t淋巴細胞范文
時間：2023-03-27 00:38:38
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篇1
關鍵詞: 吸煙;免疫系統;T細胞
摘 要:目的 探討長期吸煙對免疫系統影響的機制. 方法 分別于3mo和9mo對吸煙組及對照組大鼠行抗體形成細胞（AFC）試驗和抗CD3 抗體誘導的T細胞增殖試驗以測定其體液和細胞免疫. 結果 9mo后，吸煙組大鼠對綿羊紅細胞的抗體形成細胞反應及抗CD3 抗體誘導的增殖反應均較對照組顯著降低，而3mo時無顯著差異. 結論 長期吸煙所引起的免疫抑制是與抗原刺激T細胞后，T細胞不能有效地活化、增殖和分化有關，T細胞自身的細胞免疫受到損傷，也使得它不能有效地輔助B細胞進行增殖及產生抗體，從而使體液免疫也變得無能.
Keywords:smoking;immunization system;T cells
Abstract:AIM To investigate the mechanism of how cigarette smoke affects the immunization system.METHODS Antibody-forming cell response and assay for anti-CD3 -in-duced proliferation were performed to determine the cellular and humoral immunity after3and9months’smoking.RESULTS Compared to those of the control group，the an-tibody-forming cell response and anti-CD3 -induced prolifera-tion of smoking group reduced significantly after9months，while there was no significant difference between the two groups after3months.CONCLUSION Immunosuppression caused by chronic exposure to cigarette smoke is related with the impairment of antigen mediated signaling in T cells.The impairment leads to the significant reduction of activation and proliferation of T cells，which in turn causes the impairment of the cellular immunity and thereby the disability to help the B cells to produce antibodies.Therefore，the humoral immu-nity is anergy as a result.
0 引言
吸煙是影響身體健康的一個重要因素，可以顯著升高心臟病、腫瘤、急慢性呼吸道感染的發病率.有人認為就是因為吸煙所引起的免疫系統的損害才導致了人體對這些疾病的易感性［1］ .吸煙可影響廣泛的包括體液的和細胞介導的免疫反應功能［2］ .盡管人們了解到長期吸煙會影響兔子、猴和人類的T細胞反應，但其確切的分子機制卻尚未闡明.大鼠若長期暴露于煙草的主要毒性成分尼古丁，抗體形成細胞的反應就會受到影響.其原因可能是T細胞的反應性增殖降低，也可能是T細胞依賴的抗體反應降低.然而，吸煙對T細胞功能影響的機制人們尚未清楚，這種免疫抑制有可能與T細胞內抗原介導的信號轉導受損有關［3］ .除尼古丁之外，煙草中含有成千上萬種其他毒性物質.為研究吸煙引起的免疫抑制的分子機制，我們給SD大鼠每日持續吸煙數小時，持續9mo，然后觀察其免疫功能的改變.
1 材料和方法
1.1 材料 ①動物:4～5wk齡的SD雄性大鼠共50只購自本校實驗動物中心，到6wk齡時按質量隨機分為對照組和吸煙組，3，9mo時分別處死10，15只.②抗CD3 抗體購自北京中山公司.
1.2 方法 ①煙卷點燃后通過與飼養籠相通的進氣管吹入，吸煙組每日暴露6h，對照組暴露于正常飼養環境.②免疫:大鼠在處死之前4d給予iv5×108 綿羊紅細胞.③淋巴細胞的準備:取大鼠脾臟后將之研碎，經不銹鋼濾網過濾后用NH4 Cl溶液將紅細胞溶解，將脾細胞過nylon wool柱，不結合nylon wool柱的細胞為T淋巴細胞，從而將T淋巴細胞分離出來，然后再用流式細胞儀分析;經不銹鋼濾網過濾的脾細胞用小鼠抗大鼠CD3 單克隆抗體，再在用抗小鼠IgG抗體包被的板上孵育，CD3+ 的細胞被除去，非結合細胞為B淋巴細胞，用流式細胞儀分析.④抗體形成細胞（AFC）試驗［4］ :不同濃度的脾細胞與20μmol?mL-1 的綿羊紅細胞、25μL豚鼠補體混合，再用含100μmol?mL-1 胎牛血清的RPMI1640將液體總量加到150μL，37℃培養45min，然后記數抗體形成細胞.⑤抗CD3 抗體誘導的T細胞的增殖試驗:在96孔板中加入含2×105 個細胞的培養液0.2mL，一組加入5μg?mL
-1 的抗CD3 抗體，另一組不加，37℃培養3d后摻入3 H（0.5μCi/孔），測定.
2 結果
2.1 長期吸煙對抗體形成細胞反應的影響 3，9mo后，與對照組相比，吸煙大鼠脾細胞的T，B淋巴細胞所占比例無明顯差異.經綿羊紅細胞免疫4d后，對兩組大鼠的抗體形成細胞反應進行了測定，結果表明9mo時吸煙組大鼠對綿羊紅細胞的抗體形成細胞反應較對照組顯著降低（P
圖1 略
2.2 吸煙對TCR介導的T細胞增殖的影響 有研究表明，長期吸煙可以減低T細胞對其有絲分裂原的反應［5］ .我們用抗CD3 抗體直接連接TCR，誘導T細胞的增殖，結果發現，吸煙9mo時的大鼠對抗CD3 抗體誘導的增殖反應較對照組顯著性降低（P
圖2 略
3 討論
有報道表明，長期吸煙可以降低機體的免疫力，而且很可能是同時抑制了體液和細胞免疫反應［6］ .作為煙草中的主要毒性成分，尼古丁可以導致T細胞的反應無能，而且很可能是與抗原介導的信號轉導系統的損傷及細胞內Ca2+ 反應抑制相關［3］ .
從本研究結果看，吸煙早期（3mo）并不引起顯著的免疫力降低，而長期吸煙不僅會導致體液的，而且會導致細胞免疫的損傷，說明免疫力的降低是一個損傷逐漸積累的過程.吸煙若能在早期及時戒煙，對機體免疫力的損傷是不會很大的.長期吸煙并不引起淋巴細胞數量和比例的改變，這說明吸煙引起的免疫抑制并不是由于淋巴細胞數量和比例的改變引起的，而是T、B淋巴細胞的功能障礙.長期吸煙者的T細胞在接受了外源性抗原刺激后，并不能夠被有效激活、增殖和分化，細胞免疫受到損傷，也使得它不能有效地輔助B細胞進行增殖和分化，這很可能是體液免疫降低的一個重要原因.作為煙草中的主要毒性成分，尼古丁可以導致T細胞的反應無能，而且很可能是與抗原介導的信號轉導系統的損傷及細胞內Ca2+ 反應抑制相關［3］ .
蛋白磷酸化是細胞調節過程中一個主要的作用方式.抗原刺激T細胞后，蛋白酪氨酸激酶被活化，這就會通過酪氨酸依賴的機制激活磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）及產生IP3［7］ .而IP3是人們所熟知的引起細胞內Ca2+ 迅速、持久上升的重要介質.IP3的產生和細胞內Ca2+ 的蓄積是T細胞發揮其功能的基本條件，因而，長期吸煙所引起的T細胞的功能障礙很可能是由IP3產生或Ca2+ 蓄積障礙所引起的信號轉導途徑受損引起的.
參考文獻
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篇2
【關鍵詞】T細胞；胸腺細胞；分化；選擇
T淋巴細胞(T lymphocyte)簡稱T細胞，是數量最多、功能最復雜的淋巴細胞群，也是適應性細胞免疫應答的執行者，并在TD-Ag誘導的體液免疫應答中發揮重要的輔助作用。T細胞及其亞群歷來是組織胚胎學、醫學免疫學等生物科學領域的研究重點，成果顯著，理論也較為豐富，但不能否認的是，各學科在相關內容的描述上往往不夠統一，或者缺乏足夠的知識關聯，難免會給讀者帶來一些理解上的困難。本文就T細胞的分化發育過程及其形態與表面標志變化進行歸納。
1T細胞的來源
T細胞和B細胞一樣，都是由多能造血干細胞(MHSC)發育分化而來。MHSC首先分化為髓樣祖細胞和淋巴樣祖細胞，胚胎第7周時，淋巴樣祖細胞定向發育成原T(pro-T)細胞(表型為CD410、CD3-、CD8+、CD25-、C-kit+、Lin-、TCRαβ-)，在胸腺血管形成之前，胸腺原基分泌的趨化因子即吸引循環血液中的原T細胞進入其內。原T細胞先后來自卵黃囊、胎肝和骨髓，但進入胸腺的具體途徑和機制還不完全清楚。有人認為是經皮-髓質交界處的毛細血管后微靜脈進入胸腺實質，有人則認為是隨組織液從胸腺被膜進入實質的，從發生上來說，兩種觀點都具有階段性意義。原T細胞進入胸腺被膜下而未到達胸腺皮質之前，稱前T(pre-T)細胞，當其進入胸腺皮質后即稱為胸腺細胞。在相關文獻資料中，多數對于淋巴干細胞的定位較為模糊，名詞使用也比較混亂，因此有必要進行討論，統一認識。筆者認為，淋巴干細胞是淋巴系造血祖細胞的統稱，可分為兩級，淋巴樣祖細胞屬于一級(多向)淋巴干細胞，由其分化而來的pro-T細胞、pro-B細胞和pro-NK細胞(后者尚未證實)則屬于二級(定向)淋巴干細胞；從這個意義上來講，髓系造血祖細胞也可分為二級或三級以上，髓樣祖細胞為一級，可向單系(如紅系)或二系(如粒單系)發展；就T細胞的發育而言，pro-T細胞以前為干細胞階段，pre-T細胞以后為胸腺細胞階段。
2 胸腺微環境
胸腺微環境是胸腺細胞賴以生存的場所，由誘導其增殖、分化與選擇性發育的各種因素構成。淋巴干細胞早期即在胸腺內開始分化，應用小鼠胸腺細胞實驗模型研究表明，在胚胎11～12天pro-T細胞已進入胸腺，在胸腺微環境的影響下胸腺細胞迅速發生增殖和分化。
