響結果見表2。從表2可以看出，女貞子墨旱蓮不同提取物交叉組合后，對 ConA或 LPS誘導的小鼠外周血和脾淋巴細胞增殖、對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性均有較明顯的促進作用。強度順序依次為 NYC+HYC＞NYC+HYSYZ＞HYC+NYSYZ＞NYC+HSJZ＞HYC+NSJZ＞NYC+HSYM＞HYC+NSYM。提示，二至丸（女貞子和墨旱蓮的組合復方）促進小鼠LP和PMφ活性作用最強的組分構件是NYC+HYC，即女貞子乙醇提取物和墨旱蓮乙醇提取物。
3 討論
免疫功能低下常常與一些疾病的發生、發展密切相關，已經對人類社會構成了巨大威脅。對于疾病、衰老或治療藥物引起的免疫功能低下，現代慣用生物制劑，如胸腺素、轉移因子、干擾素等，或化學制劑如左旋咪唑等，增強細胞免疫功能，但這些藥物容易引起發熱、嘔吐、粒細胞減少及肝腎功能異常等不良反應，而中藥在這方面具有獨特的優勢［11］。在人用疫苗佐劑相對缺乏、人們日益注重改善生命質量的今天，具有高活性免疫調節作用的中藥有效成分被認為是理想的生物反應調節劑［12］。近年來通過臨床或實驗研究發現四君子湯、生脈散、六味地黃丸、當歸補血湯、腎氣丸等補益方劑有很強的免疫調節作用，二至丸在改善機體免疫功能方面療效顯著［13］。目前國內對六味地黃丸的藥效物質基礎及作用機理研究較為深入，相繼研制成功了六味地黃口服液、膠囊、軟膠囊及滴丸等新劑型，取得了巨大的經濟效益和社會效益，而對二至丸的相關研究卻極為薄弱。中藥復方本身的分子多樣性決定了其“有用分子”不明確，無用或誘發毒副作用的分子占絕大多數，從而表現出多成分、多途徑、多靶點的作用特點，這在客觀上增加了中藥復方藥效物質基礎及作用機理研究的難度。目前，關于其方法學研究，觀點和構思較多，如三元設計方案、霰彈理論、血清藥理學及天然組合化學庫與多靶作用機理等［14］，對于實際工作具有一定的啟發和參考價值。作者在實際研究工作中發現，中藥復方組合化學方法在中藥復方活性成分群研究中具有明顯的優勢。該方法借鑒現代藥學組合化學研究方法，選擇能代表方劑主治病癥病理生理和治則的藥理學指標，通過組分或單體成分的組合，采用排除篩選法，找出其活性最強的組份構件，即確定“有用分子”組合的精簡方劑［15］。它與直接測定成分法不同，既可充分體現中藥復方多組分協同的特點，又可簡化中藥復方的分子多樣性，符合中醫藥整體觀和辯證分析的理論精髓?？紤]到二至丸原方及其中成藥均采用方中藥味單獨處理后再組合制劑的工藝路線，故本文運用中藥復方組合化學方法進行活性部位研究。本研究結果表明，女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）是二至丸復方最強的免疫調節作用活性部位，能夠協同LPS、ConA等有絲分裂原誘導的小鼠外周血、脾淋巴細胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬細胞活性。提示這些組分均能激活T細胞及B細胞，具有絲裂原樣作用，可以增強腹腔巨噬細胞的吞噬功能。據此推測，女貞子、墨旱蓮以水做溶媒提取活性成分可能提取不充分，故二至煎劑的藥理作用還不能完全反映二至丸的藥理作用，因此古代醫家用二至丸而不用二至湯。隨著對上述組分的進一步分離、純化及其作用機理的闡明，獲得由有效成分組成的精簡方劑將成為現實，無疑會為現代中藥的研究注入新的內容。
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篇9
[關鍵詞]壓力性潰瘍；rhGM-CSF；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子
[中圖分類號]R62 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）04-0332-04
