瘤細胞庫建立應用管理論文

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摘要目的：為了對流感病毒甲型和乙型、副流感病毒1、2和3型、呼吸道合胞病毒及腺病毒3、7型主要呼吸道病毒進行快診。方法：從1986到1997年應用雜交瘤單抗技術，制備出以上4類8種抗病毒單抗細胞庫，連同用于連接物的抗堿性磷酸酶單抗細胞株，共有117株單抗細胞株。將以上4類8種病毒單抗連接抗堿性磷酸酶單抗復合物，以兔抗鼠搭橋進行APAAP橋聯快速診斷。結果：獲得滿意結果，此技術結果清晰，無內源性酶干擾，只需1臺普通光學顯微鏡，2～3h可獲得準確結果。本系列快速診斷試劑已獲得國家4項新藥證書及5項生產文號。結論：此抗主要呼吸道病毒單抗細胞庫，不僅可提供快診試劑，也可提供病毒亞型分析、病毒變異以及基因表達研究試劑。

關鍵詞主要呼吸道病毒單克隆抗體雜交瘤細胞庫

Establishmentandclinicalapplicationofthehybridomacellbankofmonoclonalantibodiesagainst8typesofmainrespiratoryviruses

DUANPei-Ruo,ZHANGLi-Li,HANHong-Yanetal.

DepartmentofClinicalExperiment,No.262HospitalofPLA,Beijing100088

AbstractObjective:The8types,4kindsofmainrespiratoryviruseswhichcausehumanrespiratorydiseases,includeinfluenza-A、B,parainfluenzavirus1、2、3,respiratorysyncytialvirusandadenovirus-3、7.Methods:Haddevelopedakittorapidlydiagnosethesevirusesfrom1986to1997.Bythetechniqueofhybridoma,hadprepared117hybridomacellstrainssecretingMcAbsofthese8types,4kindsofvirusesandofalkalinephosphatase.TheMcAbsformajunctionalcomplexplusalkalinephosphataseanti-alkalinephosphatase(APAAP)bridgedrapiddiagnosis.Results：Theresultofthekitiscredible,andnodisturbanceofPendogenousenzyme.Performingthediagnosis,onlyneedageneralopticalmicroscopeandcanfinishin2or3h.Thehybridomacellbankcanprovidenotonlythereagentsoftherapiddiagnosis,butalsothereagentsforanalysisofvirussubgroups,virusvariationandgeneexpression.Conclusion:Theserialreagentsoftherapiddiagnosishavebeengranted4newdrugcertificatesand5productioncertificatesbytheministryofHealthDepartmentofNationalHealth.

KeywordsMainrespiratoryvirusesMonoclonalantibodyHybridomacellbank

國內外專著指出：對人類，尤其是嬰幼兒，威脅最大的為流感病毒甲（Influenza-A,FluA）和乙型（Influenza-B,FluB）、副流感病毒1、2和3型（Parainfluenzavirus1、2、3,PIV1、2、3）、呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus,RSV）及腺病毒3、7型（Adenovirus-3、7,Adv3、7），急性呼吸道病毒的實驗診斷應首先考慮以上這4類8種病毒［1，2］。從1986～1997年應用淋巴細胞雜交瘤生物技術，完成了以上4類8種病毒單克隆抗體（Monoclonalantibody，McAb）雜交瘤細胞系的制備以及快速診斷橋聯試劑、抗堿性磷酸酶單克隆抗體雜交瘤細胞系的制備工作，共9大系117株單抗細胞株。此報道如下。

1材料與方法

1.1第一抗體即4類8種抗病毒單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立

1.1.1病毒抗原來源均嚴格采用標準品。流感病毒甲型和乙型毒株購于首都病毒研究所流感中心［3，4］，副流感病毒1、2、3型毒株購于美國馬里蘭州ATCC國際毒株庫［5-7］，呼吸道合胞病毒long株由友誼醫院病毒室提供［8］，腺病毒3、7型毒株由預防醫學科學院病毒研究所毒株庫提供［9］。

