單鏈噬菌體研究管理論文

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摘要目的：進一步探索重組基因工程抗體在原核系統中有效的活性表達途徑。方法：在已構建的抗HBx單鏈抗體(ScFv)的基礎上，利用粘粒載體構建了抗HBx單鏈噬菌體抗體(phageantibody)，并轉化大腸桿菌。結果：該噬菌體抗體經輔助噬菌體M13KO7誘導和噬菌體次要衣殼蛋白(PⅢ)融合表達，并組裝成噬菌體衣殼蛋白可溶性表達于培養液上清，經ELISA和Western-blot的結果證實可溶性表達產物具有HBx抗原的特異性親和力。結論：單鏈噬菌體抗體的構建表達成功，可望成為原核系統中表達篩選特異性抗體可變區及有效制備活性基因工程抗體的簡捷途徑。

關鍵詞噬菌體展示技術基因工程抗體乙型肝炎X抗原

Expressionofrecombinantanti-HBxsinglechainphageantibody

ZHOUGe,LIUKang-Da,GONGYietal.

ZhongshanHospital,ShanghaiMedicalUniversity，Shanghai200032

QINHui-Lian,HEXi.

DepartmentofImmunology，ShanghaiMedicalUniversity，Shanghai200032

AbstractObjective:Tostudytheexpressionofrecombinantanti-HBxsinglechainphageantibody.Methods:Theanti-HBxsinglechainphageantibody(pScFv)wasconstructedforthestudyonactiveexpressionofgeneticantibodyinE.coli.Theanit-HBxScFvgenewasrecombinedwithphagemidvector(pCANTAB)andtransferredintohostbacteria.Results:Theanti-HBxpScFvwasinducedwithhelperphageM13KO7.ThesolubleexpressionproductsfusedwithphageminorcoatproteinwassecretedwhichwasdetectedspecificbindingaffinitybyWestern-blotandELISAassay.Conclusion:Thesuccessfulconstructionandexpressionofanti-HBxpScFvmightestablishthemethodfortheactiveselectingandpreparingthespecificantibodiesintheE.coliexpressionsystem.

KeywordsPhagedisplayRecombinantantibodyHBxAg

作為肝癌相關抗體，抗HBx單克隆抗體多年來一直被應用于肝癌實驗性治療和亞臨床治療的研究，并取得了一定的療效［1］。為了進一步解決單克隆抗體在臨床治療中的HumanAnti-mouseAntibody(HAMA)反應，前期我們構建了原核表達的嵌合抗體和單鏈抗體［2，3］。雖然采用了金屬離子配體螯合純化技術解決了重組抗體的大量純化問題，重組抗體的復性問題限制了重組抗體進入實驗性研究的進程。本研究試圖通過構建噬菌體抗體融合表達載體來解決基因工程抗體可變區的活性原核表達，為基因工程抗體進入實驗性導向研究提供基礎。

1材料與方法

1.1材料HBx單克隆抗體輕，重鏈可變區基因由本組克隆制備［3］，單鏈抗體構建載體pOPE-51及重組HBx抗原為德國癌癥中心提供(DKFZ，Heiderberg,Germany)，噬菌體抗體構建載體PCANTAB，由中國科學院，上海生物化學研究所提供，限制性內切酶為Gibco公司產品，PCR擴增及DNA測序試劑為PE公司產品，酶標抗His-tag抗體，酶標抗噬菌體抗體為Pharmica公司產品。

1.2PCR擴增單鏈抗體基因引物委托中國科學院，上海植物生理研究所合成序列如下：X+：5′-ACACAAGGCCCAGCTGGCCGAGTCAGGAGGAGG-3′；X-：5′-TCAATAGCGGCCGCATGATGGTGATGTATGC-3′。

1.3構建抗HBx單鏈抗體組氨酸融合表達載體及其表達，鑒定，參見文獻［3］。

1.4PCR擴增及電泳純化HBxScFv/His融合基因片段以HBxpOPE為模板(10ng),PCR擴增引物各50pmol，dNTPs200μmol/L,1×PCRBuffer(KCl50mmol/L,Tris-Cl10mmol/LpH8.3,0.1%明膠)，在100μl的反應體積中加入3U的TaqDNA聚合酶，于94℃45s，52℃15s，72℃45s(PE9600)，共30循環，取5μlPCR產物于瓊脂糖電泳鑒定。其余產物經制備型凝膠回收特異性片段(GelpurificationKit,QIAGEN,Germany)于-20℃保存備用。

1.5抗HBx噬菌體抗體的克隆構建見圖1。

1.6將構建的pCANT-X轉化大腸桿菌TG1，于含2%葡萄糖，100μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培養液于30℃振蕩培養過夜，提取雙鏈質粒DNA，經酶切鑒定篩選陽性克隆，并測序鑒定［4］。

