生物工程上游技術實驗教學分析

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摘要:在生物工程專業教學中,將“分子生物學實驗”“基因工程實驗”和“微生物遺傳育種實驗”等多門實驗課程有機地統一成一體,整合為更具連貫性、系統性和設計性的綜合性實驗———生物工程上游技術實驗.改革后的課程在培養學生獨立思考、獨立實踐和綜合創新能力及科研興趣方面,取得了很好的實踐效果.

關鍵詞:生物工程;實驗教學;質量工程項目;實踐體系

分子生物學以遺傳學、生物化學、微生物學等為基礎,從分子水平揭示生命現象,是生命科學的核心,已成為當今世界的一個主干學科.基因工程是分子生物學的工程應用,是以分子生物學為基礎,對生命現象進行工程改造的新興技術學科.分子生物學和基因工程是生命科學最重要、發展最快的領域,在醫療、制藥、食品、農業、化工、環境保護和能源等行業,已經、正在并將繼續產生巨大的效益.例如:基因工程已經廣泛應用于制藥產業,用于藥物和疫苗等的研發、改造和生產,在人類健康領域發揮巨大推動力;植物基因工程在作物育種中,對提高作物產量、品質和抗逆性等方面有重要作用[1].以基因工程為核心的生物技術是當代高新技術,生物技術產業正在成為許多國家的戰略性新興支柱產業.生物工程專業在這些領域有廣闊的發展和就業前景,相應地也需要以基因工程為主干內容的生物工程上游技術綜合實驗不斷改革發展,從而更加注重培養學生的綜合實踐能力和創新能力,以適應不斷創新發展的生物工程和生物技術產業需求[2].