壓瘡是臨床常見的并發癥之一，壓瘡一旦發生，不僅會給患者帶來新的痛苦，若繼發感染還會加重病情導致死亡。隨著基因工程的進步，重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（recombinant human GM-CSF，rhGM-CSF）在創面修復中得到越來越廣泛的應用。rhGM-CSF是一種多功能細胞因子，已證實在皮膚組織的創面愈合中發揮著重要作用[1]。我院自2011年2月開始，應用rhGM-CSF凝膠治療護理Ⅱ～Ⅲ期壓瘡患者，效果滿意，現報道如下。
1 資料和方法
1.1 一般資料：選擇2011年2月～2013年2月入我院治療的壓瘡患者，按照美國國家壓瘡咨詢工作組（National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP）2007壓瘡分級標準[2]，入選Ⅱ～Ⅲ期壓瘡。納入標準：年齡≥18歲，患者或家屬有治療愿望。排除標準：①最近3個月內參加過其他新藥臨床試驗；②過敏體質者及對藥物成分過敏者；③孕婦及哺乳期婦女；④糖尿病及全身嚴重感染患者。共計入選85例（98處）Ⅱ～Ⅲ期壓瘡。其中男性54例（66處），女性31例（32處）。Ⅱ期壓瘡54處，Ⅲ期壓瘡44處。年齡18～72歲，平均（53.64±15.80）。壓瘡存在的時間為（58.64±43.68）天。壓瘡面積（22.9±7.0）cm2。將患者隨機分為試驗組47例（57處）和對照組38例（41處），兩組患者基線資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 創面處理：操作者為取得資質的造口治療師，統一專門培訓操作方法及評估標準。處理創面時必須遵守無菌操作原則，避免二次污染。首先用生理鹽水清洗創面，將壓瘡內的壞死組織、膿液及異物徹底清除[3]，再用碘伏涂抹，隨后用生理鹽水棉球擦凈。試驗組采用小紗布將rhGM-CSF凝膠（金扶寧，長春金賽藥業股份有限公司提供，國藥準字號：S20100601）搓揉均勻，覆蓋壓瘡創面，對于皮下潛行區域，將凝膠紗條填塞于間隙內，外用無菌干紗加壓包扎，隔天換藥。對照組采用傳統方法，即磺胺嘧啶銀（SD-Ag）霜（鄂藥準字H20110728），用法同試驗組。
1.2.2 全身干預：壓瘡以局部受到摩擦力、剪切力和壓力等導致皮膚破損或潰瘍為主要原因，同時消瘦、惡液質等特殊體質也是發生壓瘡的基礎原因[4]。所以，從患者初診至治療結束護士均應進行全身干預。內容包括：①基礎護理：保持床單位清潔、干燥、平整，囑家屬為患者穿戴透氣性好的純棉衣物，經常換洗；②定時翻身：鼓勵和協助患者每2～3h翻身一次，翻身時采用無張力手法，即將手放到患者身體下受力較大部位向身體正中線方向用力托起患者，取左或右斜30°軸線翻身，防止危險部位皮膚緊繃[5]，③營養支持：糾正貧血及低蛋白血癥，予以高蛋白、高維生素、高熱量、易消化的食物，對不能進食者給予鼻飼，遵醫囑進行補液、輸血、靜脈滴注高能營養物質等支持療法，以增強組織修復能力；④預防感染：定時開窗通風，保持病室空氣流通，減少人員探視，以防止上呼吸道感染，避免因感冒發熱使壓瘡迅速擴大或愈后復發；⑤心理護理：壓瘡患者通常久治不愈，家屬及本人容易失去信心，為此護理人員應對患者表示同情及理解，給予心理疏導及健康宣教，對待患者提出的疑問要耐心一一解答，爭取早日康復。
1.3 倫理學研究要求：患者知情同意，并隨機分組，但不告知患者被分入哪一組（單盲）。本研究經醫院倫理委員會批準，征得患者同意并在知情同意書上簽字，昏迷患者由家屬代簽?；颊呖梢噪S時退出本研究，并保證其隱私不被泄露。
2 評價指標
2.1療效評價：①創面愈合時間：為每處壓瘡從治療開始至愈合所需的時間為愈合時間；②愈合分級：治愈為壓瘡閉合，3%過氧化氫涂抹無泡沫產生；好轉指創面減小，部分創面干燥、紅潤，新生肉芽組織長出，炎性滲出液減少；無效為創面無明顯變化，炎性滲出液仍較多。治愈加好轉計為總有效。
2.2 傷口內細菌培養結果：分別于換藥前、換藥第7天、換藥第14天戴無菌手套，使用棉棒釆集傷口內的分泌物做細菌培養，有細菌計為陽性，無細菌計為陰性。愈合的傷口，按無細菌感染計算。