1.7單鏈噬菌體抗體的融合表達及純化陽性克隆1%轉種含2%葡萄糖，100μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培養液于30℃振蕩培養約3h(OD600=0.6)，加入總滴度為109的輔助噬菌體M13KO7，并于37℃靜置感染15min。離心收集菌體并重懸于3ml含50μg/ml卡那霉素(Kan)，100μg/mlAmp的LB中37℃培養液過夜。于10000r/min，4℃離心收集過夜培養上清，按每ml上清中加入150μlSA溶液(16%PEG6000，3.3mol/LNaCl)，4℃2h靜置，于10000r/min，4℃沉淀噬菌體，沉淀重懸于100μl的LB培養液中。

1.8抗HBx單鏈噬菌體抗體的ELISA鑒定取10μl純化的噬菌體單鏈抗體，按10倍稀釋至10-6，以M13KO7為對照，和已包被的HBxAg的酶標板(由德國癌癥中心提供)室溫親和30min，以鼠抗噬菌體抗體(mAb,Pharmacia,USA)為一抗，HRP-羊抗鼠IgG(華美生物工程公司)為二抗，檢測抗HBx單鏈噬菌體抗體的親和活性。

3討論

1988年SmithGP建立噬菌體展示篩選技術以來［5］，該技術已被廣泛應用于特異性抗體可變區的篩選，在噬菌體載體中構建單鏈或單區抗體，這種有活性表達的噬菌體抗體也已成為篩選特異性人源抗體的重要手段［6］。特異性抗體可變區在原核系統中的活性表達，在很大程度上推動了抗體工程的發展［7］，但是以強表達操縱子調控的高效原核表達導致了抗體蛋白大量以包涵體形式存在面臨復性的難題。本研究嘗試采用構建噬菌體單鏈抗體的方式探索以噬菌體為載體在原核系統中活性表達，制備單鏈基因工程抗體的可能。

我們的結果表明，設計的PCR引物可直接擴增HBx單鏈抗體的編碼基因，在我們得到的5個不同克隆DNA序列分析結果中僅一例發生單基因突變，其余4例均為正常序列，這表明通過優化的PCR條件，可直接利用PCR獲得可靠的目的基因用于表達。構建的噬菌體單鏈抗體是以抗體重鏈可變區-十肽小側鏈柔性肽段-抗體輕鏈可變區以及3′端的六聚組氨酸尾組成插入噬菌體次要衣殼蛋白(基因Ⅲ產物，PⅢ)中融合表達。含有表達載體pCANTAB-HBx的大腸桿菌在輔助噬菌體M13KO7的感染下大量產生含有重組HBx單鏈抗體的噬菌體衣殼蛋白，并包裝可溶性分泌于培養液上清，其含量可高達3×1013pfu/ml。同時利用簡單的PEG/NaCl沉淀的方法即可制備量和純度足以滿足用于動物模型實驗的活性單鏈抗體表達產物。此外，pCANTAB-HBx表達載體在適量的IPTG誘導下，激活的LacZ操縱子啟動大量表達HBx單鏈抗體-PⅢ融合蛋白，并經噬菌體PⅢ信號肽引導可溶性分泌于培養液中，可利用融合于單鏈抗體3′端的六聚組氨酸抗體檢測，以及Ni2+離子樹脂吸附純化［3］。由于目前的抗噬菌體單克隆抗體或抗血清針對的親和靶位多為噬菌體主要衣殼蛋白(PⅧ)，因而我們在檢測噬菌體抗體和檢測單鏈融合抗體時分別應用了抗噬菌體和抗His-Tag抗體作為第一抗體?？笻Bx噬菌體抗體的構建，表達為抗體可變區基因活性表達提供了一種高效，簡單的方法。同時噬菌體抗體所特有的基因型和表型的一一對應特征，為抗體可變區全基因文庫的篩選提供了有力的手段［8］。

作者簡介：周鉻，30歲，助理研究員，主要從事腫瘤導向研究；

秦慧蓮，女，46歲，教授，主要從事腫瘤免疫研究

作者單位：周鉻劉康達龔奕何進(上海醫科大學附屬中山醫院實驗研究中心，上海200032)

秦慧蓮何曦(上海醫科大學免疫學教研室，上海200032)

4參考文獻

1LiJ,TangZY,LiuKDetal.Radioimmunoimagingofhumanhepatocellularcarcinomaxenograftswith131-I-HBxmonoclonalantibody.JExpClinCancerRes，1995；14(1):25

2ZhouG,LiuKD,TangZYetal.Reconstructionandexpressionofchimericanti-HBxantibodyinE.coli.JCancerResClinOncol,1997;123(6):325

3ZhouG,LiuKD,SunHCetal.Expressionandpurificationofsingle-chainanti-HBxantibodyinEscherichiacoli.JCancerResClinOncol,1997;123(12):609

4SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:Alaboratorymanual.2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989：p14.5-14.52

5ParmleySF,SmithGP.Antibody-Selectablefilamentousfdphagevector:affinitypurificationoftargetgenes.Gene,1988；73(1):305

6WinterG，GriffithsAD.Makingantibodiesbyphagedisplaytechnology.AnnRevImmunol,1994；12(2):433

7葉敏.基因工程抗體研究進展.中華微生物學和免疫學雜志，1996；16(4)：231

8張英，李愛民.噬菌體表面表達技術及其在抗病毒研究中的應用現狀和前景.病毒學報，1997；13(2)：185