1改革的必要性

1．1生物工程上游技術實驗概述.生物工程是以現代生命科學為基礎,綜合基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程和蛋白質工程等新技術手段而成的,實驗性和應用性極強,因此必須加強實驗教學,以提高教學質量[3G4].教育部高等學校生物科學與工程教學指導委員會分別在«生物工程專業規范»(2006年)[5]和«生物工程專業介紹»(2011年)中將“分子生物學與基因工程實驗”列為核心實驗課程,在生命科學另外2個本科專業(生物科學專業、生物技術專業)也被列為核心實驗課程.國內外不同大學的生物類學科都開設了分子生物學與基因工程實驗課程.分子生物學和基因工程作為生命科學發展的最前沿,研究技術和研究成果日新月異,國內很多高校都在對相應的課程實驗的內容和方法進行改革.復旦大學的基因工程實驗內容不但包括原核生物,也包括哺乳動物細胞系,并加入基因可變剪接、功能分析和表達水平定量分析等內容,不但將較新的技術引入實驗教學,同時也讓學生對于基因工程過程有更全面的理解,并激發他們的學習興趣和科研興趣[6].湖南師范大學的袁婺洲等利用自身科研平臺,將制作轉基因斑馬魚引入基因工程實驗課,從通過進行動物表達載體構建和通過顯微注射進行轉基因,到篩選和鑒定轉基因或嵌合體后代,讓學生系統理解完整的動物基因工程流程[7].內蒙古的林曉飛等,在基因工程實驗中加入制作轉基因擬南芥的內容[8].這些教學改革注重綜合性和創新性,結合科技發展前沿研究成果,教學成效較好.廣州大學生命科學學院自2003年起,開始在生物工程專業開設基因工程實驗.為了對接生物技術產業,廣州大學生命科學學院首創性地提出了生物工程專業實驗改革方案,設置了生物工程上游技術實驗、生物工程中游技術實驗和生物工程下游技術實驗,整合取代原有的實驗.該方案于2005年4月通過了廣州大學教務處組織的“生物工程專業實驗體系改革”論證,2名全國高校生物科學與工程教指委成員參加了論證.隨后,陸續為生物類不同專業開設了相應的實驗課程,包括生物工程上游技術實驗(生物工程專業,64學時)、現代生物技術綜合實驗(生物技術專業,48學時)、分子生物學實驗(生物科學專業32學時).其中,后2門實驗課程是從生物工程上游技術實驗中精選的與專業相關的實驗項目.生物工程上游技術實驗將“分子生物學實驗”“基因工程實驗”及“微生物遺傳育種實驗”等多門實驗課程,有機地統一成一體[9].將這些實驗課程整合成若干項基礎性、設計性和綜合性實驗,形成一個完整的實驗教學體系,既能節約成本,又能使學生更加系統地掌握實驗的基本技術.實驗技術也更加接近本學科的前沿,包括:感受態細胞的制備和轉化;轉化子的篩選;DNA和RNA的提取;基因表達的RTGPCR分析;質粒的提取、酶切和凝膠電泳;多聚酶鏈式反應(PCR);PCR產物的純化、克隆和轉化;轉化子的鑒定等.實驗上一環扣一環,前一次實驗的結果是后一次實驗的材料.所以學生對待每次實驗,都必須小心謹慎,課前需認真預習,實驗需嚴格操作,學生的學習習慣和科研態度明顯改善.通過本課程的學習,學生可系統掌握很多分子生物學的基本實驗技術,包括:DNA、RNA提取和質量分析;DNA的限制性酶切和目的片段的分離;質粒的擴增和提取等.這些基本實驗技術將為后續的基因工程等實驗課程奠定良好基礎.在基因工程和微生物遺傳育種實驗技術方面,始終圍繞本實驗室研究較多的蛋白質(如擬南芥生長素反應因子8或鈣調素5的生物工程實驗技術而展開,從蛋白質的編碼基因著手,利用PCR擴增該基因,將該基因克隆于適合在受體菌中表達的載體,并將表達載體導入到受體菌,然后利用表型、選擇標記或者分子標記進行轉基因后代的篩選和鑒定.學生通過實驗,可清晰掌握上游技術實驗的精髓.以此為基礎,田長恩主編的«生物工程上游技術實驗手冊»,作為“十一五”國家重點圖書出版規劃項目———應用生物技術大系系列圖書在科學出版社出版[10].1．2目前生物工程上游技術實驗的問題及改革設想.盡管如此,目前的生物工程上游技術實驗尚存在一些問題.首先,在初步建立的實驗項目體系中,使用擬南芥生長素反應因子8基因的片段作為實驗對象,盡管可方便基因克隆和鑒定,但卻無法通過方便的RTGPCR和表型觀察分析其表達情況.在優化的實驗項目體系中,用擬南芥鈣調素5基因作為實驗對象,既可方便基因克隆和鑒定,也可用RTGPCR分析其表達,但卻無法方便地進行表型觀察.因此,找到一個方便觀察表型的基因十分重要.綠色熒光蛋白基因分子不大,其編碼蛋白在藍光下具有綠色熒光,觀察十分方便,設備要求簡單.故本研究在實驗項目優化中首先構建方便遺傳操作和轉基因產物觀察的、載有綠色熒光蛋白基因的表達載體,轉化、鑒定獲得轉綠色熒光蛋白基因的大腸桿菌,用于實驗教學.其次,原實驗課程主要內容包括原核表達質粒的構建、大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化,以及對受體菌的篩選和鑒定,均是原核生物基因工程的內容,而沒有包括真核生物基因工程的內容.因此,在對實驗內容進行優化過程中,加入高等植物的基因工程,利用原生質體轉化,將綠色熒光蛋白基因轉入水稻,構建外源目的基因的瞬時表達體系,并對目的基因的表達產物進行鑒定,利用熒光顯微鏡表型直觀觀察綠色熒光.再次,實驗課程教學方式也可進一步優化.目前除最后一次為設計性實驗外,本課程大部分實驗教學方式較為傳統,學生參與文獻查閱、實驗方案設計、預實驗和實驗準備不夠,造成部分學生學習被動,機械重復實驗方案,求知欲不強,學習主動性未能充分發揮,影響學生對分子生物學和基因工程相關學科理論知識的掌握和對實驗整體技術路線和原理的理解,造成學生對實驗設計的可靠性和科學性理解不夠,解決問題能力和數據分析能力較差.