目前已知誘導T細胞在胸腺內分化、成熟的主要因素包括：①胸腺基質細胞(TSC)通過細胞表面的粘附分子直接與胸腺細胞相互作用，其中胸腺內的哺育細胞(nurse cell)對于T細胞的成熟和分化起著重要的調節作用；②胸腺基質細胞分泌多種細胞因子(SCF、IL-1、IL-6、IL-7、GM-CSF等)和胸腺激素(胸腺素、胸腺α肽、胸腺生成素等)誘導胸腺細胞分化；③胸腺細胞自身分泌多種細胞因子(IL-2、IL-4、IFNy、IFNα等)對胸腺細胞本身的分化和成熟起重要的調節作用；④胸腺上皮細胞(TEC)、巨噬細胞(M )和樹突狀細胞(DC)對于胸腺細胞分化過程中的自身耐受、MHC限制以及功能性T細胞亞群的形成起著決定性作用；⑤細胞外基質也是胸腺微環境的重要組成部分，包括多種膠原蛋白、網狀纖維蛋白、葡萄糖胺聚糖等，它們可促進上皮細胞與胸腺細胞接觸，并促進胸腺細胞在胸腺內移行和成熟。
3胸腺細胞的分化階段
胸腺細胞從皮質淺層到皮質深層，進而經過皮、髓質交界處進入髓質，在胸腺微環境的作用下逐漸分化成熟，它們的分化程序受到嚴格的調控。根據對人胸腺不同部位胸腺細胞的表型分析，胸腺細胞的分化可分為4個階段。
3.1前T細胞:主要位于胸腺被膜下，細胞體積較大，胞質內細胞器少。pre-T細胞的表型為CD3-、CD4-、CD8-、CD25-、C-kit10、TCRαβ-，即尚未出現T細胞標志，但表達末端脫氧核苷轉移酶(Tdt)，部分細胞表達CD7。
3.2早期胸腺細胞:主要分布于被膜下、小葉間隔附近及胸腺皮質淺層。早期胸腺細胞體積大，核圓形，電子密度較低，染色質呈細粒狀，核仁不明顯；胞質少，呈環帶狀，細胞器少，僅見少量游離核糖體和球形線粒體。在胚胎10～14周時，這種細胞是構成胸腺的主要細胞成分。15～20周時，該類細胞數量相對減少，30周至足月則更少。早期胸腺細胞的表型為CD2+、CD3+、CD5+、CD4-、CD8-、CD25-、TCRαβ-，由于缺乏CD4和CD8分子，因此又稱雙陰性(DN)細胞。DN細胞向皮質深層遷移的同時，發生TCRβ基因重排及轉錄，可使自身免于凋亡(apoptosis)，更重要的是，其TCRβ-βCD3可逐漸表達于細胞表面，與基質細胞配基結合后，經p56lek傳導信號，誘導CD4/CD8分子表達及TCRβ基因發生等位排斥。
3.3普通胸腺細胞:由早期胸腺細胞經數次分裂后移向皮質深層發育而成，是胚胎20周以后胸腺皮質的主要成分。細胞中等大小，核圓形或橢圓形，染色質呈斑塊狀，功能活躍者多見核仁，趨向退化者核深染。
普通胸腺細胞表達CD3、CD1和T細胞抗原受體(TCR)，隨即出現CD4和CD8分子。這種具有完整TCR 及CD4+CD8+T細胞又稱雙陽性(DP)細胞，約占此類細胞總數的80﹪～85﹪。只有極少數普通胸腺細胞繼續分化為成熟胸腺細胞，而絕大部分將在陽性和陰性選擇中凋亡而被清除(后述)。
3.4成熟胸腺細胞:主要位于皮質深層或髓質。細胞體積相對較小，與外周血小淋巴細胞形態無異，光鏡和電鏡下也難與普通胸腺細胞區分。成熟胸腺細胞除高表達TCR外，主要表達CD4+或CD8+，所以又稱單陽性(SP)細胞。
4胸腺選擇過程
T細胞發育成熟的關鍵步驟是雙陽性(DP)細胞向單陽性(SP)細胞分化階段所發生的胸腺選擇，包括陽性選擇與陰性選擇，主要組織相容性復合體(MHC)抗原(分子)在這兩種選擇中起決定性作用。
4.1陽性選擇過程:主要發生在DP細胞與胸腺上皮細胞之間的相互作用。在TCRαβ的介導下，若DP細胞能與胸腺皮質上皮細胞表面MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類分子以適當親和力結合，則可能被選擇而繼續發育，分化為SP細胞；若DP細胞不能與MHC分子有效結合或發生高親和力結合，則在胸腺皮質中發生程序性細胞死亡(PCD)即凋亡。在此過程中，MHC-Ⅰ類分子選擇CD8共受體，而使同一個DP細胞表面CD4共受體減少；MHC-Ⅱ類分子則選擇CD4共受體，使CD8共受體減少。這種選擇過程賦予成熟CD8+CD4-T細胞具有識別外來抗原與自身MHC-Ⅰ類分子復合物的能力，CD4+CD8-T細胞具有識別外來抗原與自身MHC-Ⅱ類分子復合物的能力，此即T細胞獲得MHC限制性的基礎。陽性選擇可消除所有非己MHC限制性T細胞克隆，而保存自身MHC限制性T細胞克隆，包括潛在而有害的自身反應性T細胞克隆。
4.2陰性選擇過程:主要發生于DP細胞與胸腺內巨噬細胞(M )、樹突狀細胞(DC)或髓質上皮細胞間的相互作用。位于皮質與髓質交界處的DC和M 均表達高水平的MHC-Ⅰ類抗原和MHC-Ⅱ類抗原，后者與自身抗原結合成復合物，對已經歷過陽性選擇的胸腺細胞進行陰性選擇。能識別自身抗原-MHC分子復合物的胸腺細胞即被激活而發生程序性細胞死亡，而不能識別該復合物的胸腺細胞則繼續發育。經陰性選擇后，排除了自身反應性T細胞克隆，并獲得對自身抗原的耐受性。
經歷上述與MHC有關的選擇過程，約有95%以上的胸腺細胞被滅活或淘汰，只有少量胸腺細胞分化成熟為具有MHC限制性、可識別非己抗原的CD4+CD8-或CD4-CD8+單陽性細胞，即具有免疫功能的成熟T細胞。
5成熟T細胞庫
成熟的胸腺細胞大部分通過皮質與髓質交界處的高內皮微靜脈(HEV)進入血液，少數經淋巴管入血。成熟胸腺細胞為處女型T細胞，或稱初始T細胞(Tn細胞)，它們都是未經抗原刺激的CD45RA+T細胞群，這和記憶T細胞(Tm細胞)表達CD45RO+有所不同。Tn細胞遷出胸腺后，依靠其表面的歸巢受體(HR，即CD44分子)定居于周圍淋巴器官并參加淋巴細胞再循環。遍布全身各處的T細胞共同構成T細胞庫(T cell repertoire)。成熟T細胞庫具有兩個基本特性：①TCR識別抗原受MHC限制，即不僅特異性識別經抗原提呈細胞(APC)加工處理的抗原肽，而且須同時識別與抗原肽結合成復合物的MHC分子；②對自身抗原具有耐受性，一般不對自身MHC分子或與之結合的自身抗原分子產生應答，即所謂自身耐受現象。
參考文獻
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篇3
1 資料與方法
1. 1 一般資料 選取2008年1月～2014年6月收治的肺癌患者80例。按照隨機數字表法分為觀察組和對照組， 各40例， 其中觀察組：男23例， 女17例；年齡30～76歲， 平均年齡（59.69±12.44）歲；平均KPS評分（64.39±21.25）分。對照組：男22例， 女18例；年齡32～76歲， 平均年齡（58.30±12.33）歲；平均KPS評分（65.06±22.21）分。兩組在性別、年齡及KPS評分等一般資料方面比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1. 2 治療方法 對照組患者給予常規方案化療， 連用4個周期。觀察組在化療間期給予六君子丸治療， 每袋重9 g， 9 g/次口服， 2次/d。
1. 3 觀察指標 觀察兩組治療前后血清T淋巴細胞亞群水平變化， 檢測方法為：采患者晨空腹靜脈血， 置于抗凝管中， 以3000 r/min， 高速離心5 min， 采集上層血清， 置于-20℃保存， 采用流式細胞儀（美國BD公司BD LSRFortessa型）測定血清T淋巴細胞亞群水平：包括NK細胞、CD3、CD4、CD8、CD4/CD8， 試劑盒為儀器配套。
1. 4 統計學方法 采用SPSS15.0版軟件進行處理。計量資料用均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗， 計數資料用率（%）表示， 采用χ2檢驗。P
2 結果
兩組血清T淋巴細胞亞群比較， 治療前兩組的血清T淋巴細胞亞群水平比較差異無統計學意義（P>0.05）；治療后對照組患者血清NK細胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平較治療前明顯降低， CD8水平明顯升高（P
3 討論
祖國傳統醫藥在提高免疫功能方面有獨到的優勢， 認為現代醫學所謂的免疫功能低下與中醫的“虛證”密切相關[2]；其從整體出發， 通過調整人體陰陽平衡， 來提高患者的免疫功能。作者認為肺癌患者的中醫辨證以“虛證”為主， 對應了其免疫功能低下的說法， 認為應采用“補虛扶正”的方法治療， 并通過檢測患者血清T淋巴細胞亞群水平的變化觀察“六君子丸”對中晚期SCLC患者免疫功能的影響。六君子丸是由傳統的六君子湯化裁而成， 組方如下：黨參、白術、茯苓、半夏、陳皮、瓜蔞皮、杏仁、薏苡仁， 具有補脾益氣， 燥濕化痰之功效。
T淋巴細胞是機體免疫系統內功能最重要的一大細胞群， 在正常機體內各個T淋巴細胞亞群相互使用， 維持著機體正常的免疫功能。在T淋巴細胞亞群中NK細胞是抗腫瘤的重要效應細胞， 不僅可以直接殺傷腫瘤細胞， 還可以通過產生白介素-2（IL-2）、干擾素細胞因子而增強其他細胞的抗腫瘤作用；CD3代表總T細胞， CD4代表T輔助細胞（TH）即免疫輔助細胞， CD8代表T抑制細胞（TS）即免疫抑制細胞[3]。
本研究結果顯示經過4個周期的化療后對照組患者血清NK細胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平較治療前明顯降低， CD8水平明顯升高， 說明化學治療損害晚期SCLC患者的免疫功能， 而觀察組患者血清NK細胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平較治療前明顯升高， CD8水平明顯降低， 說明中醫補虛扶正治療能夠提高患者的免疫功能。
綜上所述， 中藥六君子丸可以提高晚期SCLC患者T淋巴細胞所介導的免疫功能， 從而提高臨床療效， 值得臨床推廣應用。
參考文獻
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篇4
[關鍵詞] 肺癌；T淋巴細胞；NK細胞；流式細胞術
[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）04（b）-0093-03
肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤。肺癌的5年生存率只有10%～20%[1]，預后極差。近50年來，我國肺癌發病率明顯增高，在大中城市肺癌已居男性腫瘤之首。T淋巴細胞在抗腫瘤中具有極其重要的作用；T細胞應答是控制腫瘤生長發育的最重要的宿主應答；參與抗腫瘤免疫的兩類T細胞亞群為CD4+輔助/誘導T細胞、CD8+抑制/細胞毒T細胞；T淋巴細胞及亞群可作為臨床判斷患者狀態的一個敏感指標，對臨床治療具有重要意義。NK細胞在抗腫瘤的天然免疫和特異性免疫中發揮效應作用，能夠直接殺傷各種腫瘤細胞和病毒感染細胞，是機體抗腫瘤的第一道防線。本文旨在探討肺癌患者淋巴亞群變化和不同年齡組細胞免疫狀況。
1 資料與方法
1.1 一般資料
570例肺癌患者均為2009年1月～2012年10月淮南東方醫院集團腫瘤醫院初次住院的臨床確診患者，其中，男性481例，女性89例，男女比例為5.4∶1；最大年齡92歲，最小27歲，中位年齡66歲。正常對照組20例，其中，男性13例，女性7例，年齡35～57歲，均為體檢未發現腫瘤及免疫性疾患的人員。
1.2 樣本采集
肝素真空采血管采集靜脈血2 mL，室溫放置，樣本24 h內做染色處理。
1.3 試劑儀器
使用BD MultitestTM IMK kit 四色熒光抗體試劑盒（Cat No：340503），CaliBRITETM 3 COLOR KIT（Cat No：340 486）和CaliBRITETM APC（Cat No：340487）定標熒光微球，FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司），調用四色免洗條件MultiSET軟件自動分析淋巴細胞亞群；報告NK細胞（CD16+56+）、T淋巴細胞（CD3+）、輔助/誘導T細胞（CD3+ CD4+ CD8-）和抑制/細胞毒T細胞（CD3+ CD4- CD8+）占淋巴細胞的百分比和CD4+/CD8+細胞比值。
1.4 統計學處理
實驗數據均以 x±s表示，組間比較用t檢驗，淋巴亞群結果的年齡趨勢分析用線性回歸分析，應用SPSS 17.0統計軟件，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺癌不同年齡組構成比
本組結果在51～80歲年齡段內發病人數占肺癌總人數的78.3%，是肺癌高發年齡段。肺癌在71～80歲組發病率最高（28.8%），可能是人的衰老，免疫系統功能衰弱，特別是細胞免疫功能下降，導致腫瘤發病率增加。由于80歲以上人群數量明顯減少，其發病率明顯減低并不能說明其發生肺癌的概率會降低。各組比例如圖1。
2.2 肺癌患者不同年齡組與對照組淋巴細胞亞群結果
肺癌患者CD4+ T細胞相對減低、CD8+ T細胞相對增高、CD4+/CD8+比值明顯降低，與正常對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）；NK和CD3+ T細胞與對照組比較，差異無統計學意義。肺癌患者不同年齡組與對照組淋巴細胞亞群結果見表1。
2.3 肺癌患者淋巴亞群結果的年齡趨勢分析
以年齡組（1）～（5）組為自變量，以淋巴亞群結果為因變量作線性回歸分析，SPSS 17.0軟件統計結果見表2。
隨著肺癌患者年齡降低NK細胞有明顯降低趨勢（P < 0.01），CD3+ T細胞有明顯增加趨勢（P < 0.01），如圖2。
3 討論
CD4+ T細胞可直接殺傷腫瘤細胞，可識別腫瘤細胞分泌的可溶性抗原，參與B細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和細胞毒T細胞的激活，進而發揮抗瘤作用；CD4+ T細胞的減少可以解釋腫瘤的免疫逃避機制。腫瘤細胞具有分泌多種免疫抑制因子功能，可抑制T細胞和NK細胞[2]，使CD4+ T細胞和NK細胞數量減少，CD4+ T細胞和NK細胞減少可削弱機體的免疫監視作用。本組結果顯示CD4+ T細胞和NK細胞明顯降低，說明腫瘤患者存在免疫逃避；隨著年齡的增大CD4+ T細胞降低明顯，免疫功能隨年齡增加而不斷下降[3]，腫瘤的免疫逃避增加。
CD8+ T細胞按CD28有無可分為CD8+/CD28+和CD8+/CD28-兩類，前者有細胞毒細胞功能，而后者則有抑制功能，CD28分子在T細胞激活、增殖中具有重要作用；惡性腫瘤患者CD8+ T細胞CD28+分子表達率顯著下降，影響T細胞的活化增殖，而CD8+/CD28- T細胞逐漸增高，進而造成機體對腫瘤免疫力的下降[3-4]。在抗腫瘤的免疫應答中，細胞毒性T細胞（CTL）成為抗腫瘤免疫的主要效應細胞[5]。本組結果CD8+ T細胞明顯增加超過CD4+ T細胞減少的數量導致CD3+總T細胞增加，說明肺癌患者有抑制功能的T細胞增加，CD8+ T細胞不能被充分激活而無法產生有效抗腫瘤作用。在殺傷腫瘤中往往CD4+、CD8+兩類細胞相互配合，共同協作。腫瘤形成發展過程中，產生或分泌可溶性免疫因子，可誘導CD8的產生同時阻止CD4的形成和成熟而導致CD4+/CD8+比值下降，CD4+/CD8+比值可反映機體的免疫功能狀況。
NK細胞具有抗腫瘤，抗病毒感染，抗器官移植，參與T淋巴細胞、B淋巴細胞的調節及其免疫調節的功能。NK細胞通過受體作用維持平衡、發揮殺傷效應[6-7]。Cooper MA等[8]研究證明人外周血NK細胞可分為二群，80%～90%的NK細胞低表達CD56高水平表達CD16（CD56dim CD16brigh），此類細胞可有效地發揮細胞毒作用；10%～20%的NK細胞表型為CD56brighCD16dim或CD56brighCD16-，其功能主要是分泌細胞因子，參與機體的免疫調節。陳文寬等[9]研究78例喉咽鱗癌患者發現癌癥組較非腫瘤對照組NK細胞活性低；局部晚期患者及有區域淋巴結轉移患者的NK細胞活性同樣降低?？蹬嗔嫉萚10]報道胰腺癌根治手術治療后可明顯提高T細胞亞群和NK細胞的免疫功能。本研究肺癌患者NK 細胞降低與文獻一致[9-11]，患者越年輕NK細胞免疫活性越低。
在21～40歲組NK細胞明顯降低，CD3+細胞、CD8+ T細胞明顯增高，CD4+/CD8+比值顯著降低（P < 0.01），在71～80歲組NK細胞比前四組明顯增高（P < 0.01）、稍高于對照組，說明年輕患者細胞免疫功能活躍，老年患者機體代謝慢、腫瘤生長也相對緩慢，老年機體本身免疫低下，細胞免疫反應降低。不同年齡的肺癌患者細胞免疫功能不同，其治療策略、方法也應不同。肺癌患者越年輕細胞免疫功能紊亂越明顯，提示年輕患者的治療更要注重細胞免疫的調節和平衡。而老年患者機體本身免疫功能低下，細胞免疫對腫瘤的抑制能力有限，應注意機體的整體性治療，防止并發癥。
總之，肺癌患者的CD4+ T細胞降低、CD8+ T細胞升高、CD4+/CD8+比值顯著降低，NK細胞降低，說明患者免疫功能處于抑制狀態，T細胞亞群及NK 細胞活性檢測可作為肺癌免疫功能及預后的監測指標。肺癌年輕患者細胞免疫功能紊亂明顯，提示年輕患者的治療更要注重細胞免疫的調節和平衡。
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篇5
【關鍵詞】丙型肝炎病毒；特異性細胞毒性T淋巴細胞；功能
【中圖分類號】R373.2+1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）02-0763-01
慢性丙型肝炎是一種具有嚴重危害性的傳染性疾病[1]。一些報道表明丙型肝炎患者CTL的免疫功能低下，只能起到抗感染的作用，無法抵抗感染細胞中的病毒，導致病毒一直存在于細胞中，最后可能誘發肝癌。本文對18例慢性丙型肝炎患者外周血中丙型肝炎病毒CTL的活性進行檢測，研究了丙型肝炎患者丙型肝炎病毒CTL的功能?，F將結果報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
慢性丙型肝炎患者18例，其中男11例，女7例，年齡25-56歲，平均年齡41.32歲。所有患者均符合丙型肝炎相關診斷標準，排除乙肝和免疫缺陷病感染，且半年內沒有接受抗病毒和免疫調節治療。使用特異性引物聚合酶鏈式反應法進行丙型肝炎病毒基因型檢測。此外選擇10例正常人作為對照，其中男6例，女4例，年齡19-36歲，對照人員免疫缺陷病毒和肝炎標志物檢測均為陰性，無飲酒和損肝藥物使用史。
1.2 實驗方法
使用PCR-SSP法對患者進行丙型肝炎病毒基因型檢測。將表達丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表達質粒通過基因轉染法轉染HepG2細胞，經篩選獲得穩定轉染的Hep-Core細胞，經過蛋白質印跡法檢測證實有HCV核心蛋白表達；分離患者外周血中的單個核細胞，經體外誘導擴增獲得HCV特異性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core細胞和HepG2細胞作為靶細胞，運用乳酸脫氫酶釋放法檢測HCV-CTL的活性，用酶聯免疫吸附法檢測培養上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量，以正常人作為對照組。
1.3 統計學處理
使用采用 SPSS15.0分析軟件包對所得到的數據進行分析處理，計量資料采用方差分析和t檢驗，P
2 結果
2.1 轉染細胞中丙型肝炎病毒核心蛋白的表達
運用蛋白質印跡法檢測證實使用HCV-C轉染的HepG2細胞中有HCV核心蛋白表達，沒有轉染或空白的細胞中無HCV核心蛋白表達。
2.2 HCV-CTL活性檢測
運用乳酸脫氫酶法分析18慢性丙型肝炎患者和10例正常人的HCV-CTL活性。丙型肝炎組患者的HCV-CTL活性為（24.1±4.6）%，正常對照組為（43.2±6.1）%，兩組比較差異有統計學意義（P
2.3 靶細胞培養上清液中IFN- γ濃度的測定
丙型肝炎組患者靶細胞培養上清液中IFN-γ的濃度為（961±239）pg/ml，正常對照組為（3125±676）pg/ml， 兩組比較差異有統計學意義（P
2.4 HCV-CTL活性和獲得SVR的關系
