二十碳五烯酸對人肝癌HepG2凋亡細胞線粒體的影響

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【關鍵詞】二十碳五烯酸；HepG2細胞；細胞凋亡；線粒體

EffectsofeicosapentaenoicacidonapoptosisandmitochondriainHepG2cells

【Abstract】AIM:ToinvestigatethemitochondriachangesinhumanhepatoblastomaG2（HepG2）cellapoptosisinducedbyeicosapentaenoicacid(EPA).METHODS:IntheHepG2cellsincubatedwithEPAinvitro，cellapoptosiswasdetectedbyDNALadder,thechangesofmitochondriafunctionandquantityweredeterminedwithmethylthiazolyltetrazolium（MTT）colorimetricassayandfluorescenceprobe.TheexpressionandactivityofCaspase9weremeasuredinHepG2cellapoptosiswithWesternblottingandspecialsubstrate.RESULTS:Twentyfourhoursafterexposureto120μmol/LEPA，HepG2cellsdisplayedtheapoptosisbytheDNAladderpattern;thenumberofthemitochondriawasdecreased;theAvaluebytheMTTtestwas0.173±0.065,whichindicatedthatthefunctionofmitochondriawassignificantlydeclined(P<0.01);comparedwiththeuntreatedHepG2cells,theexpressionofCaspase9wasupregulatedandtheactivityofCaspase9wasincreasedto75.4±4.8inHepG2cellstreatedwithEPA(P<0.01).CONCLUSION:ThechangesofmitochondriamayplayagreatroleintheHepG2cellapoptosisinducedbyEPA.

【Keywords】eicosapentaenoicacid;HepG2cells;apoptosis;mitochondria

【摘要】目的：探討二十碳五烯酸（EPA）誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及其對線粒體的影響.方法：HepG2細胞與經EPA處理后，DNALadder檢測細胞凋亡的發生，應用線粒體熒光探針和四唑鹽（MTT）比色法分析細胞線粒體數量和功能，應用免疫印跡法和特異性底物檢測HepG2細胞Caspase9蛋白酶的表達和活性.結果：終濃度為120μmol/LEPA處理HepG2細胞24h后，可以檢測到凋亡標志性的DNA梯形帶；細胞線粒體數量減少，MTT比色法檢測A值為0.173±0.065（P<0.01），提示線粒體功能降低；線粒體相關凋亡級聯反應的啟動分子Caspase9蛋白表達增加，Caspase9酶活性增強至75.4±4.8，與未經EPA處理HepG2細胞相比差異有統計學意義（P<0.01）.結論：EPA可能通過損傷線粒體誘導人肝癌HepG2細胞凋亡.

【關鍵詞】二十碳五烯酸；HepG2細胞；細胞凋亡；線粒體

二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid,EPA）屬于n3多不飽和脂肪酸（n3polyunsaturatedfattyacid，n3PUFA），主要存在于深海魚油中，是一類對人體有益的重要營養素.近來的研究表明n3PUFA可以抑制腫瘤細胞增殖，具有一定的抗瘤功效［1］，其中誘導腫瘤細胞凋亡可能是主要機制之一［2］.有研究發現，EPA可以通過p53依賴，Fas介導途徑誘導人肝癌hepg2細胞凋亡［3］.我們采用DNA梯形帶檢測,MTT比色法和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測等方法，通過觀察EPA對體外培養的HepG2細胞凋亡和線粒體的影響，初步探討線粒體損傷在EPA誘導HepG2細胞凋亡過程中所發揮的作用，為進一步研究n3PUFA在抗腫瘤方面的功效提供一定的理論基礎.

1材料和方法

1.1材料人肝癌HepG2細胞購自中國科學院上海生化與細胞所；DMEM培養基購自美國Gibco公司；EPA，四唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；線粒體熒光探針MitoTrackerRed購自美國MolecularProbe公司；小鼠抗人Caspase9mAb為美國NeoMarker公司產品；Caspase9蛋白酶特異性底物AcLEHDAMC為美國Alexis公司產品.