2改革內容

針對上述問題,對生物工程上游技術實驗教學,進行了從內容到教學方式、考核方式的改革.2．1結合科研優勢改革課程內容.在新工科背景下,高校工程技術實驗課程教學模式正在經歷改革[11],其中一個熱點就是將科研實驗轉化為教學實驗[12].我校“生物工程上游技術實驗”面向生物工程專業大三學生,開設在第六學期下半學期.在本課程之前,學生已經完成細胞生物學、分子生物學、遺傳學和部分基因工程等專業基礎課程及其相關實驗,掌握了大分子DNA提取、聚合酶鏈式反應、限制性內切酶實驗等分子生物學基礎技術,具備了較為全面的生物工程相關知識和實驗技術,在此基礎上開設了這門更具連貫性、系統性和設計性的綜合性實驗,提高學生的綜合實踐能力和創新能力.本課程教研組成員的主要研究領域為植物遺傳學,具體方向為植物抗逆基因的發現和功能研究.結合教師的研究方向,發揮自身領域的優勢和專長,將研究工作中常用的高等植物基因工程引入實驗課程中,依托較為完備的科學研究平臺,把教師在研究工作中積累的成熟研究方法、實驗模型和體系,以及科學實踐經驗運用到教學工作中.本實驗課程一方面保留了原課程中的質粒DNA提取、質粒構建、原核生物轉化和重組驗證等經典內容,同時結合生物科學和技術的發展前沿,增加了真核生物轉化、轉基因植物瞬時表達體系的構建和鑒定等內容.本課程的主要設計流程是:提取包含綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因的質粒;使用PCR技術擴增所需目的基因GFP;將目的基因與細菌植物雙元瞬時表達載體進行重組;使用化學法制備和轉化大腸桿菌感受態細胞;篩選陽性重組子等.通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光、提取mRNA逆轉錄cDNA,進行PCR檢測或者提取目的基因表達產物GFP,并進行Western蛋白質印跡分析,來檢測外源目的基因是否轉入大腸桿菌中,并表達成功,從而篩選轉入GFP基因的轉基因受體菌.經鑒定后,從成功轉入目的基因的大腸桿菌重組子種提取質粒,制備水稻的原生質體,利用原生質體轉化法將目的基因GFP轉入水稻原生質體,通過熒光顯微鏡觀察瞬時表達的GFP的綠色熒光.與改革前課程的實驗流程相比,做了如下創新.首先,實驗不但包括原核生物的基因克隆,還包括真核生物水稻原生質體的轉化.從包含目的基因的大腸桿菌中提取質粒,然后以質粒為模板,使用PCR技術擴增目的基因,將目的基因插入細菌和植物雙元質粒,構建重組表達質粒,通過化學方法制備和轉化大腸桿菌感受態細胞,進而將質粒轉化水稻原生質體.其次,傳統生物工程實驗一般利用PCR來篩選和驗證外源基因的導入和正確表達,而改革后的課程,學生在前期學習的基礎上,通過查找文獻自行確定和撰寫篩選轉化子以及轉化植物細胞的實驗方案.學生設計的鑒定方法,不但包括傳統DNA層面的檢測,也包括轉錄水平和蛋白質水平的檢測,具體包括:從轉化的細胞中提取總RNA,通過逆轉錄獲取cDNA,使用GFP特異性引物進行PCR或定量PCR,對外源基因的表達進行轉錄層面的檢測;從細胞中提取蛋白質,利用抗GFP特異性抗體進行Western蛋白質印跡檢測目的蛋白;利用熒光顯微鏡觀察活體水稻細胞,檢測GFP的熒光.在新實驗課程中,學生可以學習和操作更多方面的分子生物學和基因工程技術,與理論知識有效結合,加強與其他課程內容(如植物學)的聯系,對生物工程上游技術的理解更加完整和連貫.2．