本研究中另外選取完成常規抗病毒治療的慢性丙型肝炎患者16例，其中獲得SVR患者9例，無應答患者7例，均經過HCV-CTL活性檢測。其中獲得SVR患者的HCV-CTL活性為（41.5±2.6）%，無應答患者為（25.1±3.5）%，兩組比較差異有統計學意義（P
3 討論
慢性丙型肝炎（CHC）是一種具有嚴重危害性的傳染性疾病，主要通過血液傳播。CHC的發病機制比較復雜，丙型肝炎病毒（HCV）和人體免疫系統的相互作用決定了該病的發生發展和轉化。HCV慢性感染可能引發肝臟慢性炎癥、纖維化等，嚴重者甚至會導致肝癌[2]。丙型肝炎患者CTL免疫功能和肝病的惡化程度有一定的關系[3]。CTL免疫功能低下包括細胞抗病毒能力下降、刺激后增殖能力下降、IFN-γ分泌減少等。丙型肝炎病毒感染細胞后機體會產生針對HCV的特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）免疫應答，CTL的數量和質量決定了機體阻止病毒感染惡化和清除病毒感染的效果。如果CTL的免疫應答較強，能夠起到完全清除HCV的作用；如果CTL的免疫應答功能低下，只能起到抗感染的作用，無法抵抗感染細胞中的病毒，導致病毒一直存在于細胞中，最后可能誘發肝癌。
本次研究發現，慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性明顯低于正常人。研究顯示細胞誘導后CTL培養上清液中IFN-γ濃度的濃度較正常人明顯降低，這也說明慢性丙型肝炎患者CTL細胞的分泌能力明顯下降，進一步導致其免疫功能低下。獲得SVR患者的HCV-CTL活性明顯高于無應答組，可見隨著血液中HCV RNA水平的下降，細胞中HCV-CTL的活性顯著提高，提示HCV-CTL活性和HCV RNA復制水平有一定相關性，CTL細胞的免疫功能和控制丙型肝炎病毒復制和清除的基因組有一定關系。
綜上所述，本次研究表明慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性降低，CTL的免疫功能會隨之下降。慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下與病毒水平和基因型有一定關系。
參考文獻：
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篇6
【關鍵詞】 ； 甲基化； 淋巴細胞； 細胞免疫
人體免疫系統是由多種免疫細胞、免疫分子共同參與，形成復雜的網絡結構而發揮作用。其中淋巴細胞對免疫應答的啟動起著至關重要的作用。研究發現，吸毒人群的免疫系統受到極大破壞，淋巴細胞的活性也受到破壞[1]。而在系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等自身性免疫疾病中，均發現其淋巴細胞DNA甲基化水平發生異常[2]。吸毒所導致的免疫力低下，與淋巴細胞甲基化水平是否存在特定規律，這是本研究的主要著眼點。本研究通過檢測康復期強制戒毒人員外周血淋巴細胞基因組DNA甲基化水平和T淋巴細胞亞群變化，研究吸毒者免疫力受損與DNA甲基化的關聯，為探討對免疫病理損傷可能機制提供理論參考。
1 資料與方法
1.1 一般資料 本試驗于2002年9月-2002年12月間進行。以80例康復期強制戒毒人員為研究對象，其來源于福建省司法廳所屬強制戒毒場所自愿參加戒毒的人員，男40例，女40例，平均年齡（32.16±0.98）歲；符合ICD-10阿片類藥物依賴診斷標準和苯丙胺類藥物依賴診斷標準的脫毒患者；經告知同意，自愿參加，并簽署知情同意書；排除HIV、肺結核、肝炎等傳染性疾病患者，排除肝、腎、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群為對照，采集靜脈血樣，其來源于福建省二人民醫院健康體檢中心參加體檢且身體健康無重大疾病者，男40例，女40例，平均年齡（29.33±2.41）歲。兩組在性別、年齡方面比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 主要儀器和試劑 多功能酶標儀Infinite M200 F200（奧地利TECAN）；流式細胞分析儀EPICS XL（美國Coulter）；超低溫冰箱Premium Range（美國NBS）；超微量紫外分光光度計NANODROP2000（美國THERMO）；生化培養箱SHP-250（上海精宏）；臺式離心機（美國EPPENDORF）；可調式移液器（美國EPPENDORF）。
淋巴細胞基因組DNA抽提試劑盒（美國Omega公司）；整體甲基化定量試劑盒（美國Epigentek公司）；單克隆抗體（美國BD公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 外周血T淋巴細胞亞群檢測 被試人員在清晨空腹靜脈采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小試管底部，分別加20 μL熒光標記的單克隆抗體，混勻，室溫（18～25 ℃）孵育15 min。加紅細胞溶解液1 ml，充分混勻。待紅細胞完全溶解后上流式細胞儀檢測。在波長488 nm時，計數30 000個細胞。記錄分析直方圖，數據經ELITE軟件處理，以百分率報告。
1.3.2 淋巴細胞基因組DNA的提取 被試人員在清晨空腹靜脈采血5 ml于EDTA抗凝管中。供試血樣淋巴細胞基因組DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美國Omega公司），按試劑盒說明進行，抽提的DNA保存于-20 ℃備用。
1.3.3 DNA含量測定及純度鑒定 取抽提好的DNA溶于雙蒸水中，于超微量紫外分光光度計NANODROP2000（美國THERMO）上測量260/280 nm光密度值。保證供試樣本A260/280比值均在1.7～1.9之間，濃度在50～100 μg/ml，以用于整體DNA甲基化水平的測定。對不符合要求的DNA樣本重新進行抽提和定量。
1.3.4 淋巴細胞整體基因組甲基化水平測定 DNA整體甲基化水平采用整體甲基化定量試劑盒（美國Epigentek公司）檢測。該試劑盒采用抗原抗體結合的方法，將DNA固定到一個對DNA具有高親和力的反應孔中，甲基化的DNA能夠被5甲基胞嘧啶抗體識別，通過抗原抗體識別反應進行定量，甲基化的DNA與OD值的高低成正比。具體操作步驟按試劑盒說明書操作，DNA甲基化的程度采用如下公式計算：
甲基化%=OD（樣本-空白對照）/2×OD（陽性對照-空白對照）
1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，相關性分析采用多元回歸分析，以P
2 結果
2.1 整體DNA甲基化水平檢測結果 康復期強制戒毒人員淋巴細胞中基因組DNA甲基化百分率為（15.37±3.28）%，顯著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差異具有統計學意義（P
2.2 T淋巴細胞亞群檢測結果 康復期強制戒毒人員CD3+、CD3++CD4+ 和CD3++CD4+/CD3++CD8+值均明顯低于正常健康人群，差異具有統計學意義（P0.05），見表1。
2.3 淋巴細胞基因組DNA甲基化水平與T淋巴細胞亞群的相關性 以基因組DNA甲基化水平為因變量進行多元線性回歸分析發現，CD3+、CD3++CD4+與淋巴細胞基因組DNA甲基化水平呈正相關（r=0.21，0.36，P0.05）。
3 討論
本研究表明吸毒者總T細胞（CD3+）減少，CD3++CD4+細胞也顯著降低，CD3++CD8+無顯著變化，故CD3++CD4+/CD3++CD8+明顯下降，說明抑制吸毒者的正常免疫功能。對人體細胞免疫的影響早有報道。早在1974年Brown等[3]就報道，海洛因成癮者免疫功能缺陷，表現為淋巴細胞轉化率顯著降低。海洛因廣泛抑制機體細胞免疫功能，使淋巴細胞增殖和活性受抑制[4-5]。同時還能引起T淋巴細胞對PHA刺激導致的分化能力下降，分泌IL-2、INF-γ、IL-4能力下降[6]。研究表明，吸毒者整體細胞免疫功能處于抑制狀態，其機制可能是海洛因等藥物毒性代謝產物抑制了T細胞的活性和增殖能力，也可能是長期濫用外源性阿片樣物質引起機體下丘腦神經內分泌激素系統（阿片肽系統）退行性改變，使其對T細胞及其亞群的正常調節作用減退和消失導致細胞免疫功能受損[7]。
DNA甲基化是目前研究較為深入的一種表觀遺傳學調控機制。在近幾年研究中發現，DNA甲基化在自身免疫性疾病中起著重要作用。DNA甲基化水平改變可以影響許多基因的表達，包括一些與黏附因子和細胞因子表達相關的基因，導致T細胞的自身反應性發生改變，從而與疾病發病密切相關。如在系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）和系統性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）患者中，基因組普遍DNA甲基化水平都降低[8-9]。DNA的低甲基化可能通過引起患者的某些基因的異常表達，參與疾病的發生發展[10]。
本文研究結果表明，康復期強制戒毒人員淋巴細胞基因組DNA甲基化水平顯著低于正常人水平，說明對人體淋巴細胞DNA有一定影響，其表觀遺傳修飾發生改變。同時發現淋巴細胞基因組DNA甲基化水平與CD3+和CD3++CD4+呈正相關，說明吸毒所導致的細胞免疫功能下降與淋巴細胞基因組DNA甲基化水平存在關聯。本研究揭示了康復期戒毒人員的甲基化水平狀態，發現細胞免疫功能與淋巴細胞甲基化水平相關性，為今后從分子水平探索對人體免疫病理損傷機制具有重要意義。
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篇7
【關鍵詞】
宮頸癌；外周血T淋巴細胞；NK細胞檢測；臨床意義
The Clinical significane of peripheral blood T lymphocytes and NK cells in cervical cancer patients
WANG Hongning.