2.3 壓瘡愈合評分：采用壓瘡愈合量表（Pressure ulcer scale of healing， PUSH）[6]進行評分。分別于換藥前及換藥第7、14天對創面面積、創面滲液量、壓瘡組織類型3項計分匯總，總分下降為有效，總分上升為惡化，總分無變化為無效，用于綜合評估壓瘡處理各階段的療效。評分標準見表1。
3 統計學方法
將全部資料錄入SPSS13.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，服從正態分布時兩組均數比較采用配對t檢驗；兩組創面愈合率和療效比較采用Wileoxon秩和檢驗，兩組總有效率的比較采用χ2檢驗；當P
4 結果
4.1療效比較：對照組41處壓瘡中，32處（78.05%）治療有效，試驗組57處壓瘡中，55處（96.49%）治療有效；試驗組總有效率明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P
4.2細菌培養結果：換藥前、換藥7天、換藥14天感染細菌情況比較采用χ2檢驗。換藥前兩組創面感染細菌情況比較差異無統計學意義（P=0.932），有可比性；換藥7、14天兩組創面感染細菌情況比較差異具有統計學意義（P=0.000），見表3。
4.3換藥前及換藥7、14天PUSH評分：兩組患者換藥前PUSH評分差異無統計學意義（P>0.05），顯示具有可比性；換藥7、14天兩組患者創面PUSH評分差異具有統計學意義（P
5 討論
從全球范圍來看，壓瘡的發生率與15年前比較并沒有明顯的下降，預防和護理壓瘡仍是難題。隨著人口老齡化，慢性疾病患者群體的增多，壓瘡的發生嚴重降低了患者的生活質量。Ⅱ期以上壓瘡通常伴隨感染，細菌可分泌蛋白水解酶分解纖維蛋白，抑制成纖維細胞等的遷移，故細菌感染可明顯抑制創面上皮再生[7]。而且，壓瘡患者在治療疾病的過程中，一般都經歷過多次換藥及高檔抗生素的應用，存在一定程度的耐藥性。因此，理想的壓瘡外用藥應該具有抗菌譜廣、作用性強、減少滲出、促進上皮生長、無毒性的特點。本研究采用的rhGM-CSF凝膠可增強中性粒細胞、單核細胞趨經及其活性，參與并且對創面愈合過程中炎癥反應環節進行調節[8]。從本研究可以看出，換藥第7天和14天時，試驗組細菌清除情況明顯優于對照組，差異具有統計學意義，說明rhGM-CSF相比SD-Ag更具有明顯抗菌優勢。
在整個治療過程中，造口治療師采用PUSH計分表跟蹤評分（“直至壓瘡閉合”去掉），從表4結果可以看出，應用rhGM-CSF凝膠治療后，患者7、14天評分呈明顯下降趨勢，遠遠快于SD-Ag組。試驗組有效率為96.49%，對照組有效率為84.93%。試驗組愈合時間為（16.75±1.22）天，對照組為（21.73±4.55）天。以上數據綜合顯示rhGM-CSF能促進組織修復和再生（“減少滲液”去掉），加速傷口愈合。試驗組大部分患者在使用rhGM-CSF治療后的第5～7天，組織學檢查發現新生表皮細胞出現明顯角化，后續觀察也未發現引起紅腫、過敏等不良反應，證實rhGM-CSF在創面修復中的可靠性和安全性。而且，我們發現部分患者在使用AD-Ag霜換藥過程中，創面有加深的現象，可能和霜劑在創面上應用形成薄痂易導致創面加深有關。而凝膠制劑不粘連傷口，換藥時患者疼痛感明顯優于對照組。
綜上所述，筆者認為除積極消除病因，加強翻身，保持皮膚清潔干燥及全身營養支持外，護理人員遵醫囑采用rhGM-CSF凝膠換藥，能促使壓瘡部位的上皮細胞在無菌、濕潤的環境下形成，促進肉芽再生，能達到加速創面愈合的作用。但對于直徑大于5cm的壓瘡創面，則建議采取手術植皮治療，這不僅能縮短病程，也利于功能康復。
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篇10
關鍵詞：同型半胱氨酸；THP-1單核細胞源性巨噬細胞；內質網應激；動脈粥樣硬化