1.1.2動物免疫病毒采用Balb/c小鼠易感系統加脾攻擊方法進行［3-9］，堿性磷酸酶采用皮內半佐劑加靜脈免疫［10］。

1.1.3細胞融合按文獻［1］常規法進行。

1.1.4陽性孔檢測用IFA熒光法以及間接反向ELISA。

1.1.5細胞株的鑒定所有的細胞株要求經3次以上亞克隆，3次反復凍存，3個月的37℃環境下傳代，對52株單抗做Ig亞型分析，染色體分析，每株均要求作阻斷、替代、交叉、封閉以及穩定性6種特異性鑒定［3-10］。

1.2第二抗體即兔抗鼠的制備按文獻［1］進行。

1.3第三抗體即抗堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AP）單克隆抗體細胞系及其復合物（APAAP）的制備動物免疫用的抗原系美國Promege公司產的精酶，采用反向間接ELISA檢測技術獲得抗堿性磷酸酶單克隆抗體細胞系，然后選擇單抗最適濃度結合抗原，制成APAAP復合物［11］。

1.4快速診斷兩種技術

1.4.1將8種抗呼吸道病毒單抗用于橋聯（APAAP)

快速診斷技術。

1.4.2將8種抗呼吸道病毒單抗用于間接熒光（IFA）快速診斷技術［7-9，12］。

1.5臨床應用方法

1.5.1研究者的臨床應用見文獻［6-9，11，13］。

1.5.2協作者的臨床驗證見文獻［14-16］。

1.5.3國外產品應用WHO標準品驗證［6-9］。

2結果

2.18大系單抗細胞庫的建立和鑒定結果

2.1.1建立起一個比較完整的抗主要呼吸道病毒單抗雜交瘤細胞庫1986～1997年共獲8大系108株單抗細胞株：抗甲型流感11株；抗乙型流感6株；抗腺病毒3型14株；抗腺病毒7型7株；抗副流感1型18株；抗副流感2型5株；抗副流感3型22株；抗合胞病毒25株。以上8大系單抗雜交瘤細胞系的建立見文獻［3-11］。

2.1.2系列單克隆抗體Ig亞型和效價分析見表1。

2.1.3系列單抗的效價測定用于臨床快速診斷的以上52株單抗，平均結合病毒效價為8000～32000(+++，熒光法)，其連接物堿性磷酸酶單抗效價

表18種主要呼吸道病毒單克隆抗體Ig亞型分析

Tab.1AnalysisofIgsubtypesofMcAbsagainst8typesofmainrespiratoryviruses

McAbsNumber1)Igsubtypes

IgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM

FluA11623

FluB5113

PIV16411

PIV25212

PIV3624

RSV871

Adv7532

Adv333

AP33

Total5215161218

Note:1)allofthe52cell-linesselectedwereusedfortherapiddiagnosis達2000萬（+++，反向間接ELISA），證實9大系列單抗均具有高度的敏感性和親和力，效價要高出動物抗血清20～600倍，且無抗細胞抗體混雜。

2.1.4單抗的特異性鑒定結果交叉試驗：各株單抗分別與常見的9～12種呼吸道病毒抗原和相關病毒（腮腺炎病毒、麻疹病毒等）作交叉試驗，結果無交叉反應。阻斷試驗：各株單抗分別以異種動物抗血清作阻斷，血清在1：2～1：8時，系列單抗被特異阻斷。替代試驗：以1%小鼠血清替代系列單抗作已知陽性標本，均為陰性。免疫印跡反應（Westernblot）、結合表位鑒定：合胞病毒（8株）、副流感1、2、3型（16株）、腺病毒3、7型（8株），抗原經還原處理后，單抗能清晰地與對應病毒蛋白的表位結合［14］。單抗的純化和冰干：經鹽析用DEAE-52離子交換層析后，比活性達95.2U/mg以上。將各株單抗按8個單位應用效價稀釋后按8種抗病毒抗體分別混合組成診斷試劑，制成冰干品。