Zongnan Womens Hospital, Chengdu 610041, China
【Abstract】 Objective To investigate peripheral blood T lymphocytes in patients with cervical cancer and NK cells and its clinical significance Methods From Jan.2009 to Jan.2011,214 cases of cervical cancer patients were admitted, selected over the same period 200 cases of physical examination (medical group), peripheral blood T lymphocytes and NK cells were detected and compared Results The cervical cancer group and medical group significant difference(P
【Key words】
Cervical cancer；Peripheral blood T lymphocytes；NK cell detection；Clinical significance
T細胞亞群是反映細胞免疫功能的重要指標之一，腫瘤的發生、發展及預后與機體的免疫功能，特別是與T淋巴細胞功能有密切的關系，在腫瘤免疫監測中起著重要的作用［1］。而腫瘤患者以T細胞介導的細胞免疫存在不同程度的紊亂與缺陷。宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康，近年來其發病率有明顯上升趨勢，我們對宮頸癌患者外周血T淋巴細胞及NK細胞進行檢測，了解其臨床意義，具體匯報如下。
1 資料與方法
11 一般資料 選取2009年1月至2011年1月收治的宮頸癌患者214例，年齡38~71歲，平均658歲。所有病例檢測前均未經放療或化療。依據《新編常見惡性腫瘤診治規范》
對214例宮頸癌患者(宮頸癌組)進行腫瘤分期，Ⅰ期102例，Ⅲ期68例，Ⅲ期30例，IV期14例。選取同期進行健康體檢200例(體檢組)，進行外周血T淋巴細胞及NK細胞檢測兩組在年齡上比較，差異無統計學意義，具有可比性。
12 檢測方法 儀器和試劑熒光標記單克隆抗體：鼠抗人CD3PC5/CD4FITC/CD8PE三色標記和同型對照鼠抗人IgG1PC5/IgGlFITC/IgGPE均購自法國Immunotech公司。BeckmanCouIter EPICS XL型流式細胞儀購自美國BeckmCruIter公司。采集晨起空腹新鮮抗凝靜脈血2 ml，肝素抗凝；取外周血100 μl，加入上述單抗20 μl，混勻，室溫避光20 rain染色；加入15 ml紅細胞裂解液，混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細胞；1 500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 ml 01％疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液混勻，1 000 r/rain離心5 min，棄上清；加PBS 1 ml，混勻，2 h內上機檢測。FCM激光為冷亞激光，波長488 nm，采用flowcheck調整光路，用同型對照
調電壓，以SSC為橫座標，FSC為縱座標，構建散點圖，在散點圖上采用設門技術分析淋巴細胞群中CD+3，CD+3CD+4和CD+3CD+8抗原表達情況，每份標本計數1×105細胞。
13 統計學方法 使用SPSS 130統計學軟件進行統計學分
析，因數據不符合正態分布，故采用秩和檢驗，P
2 結果
對兩組病例進行外周血T淋巴細胞及NK細胞的檢測，觀察體檢組、宮頸癌組(Ⅰ期 、Ⅲ期、 Ⅲ期、IV期)變化并比較，具體見表1.
表1
3 討論
機體的免疫系統是在生物進化中逐步建立起來的，其存在與功能的正常建立在機體穩定性的基礎上。在正常情況下，機體的自身免疫功能可以防御病原微生物的侵襲，消除體內損傷或變老的自身細胞，處理體內出現的少量異常細胞。在抗腫瘤免疫中，細胞免疫占據著重要的地位。細胞免疫應答主要是T細胞介導的特異性細胞免疫，已證明T細胞具有有效的抗腫瘤作用［2］。對于T淋巴細胞和NK細胞等細胞免疫的主要效應細胞的研究已經成為現代腫瘤免疫學研究的重點。
胸腺依賴性淋巴細胞即T淋巴細胞又是細胞免疫系統的關鍵組成部分。機體內的T淋巴細胞能識別腫瘤細胞，在接受腫瘤細胞刺激后，轉化為能攻擊和殺傷腫瘤細胞的致敏淋巴細胞，有著免疫監視機能。一旦這種監視機能遭到破壞，患腫瘤的危險就將增加。
CD+3抗原分子通常分布在成熟T細胞表面，故CD+3T細胞數量可代表機體總T細胞數量，而CD+4T細胞通常代表T輔助細胞，CD+8T細胞通常代表T抑制細胞，CD+4/CD+8比值反映了機體細胞免疫功能狀態是否穩定，比值降低代表細胞免疫功能降低。NK細胞是在腫瘤早期發揮作用的效應細胞，不需要預先接觸抗原，無組織相容性復合體(MHC)限制性，不依賴抗體或補體即可直接殺傷MHCl類基因表達低下或缺如的腫瘤細胞，被稱為抵抗腫瘤生長的第一道防線，其表面標志是CD+16CD+56［3］。
宮頸癌患者的T細胞亞群與正常人相比，當具有免疫反應活性的CD+4細胞減少，而具有免疫抑制功能的CD+8細胞升高時，可能引起機體的免疫平衡失調，造成惡性腫瘤患者的免疫功能減退或受到腫瘤細胞產生大量的免疫抑制因子(TDSF)，可廣泛抑制殺傷細胞的活性，同時在腫瘤抗原的刺激下，脾細胞免疫抑制細胞前體被激活，分泌免疫抑制因子，造成宮頸癌患者免疫功能低下［4］。NK細胞在殺傷腫瘤細胞的過程中消耗了大量的NK細胞，以及TDSF使NK活性降低，NK細胞在血液循環中再分布等原因導致宮頸癌患者NK細胞降低［5］。
通過對兩組進行觀察宮頸癌患者的T細胞亞群與正常人相比差異有統計學意義，CD+4細胞減少、CD+8細胞升高。并且隨著宮頸癌患者病情的發展，Ⅰ期 、Ⅲ期與Ⅲ期、IV期外周血T淋巴細胞及NK細胞的檢測比較差異有統計學意義（P
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篇8
【關鍵詞】 T輔助淋巴細胞； 功能變化； 急性肺損傷； 意義研究
【Abstract】 Objective：To investigate the significance of functional changes of T helper lymphocyte in acute lung injury.Method：100 mice were selected and randomly divided into the observation group and the control group，each group had 50 mice.Mice in the observation group were injected with proper amount of LPS and made models of acute lung injury.The contents of interferon and interleukin in the cell supernatants of mice were measured by enzyme linked immunosorbent assay.The expression situation of IFN-γ gene in the mice’s spleen cells was measured by reverse transcriptase-PCR determination method.The measurement results were compared between the two groups.Result：The content of IFN-γ in the observation group was lower than that in the control group，the content of IL-4 in the observation group was higher than that in the control group，the differences were all statistically significant（P
【Key words】 T helper lymphocyte； Functional change； Acute lung injury； Significance research
First-author’s address：The First People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510180，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.25.005
目前認為，促炎與抗炎反應失衡為誘導急性肺損傷發生的根本原因，但目前對促炎與抗炎反應失衡準確評估有較大難度。大量研究表明，T輔助淋巴細胞可反映機體炎癥反應的免疫功能狀態，其功能變化在急性肺損中的作用較大[1]。為了探討T輔助淋巴細胞的功能變化在急性肺損傷中的意義，本文選取100只小鼠作為研究對象進行分析，現將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物 實驗小鼠均為野生鼷鼠的變種，來源于野生的小家鼠，選取100只小鼠作為研究對象。采用隨機數字表法將其分成觀察組和對照組，每組50只，雌雄各半，體重20～24 g。兩組小鼠的一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 小鼠處理 首先為觀察組小鼠進行適量脂多糖（LPS）的注射，其注射的部位主要在小鼠腹腔處，7.5 h之后再為小鼠注射適量的甲?；?苯丙氨酸，然后進行急性肺損傷小鼠基本模型的制作，等到大約3.5 h之后將小鼠處死；對照組小鼠則進行適量生理鹽水的簡單注射，注射的量和觀察組小鼠藥物注射量相同。