2建立自主研究型教學模式.為了提高學生獨立創新和解決問題的能力,提升他們對科學研究的興趣,培養創新型人才,也對教學模式進行了改革.本課程具有連貫性特點,只有完成前面的實驗后才能進行后續實驗,而且部分實驗所需時間較長,實驗進度較難統一,為此,采取了前期實驗統一講解統一操作,后期實驗則由學生自主設計、獨立實驗并撰寫課程論文的教學模式.在前期的提取質粒、PCR、PCR產物的純化和克隆、大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化、篩選目的轉化子和細菌培養(見圖1)等實驗中,由教師制訂實驗方案,統一講解實驗原理和實驗步驟、實驗設計思路、相關技術的目的和要點及常用實驗設備操作規范等,幫助學生理解各項技術原理,熟悉實驗操作和實驗室規范,掌握實驗設計方法,使他們在實踐中融會貫通理論知識,為后期的設計性實驗打好基礎.在后期利用不同方法篩選和鑒定轉化大腸桿菌細胞,以及原生質的制備、轉化和鑒定實驗中,采用研究型實驗的教學方法.在實驗開始前,要求學生閱讀大量文獻,了解現代基因工程實驗的主流常用技術,結合植物學、分子生物學等相關課程,以及前期的實驗,自主制定實驗方案,包括自主選擇鑒定導入外源基因并表達目的蛋白的大腸桿菌細胞的方法、從篩選獲得的目的轉化子中提取質粒的方法、制備水稻原生質體的方法、將質粒轉入原生質體的方法等.在開始實驗前,學生需提交實驗設計和技術路線方案,再經過課堂討論,并在教師指導下,修改完善實驗方案.學生按照修改完善后的方案,獨立操作完成后續實驗.考慮到每個學生的實驗方案不同,實驗進度和所需時間有差異,在實驗課程期間,全面開放實驗室,由學生自行安排.同時,教師和實驗室人員對學生的實驗進行監督,保證實驗過程安全規范,并解答學生在操作中的疑問.在實驗完成后,學生將提交學術論文形式的課程論文,包括摘要、前言、材料和方法、結果和討論,以及結論等.在此過程中,學生不只完成實驗報告,而是要將整個生物工程上游技術實驗視為一個科研項目,要提取目的基因,將其轉入大腸桿菌和植物,并予以正確表達;要綜述中外研究進展,闡述實驗設計思路;要利用適宜的統計方法處理數據,分析實驗結果,并討論實驗過程中存在的問題.這項課程論文及自主實驗前的實驗設計報告占實驗課程總成績的50％,前期實驗的報告占總成績的另外50％.這樣的教學方式使學生不是機械地完成重復性實驗,單純學習生物工程技術操作,而是能更深刻地理解技術的原理,并將技術作為手段用于一項連貫完整的科學研究.更重要的是,通過一個實驗課程,使學生既可學習實驗設計的思路,理解實驗設計的可行性和可靠性,又可在此過程中培養嚴謹的科學思維,提高綜合處理問題能力和創新能力.同時,通過自行設計實驗和獨立操作,完成一個完整的轉基因過程,并得到明確的實驗結果,特別是直觀地觀測到綠色熒光蛋白的熒光,能夠提高學生的成就感,增強他們對科學研究的興趣.

3結語

本次生物工程上游技術實驗的改革,結合課程教研組教師的科研方向,以細菌和植物基因工程為中心,將課程內容從傳統的原核生物擴展到高等植物,加入更多較新的、科研實踐中應用性強的生物技術,通過連貫性強的實驗流程和獨立設計實驗,著重培養了學生獨立思考、獨立實踐和綜合創新能力,提升了他們對科研工作的興趣.

作者:李馨 劉吉升 周玉萍 劉順枝 覃希 田長恩 單位:廣州大學