動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）是一類以脂代謝異常和炎癥反應為主的復雜性病變，其與脂質沉積、炎性細胞浸潤、局部血栓形成及氧自由基產生增多有關。本研究以THP-1單核細胞源性的巨噬細胞為研究對象，用不同濃度的Hcy干預后觀察膽固醇流出和ox-LDL的含量，并檢測ERS相關蛋白的表達，為進一步揭示Hcy在動脈粥樣硬化中的作用提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料 THP-1單核細胞株由本實驗室保存；RPMI1640培養基、胎牛血清為Hyclone公司產品；總膽固醇檢測試劑盒為北京北化康泰臨床試劑有限公司產品；GRP78、CHOP、XBP-1 及ox-LDL檢測試劑盒為Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司產品；Hcy、佛波酯（PMA）為Sigma公司產品，其余試劑為國產分析純[1]。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及分組 取本實驗室液氮中凍存的THP-1單核細胞株復蘇后，用含15%小牛血清的RPMI-1640培養基，置37℃、5%CO2孵育箱培養。待細胞融合到80%～90%時，每瓶加入含500nM 佛波酯（PMA）的培養液孵育48h，誘導單核細胞分化成巨噬細胞。實驗分組：①對照組：以不加Hcy巨噬細胞為空白對照組（0 M Hcy）。②實驗組：在巨噬細胞中分別以50、100、200、500 M Hcy處理細胞，③干預組：100 M Hcy+葉酸+維生素B12（VB12），各組分別培養24 h后檢測后續指標。
1.2.2 TC的測定 采用酶法測定巨噬細胞TC含量，按照試劑盒說明書操作，分別檢測各組TC水平。
1.2.3 內質網應激反應蛋白的測定 各組細胞孵育后，收取并裂解細胞，取細胞上清液后，按照ELISA試劑盒說明書測定各組內質網應激反應蛋白（CHOP、XBP-1、GRP78）的含量。
1.2.4 ox-LDL含量的測定 反復凍融細胞，離心后取細胞上清液用ELISA法測定細胞內ox-LDL 的含量，按照ELISA試劑盒說明書依次測量各孔OD值，記錄并分析數據。
1.2.5 統計學處理 結果以x±s表示，應用SPSS11.0統計學軟件進行統計學分析，兩樣本均數間比較采用Student's t檢驗，多樣本均數間比較采用One-way ANOVA檢驗，以P
2 結果
2.1 THP-1單核細胞源性巨噬細胞的培養 THP-1單核細胞是懸浮生長的細胞，細胞形態規則、大小均一、胞膜完整（圖1A）。經PMA誘導48h后在顯微鏡下觀察顯示此時細胞呈貼壁狀態，形狀不規則并有偽足伸出的巨噬細胞（圖1B）。
2.2 Hcy對巨噬細胞內總膽固醇含量變化 不同濃度的Hcy干預人THP-1單核細胞源性巨噬細胞24h后，與對照組相比，各實驗組巨噬細胞內膽固醇聚集顯著增加，尤其是以100 M Hcy組TC升高最明顯，差異有顯著性（P
2.3 Hcy 對巨噬細胞內ox-LDL 的影響 與對照組比較，不同濃度Hcy干預后THP-1巨噬細胞內ox-LDL的含量均有所增加，以100 MHcy組最明顯，差異有顯著性 （P
3 討論
同型半胱氨酸 （Homocysteine，Hcy）被認為是AS的獨立危險因素，其機制與內皮細胞損傷、氧化應激、脂代謝紊亂等有關。不同濃度Hcy干預THP-1源性巨噬細胞后發現，隨著Hcy濃度升高，巨噬細胞內TC含量升高，表明Hcy也可以促使巨噬細胞發生泡沫化，推測Hcy抑制了巨噬細胞內膽固醇的流出，使細胞內膽固醇異常增加并導致脂質的堆積，從而介導了泡沫細胞的形成和AS的發生發展。
Hcy不僅影響脂代謝，它本身是蛋氨酸循環過程的中間代謝產物，含有活潑而自由的巰基，容易發生氧化還原反應，產生大量的H2O2和O2-，過量的活性氧使LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL通過增加炎性細胞因子的表達、增強細胞毒性反應、抑制誘導型一氧化氮合酶的產生。本實驗探討了Hcy對巨噬細胞膽固醇流出的影響及內質網應激的作用機制，進一步補充和完善了Hcy引起動脈粥樣硬化的機制。