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組HepG2細胞常規培養于含有10mL/L小牛血清的DMEM培養液.試驗分為：處理組HepG2細胞于對數生長期應用EPA（終濃度為120μmol/L培養液）處理24h后收獲；對照組采用正常培養未經EPA處理的HepG2細胞.

1.2.2DNA梯形帶法檢測細胞凋亡細胞經處理后收獲約1×106個細胞，PBS洗滌細胞2次，加150μLNP40裂解液裂解細胞5h，離心收集上清，150μLNP40細胞裂解液重復抽提沉淀1次，將上清置于等體積10g/LSDS溶液中并混勻，加入RNaseA（終濃度為2μg/mL），56℃孵育2h，加蛋白酶K至終濃度為2μg/mL，37℃水浴2h，加1/2體積的10mol/L醋酸銨和2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃過夜，4℃高速離心30s，棄上清，750mL/L冰冷乙醇漂洗沉淀，20μLTE緩沖液溶解DNA，取5μLDNA進行20g/L瓊脂糖凝膠電泳.

1.2.3激光共聚焦顯微鏡檢測細胞線粒體HepG2細胞制成細胞爬片，處理組細胞經終濃度為120μmol/L的EPA處理24h后收獲.兩組細胞用無血清培養液沖洗1次，加入線粒體探針MitoTrackerRed（無血清培養基1∶5000稀釋）37℃孵育40min，無血清培養液沖洗3次，應用激光共聚焦顯微鏡，綠色激發光激發下觀察并照相.

1.2.4MTT比色法檢測線粒體功能［4］HepG2細胞傳代后培養于6孔板中，每孔5.0×106個細胞，每組設3個復孔.兩組細胞用不含血清的培養液清洗，每孔加入100μLMTT（5g/L濃度溶解于PBS中），37℃孵育1h，棄上清液，每孔加入3mL細胞裂解液，570nm處測量A值.兩組以相同方法重復檢測3次.

1.2.5免疫印跡法檢測Caspase9蛋白表達收獲處理組和對照組細胞約1×107個，加入100μL冰預冷的NP40細胞裂解液（50mmol/L,pH8.0Tris・Cl,150mmol/LNaCl，25mmol/LNaF，5mmol/LNa4P2O7-，1g/LSDS，1mmol/LPMSF，10μg/mLAprotinin，10μg/mLLeupeptin，10g/LNP40）冰上靜置裂解30min，4℃,12000g離心15min，收集上清，Brodford法測定蛋白含量.取20μg蛋白，用細胞裂解液稀釋至20μL，加20μL2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5～10min，100g/LSDSPAGE電泳，電轉移至PVDF膜，10g/LBSA室溫封閉1h，然后加入小鼠抗人Caspase9mAb（1∶100稀釋）37℃孵育1h，使用羊抗鼠SP試劑盒反應，DAB顯色.

1.2.6Caspase9活性檢測［5］兩組均收獲約1×106個細胞，PBS洗滌2次，離心棄上清，加入500μL細胞裂解緩沖液（10mmol/L,pH7.5Tris，30mmol/LNaCl，10mmol/LNaF，10mmol/LNaPi，10mol/LNaPPi，10mL/LTrionX100）輕柔重懸細胞沉淀后立即放入液氮中速凍，然后置于-80℃凍存備用.進行活性分析時，細胞沉淀懸液融化后輕微混勻，18000g，4℃離心12min，取上清以Brodford法進行蛋白定量（讀取A595nm值）.取100μL蛋白提取液，加入1.9mL反應緩沖液（20mmol/L,pH7.4HepesKOH，100mL/L甘油，20mmol/LDTT，20μmol/LAcLEHDAMC），混勻，37℃避光孵育30～60min，用熒光分光光度計在狹縫2，激發光380nm，發射光460nm條件下測量A460nm值.兩組以相同方法重復檢測3次.酶活性以A460nm／A595nm表示.

統計學處理：數據以x±s表示，采用SPSS11.0統計軟件進行t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義.

2結果

2.1EPA誘導HepG2細胞凋亡的檢測DNA梯形帶檢測結果顯示HepG2細胞染色質DNA裂解成180～200bp和不同倍數的片段，在瓊脂糖凝膠電泳顯示出凋亡細胞特有梯形帶（圖1）.

