大腸桿菌抗體制備研究論文

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摘要目的：為了制備nNOS特異性抗體。方法：用PCR的方法克隆出nNOS708～881aa片段的編碼基因并將之插入pET28a原核表達載體。結果：成功地在大腸桿菌中獲得高效表達。經HisTag-Sepharose和電泳回收法得到純蛋白，將此蛋白免疫兔，制備出nNOS特異性抗體，抗體效價可達1∶8000。利用該抗體成功地檢測了正常肌肉和DMD肌肉中nNOS的含量變化，證實DMD肌肉中nNOS的含量明顯低于正常肌肉。結論：制備的抗體具有較高的特異性，對nNOS的免疫檢測具有重要應用價值。

關鍵詞nNOS特異性抗體重組表達肌肉

RecombinantexpressionofnNOSfragmentinE.coliandpreparationofspecificantibodyagainstnNOS

CHENQiang,ZHUMin-Sheng,SHENYueetal.

NanjingMilitaryInstituteofMedicalScience,Nanjing210002

AbstractObjective：TopreparethespecificantibodyagainstnNOS.Methods：Clonedagenefragmentcoding708to881aaofnNOSwithPCRandinsertedthefragmentintoapET28aexpressionvector.Results:RecombinantproteinwasexpressedeffectivelyinE.coliandpurifiedwithHisTag-Sepharoseandelectrophoresis.Usingthepureproteinasantigen,immunizedrabbitsandobtainedhighspecificandhightiter(1∶8000)antibodyagainstnNOS.WesternblotassayshowedthatnNOSexpressedinnormalskeletalmuscleismuchhigherthanthatinDMDskeletalmuscle.Conclusion:Theanti-nNOSantibodywithagoodspecificitywaspreparedandtheantibodywasusefulforimmunologicaldetecteionofnNOS

KeywordsnNOSSpecificantibodyRecombinantexpressionSkeletalmuscle

一氧化氮合酶(NOS)有3種同工酶，即誘生型(iNOS)、內皮細胞型(eNOS)和腦型(nNOS)，它們均以L-精氨酸(L-Arg)為底物，在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等輔助因子的作用下生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO)［1，2］。nNOS主要分布于小腦、骨骼肌、外周氮能神經、交感神經、腎上腺、脊髓的某些區域等部位。nNOS的表達異常與某些疾病密切相關，如神經、肌肉疾病等［3，4］。在nNOS的研究中，特異性抗體是非常重要的研究工具，由于nNOS與其他NOS之間存在有較高的同源性，且分子量較大(160kD)，這就給nNOS抗體的制備帶來較大困難。目前國外采用多肽合成的方法成功地制備了nNOS特異性抗體。我們通過基因工程的方法表達了nNOS特異性區域，并制備出了高效價的特異性抗體。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和菌種pCMV/nNOS質粒，內含大鼠nNOS全長cDNA，由美國德克薩斯大學西南醫學中心提供，pET/28a(+)表達載體購自Novegen公司，pGEM/3z質粒購于Promega公司。BL21及JM109宿主菌由本實驗室保存。

1.1.2酶和蛋白質及常用試劑各種限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶等分別購自Boehriger公司、Promega公司、華美生物工程公司。Lambda/Hindlll,pBR322/HinflDNA分子量標準購自Gibco-BRL公司，HisTagTM-Sepharose購自Novegen公司，nNOS抗體(p9203多肽合成法制備的抗體)由美國西南醫學中心提供，常用化學劑主要為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1PCR擴增及基因重組技術參考文獻［5］。

1.2.2重組蛋白的純化按Novegen公司的產品說明書進行，經HisTagTM-Sepharose純化的蛋白再用電泳回收法純化，參考文獻［6］。

1.2.3抗體的制備將2～4mg純化蛋白與完全弗氏佐劑混勻，充分乳化，接種至新西蘭大耳兔足蹼，2w后加強免疫1次，1w后追加免疫1次。

1.2.4Westernblot分析參見文獻［4］。在檢測肌肉樣本中的nNOS蛋白時，將新鮮肌肉置于緩沖液A(10mmol/LTrisCl,1mmol/LEDTA/EGTA,0.5mmol/LPMSF)中勻漿，取勻漿液作常規電泳。Duchenne肌營養不良癥(DMD)的肌肉標本由南京市兒童醫院神經內科提供，正常肌肉由江蘇省腫瘤醫院提供，mdx小鼠肌肉樣品(已處理)由美國西南醫學中心提供。

2結果

2.1nNOS(708～881aa)蛋白片段編碼基因的克隆及重組表達質粒的構建用特異性引物1∶5′GG-GATCCATATGTCCTTTGAGTACCTAT-3′和引物2∶5′-CGGAATTCTATCAGAACCTCACTAAGG-3′，以pCMV/nNOS質粒為模板，擴增后得到0.6kb的特異性片段，將擴增片段用EcoRI和NdeI雙酶切，電泳回收后與相同酶酶切的pET28a表達質粒DNA進行連接反應，經篩選得到重組質粒，命名為pET/nNOS180，其質粒圖譜如圖1，用不同限制性內切酶進行酶切圖譜鑒定，結果證實：插入片段中含有一個BglII位點和兩個NcoI位點，與已報道序列完全相符，如圖2。