1.2.2 細胞培養 在對小鼠進行有效處理之后，按照相關要求進行小鼠脾細胞的正常分離，適量增添細胞培養液，利用顯微鏡觀察小鼠脾細胞的數量，然后對小鼠脾細胞進行稀釋處理，最終使其量控制在10×106個左右，加入適量的刀豆素，使其濃度控制在1.1 μg/mL左右，溫室溫度下及4.5%濃度的二氧化碳的環境下進行細胞培養，細胞培養的時間在70 h左右，培養結束之后，留取細胞上清液，檢測上清液中的IFN-γ濃度及IL-4濃度，最后提取脾細胞中的RNA。
1.2.3 濃度測定 在檢測細胞當中的相關因子濃度時，需要用到IFN-γ酶的專門吸附盒和IL-4酶的專門吸附盒，按照吸附盒上面的具體要求進行細胞測定，利用酶標儀對波長500 nm的位置進行密度檢測，按照標準曲線的變化規律，最終確定小鼠細胞當中的具體因子濃度。
1.2.4 基因表達數量計算 利用PCR的標準測定試劑盒，進行小鼠脾細胞當中的基因轉錄，使其最終合成cDNA，然后進行PCR的有效擴增。對引物序列進行正常排序，主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物，它們分別有各自的上游引物和下游引物。經過對引物圖像的觀察和分析進行產物測量，對三大序列產物進行正常掃描，確定出具體的光密度數值，最后進行三大序列引物光密度數值的相互對比，從而測得基因表達。
1.2.5 損傷指標檢測 首先進行肺組織含水量的正常檢測，在處死小鼠以后，把小鼠的右肺進行有效割除，進行表面水清除之后進行肺組織稱重，稱重之后放到專門烘箱當中進行有效烘干后稱重；然后進行漏出量的具體檢測，在小鼠腹腔當中進行藥物注射，處死小鼠之后利用專用針進行小鼠右心室的有效穿刺，利用適當濃度的生理鹽水進行小鼠肺部的清洗，使其完全干凈，切除小鼠的肺部相關組織，對肺門組織進行正常稱重，進行小鼠肺組織的孵育，孵育的時候要添加適量的甲酰胺，收集其浸出的液體，進行液體吸光值的具體有效計算。對照組小鼠確定伊文思藍的具體濃度值；最后進行小鼠肺組織的有效觀察，進行肺下葉的正常染色，觀察其病理變化情況，利用相關分析軟件確定出細胞PMN的平均值。
1.3 觀察項目和指標 （1）小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量；（2）脾細胞中IFN-γ的基因表達能力[2]。
1.4 統計學處理 所得數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P
2 結果
觀察組小鼠上清液中IFN-γ的含量明顯低于對照組，IL-4含量明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義（P
3 討論
急性肺損傷是一種各種致病因素引發的廣泛肺泡毛細血管損傷，以致炎因子釋放、中性粒細胞浸潤、廣泛肺泡毛細血管損傷為特征，臨床以難以糾正的低氧血癥及進行性呼吸困難為主要表現，急性嚴重肺損傷，在臨床被定義為急性呼吸窘迫綜合征[3]。如何對肺損傷過程中肺泡受損毛細血管保護并修復，是肺保護的重點。ALI的發生發展，由機體過度炎癥反應參與介導[4]。危重病醫學會在2001年將機體過度炎癥反應定義為全身炎癥反應綜合征，其后果為破壞機體自身組織。機體內源性抗炎癥反應伴隨炎癥反應的發生，呈增強趨勢[5]。Bone等[6]將此種抗炎癥反應按抗炎癥反應綜合征概括，其引發的后果是膿毒癥及免疫功能低下，故不管哪方占優勢，ALI病發中，促炎及抗炎反應失衡均為本質原因。故針對檢測的促炎、抗炎反應失衡的程度和方向，應用不同的措施干預，使雙方動態平衡恢復，是對ALI防治的關鍵。但對促炎、抗炎雙方平衡的相關性評價，目前臨床尚無有效評估指標。有研究顯示，Th細胞，可反映雙方平衡關系，Th1細胞以對促炎細胞因子分泌為特征，與促炎反應有密切相關性；Th2細胞以對抗炎細胞因子分泌為特征，與抗炎反應有密切相關性[7-9]。IFN-γ、IL-4為特征性細胞因子，分別由Th1、Th2細胞分泌，二者平衡，可反映促炎和抗炎的平衡情況。
有研究示，取LPS、FNLP經腹腔注射后，肺濕重與干重比、肺伊文斯藍浸出量、肺病理改變均提示成功建立ALI模型[10]。對脾細胞中IL-4、IFN-γ變化進行觀察，結果相較對照組，BLAB/C小鼠在ALI時，脾細胞中IFN-γ呈近60%的下降，而檢測IL-4，呈4倍多的升高。此與蔣雄斌等[10]報道一致，但IL-4升高更為明顯。
IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡變化的典型細胞因子，此種變化表明，在ALI發生時，Th1漂移至Th2。目前研究顯示，Th1飄移至Th2，與下列因素可能相關。（1）LPS結合單核巨噬細胞表面CD14受體，對TNFα、IL-1等炎癥細胞因子釋放，同時伴隨大量抑制介質前列腺素E2的釋放，經PGF2依賴性通道，促使Th細胞向Th2表型明確轉化。PGE2可對Th1合成IFN-γ、IL-2明顯抑制，卻對Th2生成IL-4不影響[11]。（2）與炎癥介質IL-6、IL-1、TNF-α的釋放伴發，糖皮質激素有增加表現，糖皮質激素可對Th1細胞核轉錄抑制因子合成增加產生刺激，此因子與核因子結合，促使復合物形成，從而對炎癥細胞因子的基因轉錄阻止[12]。此外，糖皮質激素，可影響炎癥細胞因子相關基因轉錄。
對脾細胞中的IFN-γmRNA表達進一步觀察得出，ALI時IFN-γmRNA表達下降明顯，IL-4m RNA表達量顯著升高。提示ALI時，可在mRNA水平上使促炎細胞因子IFN-γ的表達抑制，抗炎細胞因子IL-4的表達增加，從而引發促炎、抗炎失衡。
Th1向Th2飄移，表明抗炎癥反應在ALI發生時，呈增強趨勢，而抗炎癥反應的增強，誘導機體細胞免疫功能出現低下。故可通過對Th1、Th2平衡變化檢測，選擇適當的時機，針對免疫功能低下，采取有效的免疫調節措施，使促炎、抗炎平衡恢復，對ALI進行防治。促炎與抗炎反應失衡，為誘導急性肺損傷發生的本質原因，對促炎與抗炎反應失衡準確評估有較大難度[13]。T輔助淋巴細胞可反映機體炎癥反應的免疫功能狀態。
在受到嚴重的創傷之后，傷口是容易感染的，而在感染之后，傷口處容易出現各種病毒和細菌，會嚴重損害人們的身體健康。相關研究結果證明，急性肺損傷與體內炎癥反應不平衡相關，會導致機體促炎、抗炎反應不平衡[14]。機體內各類脾細胞當中，存在很多促炎細胞和抗炎細胞，比如干擾素和白介素等，只有保證這兩種因子平衡，才能保證兩種細胞平衡[15]。當發生急性肺損傷，機體炎癥反應規律是不明確的，各種細胞的反應情況也是不明確的，本文主要通過對急性肺損傷小鼠的功能試驗研究，反應急性肺損傷機體炎癥反應情況。
相關研究結果表明，在急性肺損傷研究當中，觀察機體炎癥反應是比較重要的，因為在肺損傷的過程中，會產生傷口感染從而引起傷口炎癥出現[16]。因此，通過肺損傷相關部位抗炎反應及能力的檢測和觀察，就可以判斷急性肺損傷病情。本文主要通過小鼠淋巴細胞試驗，對小鼠急性肺損傷的相關平衡因子和基因表達功能進行檢測，最終發現，機體抗炎反應在急性肺損傷中的作用非常大，而T輔助淋巴細胞對小鼠體內這種抗炎反應的調節和控制作用也比較大，在急性肺損傷疾病臨床研究中的意義比較大。急性肺損傷機體抗炎反應主要表現為單核細胞的有效受體結合、抗炎因子的生成和細胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4兩大因子的有效合成和轉化、IL-10因子的生成和增加、糖皮質激素的不斷增加及脾細胞因子的異常轉錄等[17]。經過對小鼠體內T輔助淋巴細胞功能變化的有效觀察可以判斷急性肺損傷小鼠的病理學變化情況，急性肺損傷小鼠脾細胞mRNA表達能力比正常小鼠弱很多，證明抗炎反應是導致急性肺損傷的主要原因。
本研究結果表明觀察組小鼠上清液當中IFN-γ的含量明顯比對照組低，IL-4含量卻比對照組高，且經過逆轉錄測定結果顯示，觀察組小鼠體內脾細胞IFN-γ基因表達能力明顯比對照組低，以上比較差異均有統計學意義（P
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篇9
【摘要】 目的 本研究檢測食管癌、賁門癌患者的免疫功能，尋找腫瘤患者的病情量化指標，用來預測和判定臨床治療效果。方法 采集本院胸外科手術前的食管癌賁門癌患者115例及359例正常體檢者的血液標本，應用流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞表面CD3、CD4、CD8及NK細胞（CD56）的表達。結果 食管癌、賁門癌組與健康對照組相比較CD3、CD4有明顯下降（P＜0.05），而CD8、CD56有明顯的增高（P＜0.05）。將癌癥組分為淋巴結轉移組和無淋巴轉移組，兩組間CD3、CD4、CD8、CD56的差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論 食管癌外周血T細胞免疫檢測有助于了解疾病的發展進程。
【關鍵詞】 食管癌；賁門癌;T淋巴細胞亞群；NK細胞；CD3；CD4；CD8；CD56
現代腫瘤免疫學研究表明，腫瘤的發生和發展同機體免疫系統功能異常存在密切關系，而抗腫瘤免疫主要以細胞免疫為主，其中胸腺依賴性淋巴細胞即T淋巴細胞又是細胞免疫系統的關鍵組成部分〔1〕。機體內的T淋巴細胞能識別腫瘤細胞，在接受腫瘤細胞刺激后，轉化為能攻擊和殺傷腫瘤細胞的致敏淋巴細胞，有著免疫監視機能。一旦這種監視機能遭到破壞，患腫瘤的危險就將增加。免疫功能正常與否，直接關系到腫瘤的發生、發展和預后。因此對于T淋巴細胞的研究越來越受到免疫學界和醫學界的重視，成為近年來的研究重點。食管癌是目前我國發病率較高的惡性腫瘤之一，本研究就是通過對食管癌賁門癌患者外周血T淋巴細胞以及NK細胞相關指標的檢測，來探討食管癌賁門癌患者T淋巴細胞及NK細胞功能同食管癌賁門癌發生和發展的關系，以便臨床上監測食管癌人群的免疫狀態，對其免疫治療具有重要的意義。
1 材料與方法
1.1 標本來源
標本來自河北醫科大學第四醫院2006～2007年間搜集的115例食管癌患者，包含發生轉移56例，未發生轉移59例，患者平均年齡60歲，男87例，女28例。食管癌患者在采樣前均未經手術、放療、化療等方法治療。正常體檢者血液標本359例作為正常對照組，其中男151例，女208例，平均年齡53歲。采集靜脈血2 ml，EDTAK2抗凝。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞的免疫熒光標記