2.2EPA對HepG2細胞線粒體數量的影響線粒體熒光探針可以特異性標記細胞線粒體，在綠色激發光激發下發出紅色熒光.激光共聚焦顯微鏡下可見未經EPA處理的HepG2細胞生長狀態良好，紅色熒光明亮，均勻分布于胞質區.經120μmol/LEPA處理24h后，HepG2細胞生長稀疏，形態趨于圓形，熒光強度明顯減弱，提示細胞線粒體數量明顯減少（圖2）.

2.3EPA對HepG2細胞線粒體功能的影響研究結果顯示，未經EPA處理的HepG2細胞測得A570nm值為0.470±0.023，經120μmol/LEPA處理24h后測得HepG2細胞A570nm值為0.173±0.065，差異具有統計學意義（P<0.01）.

2.4EPA對HepG2細胞Caspase9蛋白酶表達和活性的影響免疫印跡檢測結果顯示Caspase9蛋白表達增加.以特異性熒光底物分析Caspase9蛋白酶活性，結果表明，未經EPA處理的HepG2細胞Caspase9活性為32.7±3.6，經EPA處理24h后細胞Caspase9活性達到75.4±4.8，差異具有統計學意義（P<0.01，圖3）.

3討論

作為一種人體需要的重要營養素，n3PUFA的抗瘤功能逐漸受到關注.研究發現n3PUFA可以誘導腫瘤細胞凋亡［6］，而我們使用EPA處理肝癌HepG2細胞后可以檢測到凋亡標志性的DNA梯形帶，說明EPA也可以在體外誘導肝癌HepG2細胞凋亡的發生.

線粒體是參與細胞凋亡的關鍵因素，目前的觀點認為線粒體既是細胞凋亡的啟動者，又是凋亡信號的放大者.凋亡過程中一個重要的特征就是線粒體膜功能的改變即線粒體的通透性改變，這是調節凋亡的中心環節.凋亡誘導因素可以誘導MPT開放，導致線粒體跨膜電位(△ψm)下降或消失，隨后呼吸鏈脫耦聯，造成線粒體自身損傷，產生活性氧類及向胞質釋放多種蛋白酶活化物，包括凋亡誘導因子（apoptosisinducingfactor,AIF）,細胞色素C(CytC)和凋亡蛋白酶激活因子1（apoptosisproteaseactivatingfactor1,Apaf1）等.AIF可以直接進入細胞核，導致染色體濃縮、斷裂［7］.而Caspase9蛋白酶是線粒體依賴Caspase級聯反應的啟動分子，與線粒體釋放的CytC和Apaf1結合形成凋亡復合體后被激活，活化的Caspase9可以進一步裂解活化下游Caspase蛋白酶，啟動Caspase級聯反應，進一步誘導細胞凋亡的發生.國外曾報道在n3脂肪酸誘導人白血病HL60細胞凋亡過程中，線粒體去極化和上調半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的表達和/或活性可能與此過程密切相關［8］.

我們的試驗結果表明，HepG2細胞經EPA處理后，細胞生長減緩，死亡細胞增多，同時可以觀察到細胞線粒體數目明顯減少，應用MTT比色法檢測細胞線粒體功能，發現在EPA作用下HepG2細胞線粒體功能顯著降低.對細胞Caspase9蛋白酶的檢測結果表明，在EPA作用下HepG2細胞Caspase9蛋白酶表達增加，活性增強.由此我們認為在誘導HepG2細胞凋亡的過程中，EPA對細胞線粒體結構和功能的影響可能發揮了重要作用，其中線粒體依賴的Caspase級聯反應可能是凋亡事件的重要組成部分.此外，有報道EPA可以通過促進線粒體生成過氧化物，釋放AIF1，通過不依賴Caspase的途徑誘導鼠白血病RBL2H3細胞凋亡［9］，但在EPA誘導HepG2細胞凋亡過程中是否存在相同機制還有待進一步研究.

【參考文獻】

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