圖1pET/nNOS180重組質粒圖譜

Fig.1PlasmicmapofpET/nNOS180

圖2pET/nNOS180重組質粒的酶切圖譜

Fig.2RestrictionmapofpET/nNOS180recombinantplasmid

Note:laneM:lambdaDNA/HindIIImarker;laneA:pET/nNOS180(BglⅡ);laneB:pET/nNOS180(NcoI);laneC:pET/nNOS180(EcoRI/NdeI)；laneD:pET/28a(EcoRI/NdeI)

2.2nNOS蛋白片段的表達和純化將重組質粒導入BL21宿主菌后，即得到重組工程菌，經IPTG誘導后，可見明顯的額外表達帶，如圖3，重組蛋白約占菌體蛋白的10%～15%，經SDS-PAGE電泳初測分子量為22.000kD，純蛋白用質量飛行質譜測得分子量為22.364kD，與理論計算值(22.117kD，不考慮蛋白修飾)基本相符。pET28a載體中含有6個連續組氨基酸序列，這樣，重組蛋白即可通過金屬離子螯合的方法進行快速純化。我們用Ni離子螯合的方法一次純化重組蛋白的純度可達90%以上，如圖4。為得到更純的蛋白作免疫抗原，我們又用電泳回收的方法得到純度為100%的純化蛋白(圖譜略)［6］。

2.3nNOS特異性抗體的制備及活性鑒定通過3次免疫后獲得抗血清，用常規間接ELISA法測得在抗體稀釋度分別為：1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000時，OD492nm與空白對照的比值(P/N)分別為9.5、8.5、8.1、5.4、2.6和1.6，抗血清的工作濃度初步可定于1∶8000范圍內。

為了觀察nNOS抗血清與iNOS和eNOS的交叉反應，我們分別用3種NOS的標準品進行SDS-PAGE電泳、轉移和Westernblot分析，結果證實抗血清對iNOS和eNOS無任何交叉反應，如圖5。業已證實，正常橫紋肌中含有大量的nNOS蛋白，而DMD中含量明顯減少［3，4，7］，我們分別用自制抗體(下稱抗血清)和多肽法制備的抗體(P9203)對肌肉標本中的nNOS進行了Westernblot分析。結果表明：抗血清的工作濃度為1∶6000時仍可檢測到小鼠肌肉中的nNOS蛋白，其陽性條帶與P9203的陽性條帶相似(圖未列出)。用1∶6000的抗血清以相同的Westernblot方法證實正常人肌肉中的nNOS含量明顯高于DMD肌肉中的含量，與文獻報道完全一致，如圖6。

圖3nNOS180重組蛋白在大腸桿菌中表達

Fig.3ExpressionofnNOS180inE.coli

Note:laneA:inducedfor0h;laneB:inducedfor1h;laneC:inducedfor2h;laneD:inducedfor3h;laneE:inducedfor4h;laneM:proteinmolecularweightmarker

圖4經HisTag-Sepharose純化nNOS重組蛋白的電泳圖譜

Fig.4ElectropheresisfornNOSrecombinantproteinpurifiedbyHisTag-Sepharose

Note:laneAandB:purifiedprotein;laneM:proteinmolecularweightmarker

圖5nNOS抗血清與iNOS和eNOS的交叉反應測定

Fig.5Crossreactiondetectionforanti-nNOSantiserumwithiNOSandeNOS

Note:lanen:nNOSstandardprotein;lanei:iNOSstandardprotein;lanee:eNOSstandardprotein

圖6nNOS蛋白在DMD肌肉和正常骨骼肌中的表達

Fig.6ExpressionofnNOSproteininDMDandnormalmuscles

Note:laneM:prestainedproteinmolecularweightmarker;lane1:normalmuscles;lane2and3:mdxmousemuscles;lane4and5:DMDmuscles

3討論

我們通過PCR的方法克隆了nNOS708～881aa片段的編碼基因并將之插入pET28a原核表達質粒，成功地在大腸桿菌中進行了高效表達。我們首次以nNOS708～881片段蛋白為抗原，免疫動物后得到高效價和高特異性抗體，采用上述抗體，成功地檢測了正常橫紋肌和DMD肌肉中nNOS的表達情況。

nNOS的N端與其它類型NOS的N端相比，有一段額外序列，就序列特異性講，該段蛋白可作為免疫抗原并得到特異性抗體，但nNOS的N端含有GLGF序列能與龐大的GLGF相關蛋白(GAP)呈緊密結合［8，9］，抗原決定簇易被掩蓋，影響檢測效果。目前國外采用多肽合成的方法，人工合成C端18個氨基酸，以此為抗原制備出特異性抗體。但由于合成肽較小，制備的抗體效價較低(最高為1∶5000)且所含抗原決定簇少，可能會影響檢測的靈敏度。本文實驗證實，選擇nNOS蛋白的中間區域作為免疫抗原即可克服上述缺點，另外，由于nNOS708～881aa位于鈣調蛋白(CaM)結合區和FAD結合區之間，是電子傳遞的重要途徑，我們所制備的抗體還可與之結合后并中和nNOS的酶活性(資料未列出)。

朱東亞中國藥科大學新藥研究中心，南京210005

智剛KimSLauJamesTStullUTSouthwesternMedicalCenteratDallas,TXUSA

作者簡介：陳強，男，24歲，碩士生，主要從事生化藥理學研究；

指導教師，朱敏生，男，34歲，博士生，副研究員，主要從事分子生物學和分子免疫學研究

作者單位：(南京軍區軍事醫學研究所，南京210002)

4參考文獻

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