取抗凝全血0.1 ml，加入鼠抗人單克隆CD3FITC/CD56PE，CD4FITC/CD8PE；雙標記抗體20 μl，（美國，BECKMAN COULTER公司生產，克隆系CD4：13B8.2，CD8:B9.11），室溫孵育30 min。在免疫熒光制備儀上裂解紅細胞后，流式細胞儀檢測各亞群百分比。
1.2.2 流式細胞儀檢測條件及參數
采用美國Beckman Coulter公司生產的EpicsXLⅡ型流式細胞儀，激發光源為15 mW氬離子激光器，激發波長為488 nm，應用Expo 32 ADC進行免疫熒光數據分析。
1.3 統計學處理
應用SPSS11.5統計軟件包，進行t檢驗、單因素方差分析。
2 結果
免疫功能檢測結果：經單因素方差分析發現4個指標（CD3、CD4、CD8、CD56）在癌癥組與正常對照組間比較有統計學意義(P＜0.05)，見表1。將癌癥組分為淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組，經單因素方差分析發現4個指標（CD3、CD4、CD8、CD56）在兩組間均沒有差異(P＞0.05)，見表2。表1 癌癥組與正常對照組免疫指標比較，表2 有無淋巴結轉移組間免疫指標比較(略)
3 討論
惡性腫瘤作為一種免疫功能異常所導致的疾病得到了醫學界的廣泛共識，惡性腫瘤患者機體的免疫調節作用及其效應網絡大多處于一種相對紊亂的狀態，其中包括機體多種淋巴細胞、細胞因子、黏附因子及共同刺激因子等眾多因素中單個因素或多個因素的失衡，而細胞免疫的紊亂在腫瘤免疫中具有主導作用，因此近年來對于T淋巴細胞和NK細胞等細胞免疫的主要效應細胞的研究已經成為現代腫瘤免疫學研究的重點。CD3是成熟T淋巴細胞的共同分化抗原，表達于所有成熟T淋巴細胞的表面，代表組織和血液中總的成熟T淋巴細胞〔2〕。陳罡〔3〕等的研究發現，在肝癌組織中，腫瘤細胞產生的腫瘤特異性抗原刺激腫瘤特異性T細胞在腫瘤組織中聚集、成熟，使得肝癌組織中的CD3+T細胞數量明顯高于肝硬化組織及正常肝組織。馮偉華〔4〕等的研究顯示，在實體腫瘤和非實體腫瘤中患者外周血CD3+CD56T細胞測定值在實體腫瘤組顯著低于非實體腫瘤組和健康組，非實體腫瘤組和健康對照組間比較無顯著性差異。由于本次實驗的研究對象為食管癌賁門癌，也是實體腫瘤的一種，加之又都是應用流式細胞術檢測外周血，所以本文中CD3+的表達情況同馮偉華等的報道相一致?；谝陨衔墨I的報道和本次試驗的結果推測，食管癌賁門癌這類實體腫瘤患者的外周血CD3+T淋巴細胞數量較正常對照組顯著降低可能是由于惡性腫瘤細胞所產生的腫瘤特異性抗原趨化CD3+T細胞向腫瘤組織中聚集并發育成為成熟的T淋巴細胞從而發揮其特有的抗腫瘤免疫的作用，因為這種聚集的作用，使得外周血中表達CD3的成熟T淋巴細胞的數量顯著減少。
CD56作為一種抗原標志，是220 kD糖蛋白，存在于外周血淋巴細胞及NK細胞表面，而不存在于中性粒細胞上，在人體內CD3-、CD16+、CD56+細胞的數量最多，約占外周血淋巴細胞總數的10%，表現出最強的NK細胞殺傷活性，CD3-、CD16-、CD56+細胞只占外周血淋巴細胞的5%以下，殺傷活性也較前一類細胞小〔5〕，本次試驗的結果中顯示，食管癌賁門癌組患者外周血CD56+細胞的數量顯著多于正常對照組，將癌癥組分為淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組后比較，雖然兩組間均值差異沒有統計學意義，但是轉移組較無轉移組高的結果同孫文輝〔6〕等的研究報道相一致，這一現象的產生可能是隨著腫瘤的進一步發展，刺激人體的免疫系統產生更多的NK細胞參與抗腫瘤免疫，但是，NK細胞的成熟需要IL2的刺激，而惡性腫瘤病人尤其是轉移組mIL2R的結合表達率顯著降低，與腫瘤患者體內存在封閉因子有關，隨著病情的進展腫瘤本身產生的sIL2R可作為封閉因子與mIL2R競爭性結合周圍的IL2，從而使與mIL2R結合的IL2減少，進而降低了IL2的生物學作用〔7〕。因此，不能發育成熟的NK細胞無法到達腫瘤組織中，發揮殺傷腫瘤細胞的作用，而只能滯留在腫瘤患者的外周血中，造成食管癌賁門癌患者外周血表達CD56的細胞多于正常對照組。
CD4+Th細胞是人體抗腫瘤免疫的重要組成部分，它所產生的IL2、IL4、IL5、INFγ是諸如NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞等重要的免疫細胞活化所必需的，另外CD4+Th細胞本身還可以通過INFγ介導的機制直接殺傷腫瘤細胞〔8〕，從以上的論述可以看出CD4+Th細胞在抗腫瘤免疫中的核心地位，所以CD4+Th細胞數量的減少和活性的降低有可能是機體抗腫瘤免疫功能下降的根基。
研究表明，T淋巴細胞活化需要2個信號，即T細胞活化不僅需要T細胞受體識別主要組織相容性復合物分子(第1信號)，還需要抗原遞呈細胞(APC)表面的共刺激分子與其受體結合(第2信號)的共同作用，而CD28這個廣泛表達于T淋巴細胞上的免疫蛋白超基因家族的成員正是扮演著這個第2信號的角色，CD8+T細胞根據CD28的表達與否分為細胞毒性T細胞(CD8+ CD28+)和抑制性T細胞(CD8+CD28-)，前者是重要的殺傷效應細胞而后者是不具有殺傷活性的免疫調節細胞。CD8+T細胞CD28表達受多種細胞因子調節，CD8+ CD28+T細胞的丟失和CD8+ CD28-T細胞積聚直接導致了CD8+T細胞殺傷腫瘤細胞功能的下降，因而是T細胞功能下降的標志〔9，10〕，這一觀點得到了臨床研究的證實〔11〕。
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篇10
【摘要】 目的： 觀察茶多酚對人γδt細胞殺傷腫瘤細胞活性的影響和誘導人結腸癌細胞株（sw?480）凋亡和死亡的作用。方法： 在體外用不同濃度的茶多酚誘導人γδt細胞和sw?480細胞株，然后測定人γδt細胞殺瘤活性和對腫瘤細胞的作用。用不同濃度的茶多酚分別誘導sw?480細胞4 h后，棄含有茶多酚的培養液再繼續培養24 h，然后測定其死亡和凋亡數，用γδt細胞作對照組。結果： 茶多酚濃度350 mg/l，作用γδt細胞4 h后能明顯增強γδt細胞的殺傷腫瘤細胞活性，與未誘導組和其他濃度組相比，p<0.01；γδt細胞對經茶多酚處理后的sw?480細胞殺傷活性也明顯高于對照組（p<0.01）。各種濃度的茶多酚分別與γδt和sw?480細胞作用4 h，棄誘導液再繼續培養24 h后，均能誘導其死亡和凋亡，在茶多酚濃度350 mg/l、誘導時間4 h時最明顯；同一濃度的茶多酚誘導sw?480細胞死亡和凋亡率明顯高于γδt細胞組。結論： 茶多酚在一定濃度時能明顯提高γδt細胞對腫瘤的殺傷活性；經茶多酚處理的sw?480細胞更易被γδt細胞殺傷。茶多酚濃度在350 mg/l時能誘導sw?480細胞凋亡而對人γδt細胞無影響。
【關鍵詞】 茶多酚； γδ淋巴細胞； sw?480細胞株； 抗腫瘤活性； 凋亡
［abstract］ objective: to observe cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols and the direct effects of tea polyphenols on human tumor cells sw?480 cell strain death and apoptosis.methods： γδt cells and sw?480 cell strain were induced by tea polyphenols in vitro to examine cytotoxic activity of γδt cell and its direct effects on tumor cells. sw?480 was induced by tea polyphenols continuously for 4 hours following being cultured without tea polyphenols for 24 hours, then the rate of death and apoptosis of sw?480 were measured. γδt cell was used as control group. results： cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols with concentration of 350 mg/l was significantly higher than that of control group and other groups(p<0.01). cytotoxicity of γδt cell on sw?480 induced by tea polyphenols was higher than the control group(p<0.01).after being induced by tea polyphenols continuously for 1～8 hours following cultured without tea polyphenols for 24 hours, sw?480 showed significant cell death and apoptosis in different concentration comparing with the control group. tea polyphenols did not display significant effects on γδt cell. conclusion： tea polyphenols can significantly enhance cytotoxicity of γδt cell and the sw?480 induced by tea polyphenols was easily killed by γδt cell. tea polyphnols in certain concentration can induce cell death and apoptosis of sw?480, while it appears no cytotoxicity to γδt cell.