2.2兔抗鼠（二抗）及兔抗鼠熒光標記免疫效價為1：32（+++，雙擴法），兔抗鼠以熒光標記純化，應用效價為1：10稀釋。

2.3堿性磷酸酶單抗及復合物結果共獲單抗細胞株9株，單抗在16000U/ml時結合堿性磷酸酶抗原4U，成為APAAP復合物。

2.4系列呼吸道病毒單抗用于橋聯快速診斷的質量指標結果見表2。表2系國外快速診斷試劑和病毒分離、雙份血清、WHO-McAb標準品和IFA技術對照所得。以上結果證實系列單抗用于橋聯快速診斷的各項指標符合生物試劑標準。

表2系列呼吸道病毒單抗用于快速診斷的質量指標

Tab.2ThequalityresultsofseriesofMcAbsusedintherapiddiagnosis

IndicatorViruses

FluPIVAdvRSV

Sensitivity(%)93.30100.0090.0093.50

Specificity(%)100.0099.0099.40100.00

Pseudo-positiveratio(%)01.000.580

Pseudo-negativeratio(%)6.70010.006.20

Positivepredictionvalue(%)93.70100.0090.0090.00

Negativepredictionvalue(%)100.0096.0098.40100.00

Grossuniformity(%)92.3099.0098.8096.00

Adjusteduniformity(%)92.3598.0094.5095.70

Youdenindex0.8900.9900.8970.930

2.5系列呼吸道病毒單抗用于橋聯快速診斷試劑申請的國家新藥證書和文號從1991～1994年經申請和審批，共獲4項新藥證書和5項生產文號，它們是合胞病毒，(93)衛藥證字S-05號，(93)衛藥準字(京星)S-02號；副流感1、3型，(94)衛藥證字S-21號，(94)衛藥準字(京星)S-01號；副流感2型，(94)衛藥證字S-25號，(94)衛藥準字(京星)S-03號；腺病毒3、7型，(94)衛藥證字S-22號，(94)衛藥準字(京星)S-02號；流感A和B型，(94)衛藥準字(京星)S-01號。

3討論

急性病毒性呼吸道感染是人類最常見的傳染病，尤其是軍營、學校、幼兒園等人群聚集的地方，常在流行期呈幾十人甚至幾百人發病，人們往往很難弄清病毒病因。本研究用10年時間建立起比較完整的抗主要呼吸道病毒單抗雜交瘤細胞庫，連同連接物堿性磷酸酶單抗雜交瘤細胞株，此庫共有9大系117株細胞株，其中抗副流感1、2、3型和抗呼吸道合胞病毒G蛋白單抗等70株為國內少見報道的細胞株。該庫的建立，不僅可不間斷地提供8種主要呼吸道病毒快速診斷試劑［14-17］，還可為國內主要呼吸道病毒的亞型分析、病毒變異以及基因表達等提供研究試劑［18，19］。

本研究創立的抗主要呼吸道病毒橋聯診斷試劑，克服了內源酶對結果的干擾，只需1臺普通顯微鏡即可觀察細胞內病毒抗原存在，其結果清晰快速，2～3h可獲得準確診斷結果［11，13，15，16］。我國是世界公認流感病毒大流行株及變異株發源地，此試劑有較大的實用價值，本研究者曾3次在6h內快速報道流感疫情［20，21］。系列診斷試劑經國家生物制品鑒定所嚴格鑒定和審查，已獲4項國家新藥證書，5項生產批準文號，它們是國內首次按“藥品管理法”審批程序批準的系列呼吸道病毒單抗橋聯快速診斷試劑。

作者簡介：段佩若，女，62歲，主任技師，主要從事醫學呼吸道病毒學研究

作者單位：(解放軍第262醫院醫學實驗科，北京100088)

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