［key words］ tea polyphenols； γδt cell； sw?480；antitumor activity；apoptosis
茶是備受人們喜愛的飲品之一，而在茶葉中最具有藥效作用的成分為茶多酚類物質。眾多的體內外研究及動物實驗證明，茶多酚有多種生物活性，其防癌抗癌、抗突變、抗氧化、抗衰老、抗菌等作用已有許多研究報道，在誘導腫瘤細胞凋亡中也具有重要意義［1-3］。γδt細胞是體內的固有免疫t細胞，它廣泛分布于消化系統和呼吸系統上皮組織內；γδt細胞除了有與αβt細胞類似的一些功能特征外，識別抗原不需要mhc分子提呈，直接識別蛋白質和肽類抗原以及非肽類抗原，有抗原提呈作用，能通過細胞接觸和分泌的細胞因子起免疫調節作用［4］。γδt細胞和茶多酚均具有抗消化道腫瘤作用，為了解兩者有無相關性，我們用茶多酚誘導人γδt細胞和人結腸癌細胞株，觀察在體外用不同濃度的茶多酚經不同時間誘導的sw?480細胞死亡和凋亡情況，并觀察γδt細胞對sw?480殺傷活性的作用，現報告如下。
1 材料和方法
1.1 材 料
茶多酚，從市售龍井茶中制備，茶多酚純度為77.0％； sw?480細胞株（上海細胞生物研究所）；胰蛋白酶、rpmi1640（gibco公司產品）；人ab血清（徐州市血站）；胎牛血清和淋巴細胞分離液（中國科學院血液病研究所）；異戊烯焦磷酸、四甲基偶唑藍(mtt)(isopentenylpgrophosphate，ipp)、二甲亞砜(dms0)（sigma公司）；il2（廈門特寶生物公司）；抗人tcrγδfitc購自杭州聯科生物（immunotech, france）；seac全自動酶免系列分析儀(北京希亞克技術有限公司)；流式細胞儀(美國bd公司的facscaliar)，分析軟件為cellquest，每個標本分析細胞數≥1×104。
1.2 方 法
1.2.1 γδt細胞的培養和鑒定 按文獻［5］方法取健康獻血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴細胞分離液上，以2 000 r/min離心15 min，吸取單個核細胞層，用生理鹽水洗滌3遍（1 500 r/min離心，10 min/次），加入含10%小牛血清、5%人ab血清和ipp 3 mg/l的rpmi1640培養液中，調整細胞數為1×108/l，置75 cm2細胞培養瓶中，于37℃,50 ml/l co2培養箱中培養，根據細胞生長情況及時添加培養液。收集培養10 d的細胞進行細胞表面標志檢測和其他試驗。
1.2.2 茶多酚對sw?480和γδt細胞生長的影響 取培養10 d的γδt細胞和對數生長期sw?480細胞以每孔5×104個細胞分別接種于96孔板，用茶多酚(終濃度分別為100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)誘導，每組設5個復孔，細胞經茶多酚誘導4 h后棄誘導液加入含10%小牛血清的rpmi 1640，繼續培養24 h后加入mtt（5 mg/ml）20 μl/孔，繼續培養4 h，棄上清，加入dmso 150 μl/孔?；靹蚝笤谌詣用笜碎喿x儀上測各孔d值，根據測定數換算成抑制率。
1.2.3 γδt細胞和sw?480細胞凋亡檢測 取培養10 d的γδt細胞和對數生長期sw?480細胞以每孔2×105個細胞接種于6孔板，用茶多酚(終濃度分別為100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)誘導，每組設3個復孔。細胞經茶多酚誘導4 h后棄誘導液繼續培養24 h，棄上清，sw?480細胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞，γδt細胞直接收集，用rpmi 1640培養液洗滌3遍，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。pbs洗滌3次，加入pi染液(生理鹽水 129.6 ml，pi 10 mg，rna酶2 mg，tritonx?100 1 ml，枸櫞酸鈉200 mg，加雙蒸水至200 ml)，4℃避光染色30 min，用fcm檢測，記錄激發波長488 nm處的紅色熒光。
1.2.4 γδt細胞殺傷活性檢測 取培養10 d的γδt細胞和對數生長期sw?480細胞均配成2×108/l，加入6孔細胞培養板中，每孔3 ml，培養24 h后加入不同濃度的茶多酚，同時設未加藥的對照組，繼續孵育24 h后，sw?480細胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞和直接收集γδt細胞，用rpmi?1640培養液洗滌3遍，將靶細胞sw?480細胞配成2×108/l，效應細胞γδt細胞配成2×109/l的懸液，用本室建立的乳酸脫氫酶釋放法［6］測定γδt細胞殺傷活性，將效靶細胞數按10∶1比例混合，以500 r/ min離心5 min，置37℃,50 ml /l co2培養箱中孵育6 h后，輕輕混勻細胞，再以1 500 r/min離心10 min。收集上清液在全自動生化分析儀（olympus au1000）340 nm波長下測定光密度值d）。
殺傷活性=實驗組d值-效應細胞自然釋放組d值靶細胞最大釋放組d值-靶細胞自然釋放組d值×100%
1.3 統計學處理
采用stata8.0軟件，數據以±s表示，用χ2檢驗比較γδt細胞和sw?480細胞凋亡率有無統計學意義。
2 結果
2.1 γδt細胞形態學觀察和純度鑒定
pbmc在γδt細胞培養基中培養24 h即可見貼壁生長，48 h后集落開始變大，培養10 d可見大的集落和單個貼壁生長細胞，單個細胞可見細胞呈條梭狀，也有小量呈浮懸生長細胞。收集培養前后細胞進行mab熒光標記后經流式細胞術檢測并分析結果。見圖1，培養前γδt細胞數為4.21%；培養10 d時γδt細胞數為70.35%。
圖1 pbmc 培養前后γδt細胞百分率表達（略）
fig 1 percentage of γδt cell and expression before and after cultured by pbmc
2.2 不同濃度茶多酚誘導后的γδt細胞和sw?480細胞凋亡率
結果顯示，經茶多酚誘導4 h棄誘導液繼續培養24 h后，茶多酚濃度在350 mg/l時引起γδt細胞凋亡率為7.88%，顯著低于sw?480細胞（24.76%），見圖2。其他濃度均有明顯差異（表1）。
圖2 茶多酚在350 mg/l時誘導的γδt細胞和sw?480細胞株凋亡率（略）
fig 2 figure of apoptosis of γδt cell and sw?480 cell lines which were induced by tea polyphenols(350 mg/l)
表1 不同濃度的茶多酚對γδt細胞和sw?480細胞凋亡的影響（略）
tab 1 effect of various concentration tea polyphenols on the apoptosis of γδt cell and sw?480
a：與同一藥物濃度作用的γδt細胞比較， p<0.05；b：與同一細胞的對照組比較， p<0.05
2.3 茶多酚對γδt細胞和sw?480細胞株殺傷活性的影響
在實驗中發現經茶多酚作用4 h時γδt細胞殺傷活性最高，因此本實驗選擇該時間為作用時間。γδt細胞經茶多酚(350 mg/l)作用后，殺傷sw?480細胞活性顯著高于其他濃度組，與對照組和其他濃度組相比較，p<0.01。結果見圖3。
圖3 茶多酚對γδt細胞殺傷活性的影響（略）
fig 3 effect of cyctotoxic activity of γδt cell
2.4 茶多酚對γδt細胞和sw?480細胞的抑制率
見圖4。茶多酚濃度在400 mg/l之內對兩者均沒有明顯的影響，隨著濃度升高γδt細胞組死亡率顯著高于sw?480組，p<0.01，而sw?480變化不明顯。
圖4 不同濃度茶多酚對γδt細胞和sw?480的抑制率（略）
fig 4 effect of various concentration tea polyphenols on the inhibitory tatio of γδt cell and sw?480
3 討論
茶多酚是茶葉中的主要成分，約占茶葉干重30％，具有防癌和誘導腫瘤細胞凋亡作用。但其誘導不同的腫瘤細胞凋亡結果卻不相同，可能與其調控某些腫瘤細胞的致癌基因／抑癌基因的表達以及其他機理有關，如對c?fos和c?myc基因的調控上的差異，致使其對癌細胞生長抑制和誘導凋亡上有所不同。其防癌作用主要是通過抗氧化和消除自由基，抑制亞硝基形成反應，調節致癌原代謝酶等［4］。直接抗癌作用的研究近年來也有重大進展，許多體外試驗表明，茶多酚能抑制多種腫瘤細胞包括肺癌、腎癌、結腸癌、乳腺癌、上皮細胞癌和黑色素瘤等的生長［7-9］，甚至直接殺傷這些腫瘤細胞。
自1990年從肺癌腫瘤浸潤淋巴細胞（tils）中分離出γδτ細胞，并發現這些細胞對新鮮的自體腫瘤細胞和k562細胞有高效殺傷活性以來，許多研究證實了在直腸癌、腎癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等實體瘤的til中存在有γδτs細胞，并具有抗腫瘤作用［10-13］。
γδτ細胞殺傷腫瘤細胞的機制與ctl細胞和nk細胞相似，主要通過穿孔素、顆粒酶和fas/fasl途徑起作用。然而γδτ細胞對腫瘤細胞的識別方式還不完全清楚，通常γδτ細胞對腫瘤細胞的識別大多數是mhc非限制性的，主要是通過nkg2d識別腫瘤細胞表達的mica,micb,ulbpi?3,mhcⅰb類蛋白和f1?atp合酶等配體。corvaisier等［14］研究也證實，對腫瘤細胞的識別還與腫瘤細胞上γδtcr刺激物（如甲羥戊酸途徑代謝物?ipp）產生和icam?1表達密切相關。我們的實驗也表明，從人外周血分離培養出的γδτ細胞對消化道系統常見腫瘤細胞均有較強的殺傷作用。zheng等［15］給已建立的鼻咽癌裸鼠注射正常人γδτ細胞兩次，每次5×107，可見腫瘤明顯縮小和生存期延長，且與注射次數相關，免疫組化結果證實腫瘤內有局部壞死，注射的γδτ細胞在瘤內聚積。戴夢華等［16］用人胰腺癌外周血經抗人tcrγδτ單抗包被擴增的γδτ細胞注入已建立胰腺癌的裸鼠腹腔內，發現γδτ細胞具有顯著的抑瘤作用。朱憶期等［17］用自身外周血培養的γδτ細胞治療4例胃癌術后患者，隨訪10～25個月未見復發。γδτ細胞體內應用除直接殺傷腫瘤細胞外，還可以通過與nk細胞和dc相互作用以及釋放出抗腫瘤免疫中的關鍵分子ifn?γ來啟動抗腫瘤免疫細胞網絡來實現持續的抗腫瘤免疫應答［18,19］。為了解茶多酚與人γδt細胞的關系，我們應用茶多酚誘導人γδt細胞和sw?480細胞株，發現經誘導的γδt細胞對腫瘤細胞的殺傷活性明顯增高，含量在350 mg/l時增高最為顯著，與對照組和其他濃度組比較均有顯著性差異，當茶多酚濃度＜50 mg/l和＞500 mg/l時作用明顯降低。這一結果說明茶多酚對人γδt細胞的用量有一個最適濃度或“濃度窗”(concentration window)現象，這一點在設計實驗和臨床應用時要加以注意。
本組實驗結果提示，茶多酚在一定濃度和條件下能誘導sw?480細胞死亡和凋亡。我們用各種濃度的茶多酚在持續作用sw?480細胞實驗中，作用時間達48 h，茶多酚的濃度增加至3 200 mg/l時均不能明顯誘導出sw?480細胞死亡和凋亡，此時對照組（γδt細胞）死亡率明顯增加；而作用1～8 h后再繼續培養24 h即能明顯致sw?480細胞死亡和凋亡。可能原因是，茶多酚影響了腫瘤細胞的生長周期，使腫瘤細胞生長阻滯在g0／g1［20］，當除去誘導劑后，細胞開始增殖，受損的細胞逐漸死亡。另外，由于茶多酚中混有多種成分，可能有的成分能誘導sw?480細胞死亡或有凋亡的信號，而有的成分能阻斷其作用，待將茶多酚成分洗棄后，這些死亡或凋亡信號繼續作用而致細胞死亡和凋亡。因此要搞清其機理，有必要篩選出茶多酚粗提物中的確切有效成分。
以上結果表明，茶多酚可以誘導sw?480細胞死亡和凋亡,茶多酚持續作用不如短時作用后棄誘導液繼續培養24 h對sw?480細胞致死和凋亡作用明顯。γδt細胞經茶多酚作用4 h后能明顯提高其對sw?480細胞的殺傷活性，提示茶多酚對消化系統大量存在的γδt細胞殺傷腫瘤細胞功能有增強作用。然而茶多酚誘導腫瘤細胞死亡、凋亡和提高γδt細胞殺傷性機理仍不十分清楚。是否與其抑制sw?480細胞多聚酶作用［21］和誘導其凋亡有關還是其他因素致使γδt細胞對sw?480細胞殺傷易感性增加所致仍有待研究。因此，開展這方面研究對茶多酚藥用價值的開發和臨床應用具有重要意義。
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