潰瘍性結腸炎模型管理論文

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【摘要】目的考察口服硫酸亞鐵（FeSO4）對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的潰瘍性結腸炎（UC）模型大鼠氧化應激狀態的影響。方法采用TNBS乙醇溶液復制UC大鼠模型，雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、FeSO4對照組（100mg·kg-1·d-1）和FeSO4低劑量組（50mg·kg-1·d-1）、中劑量組（100mg·kg-1·d-1）和高劑量組（300mg·kg-1·d-1），給藥2周后分別觀察大鼠的一般狀態、組織病理學變化、組織及血清超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）水平。結果FeSO4中、高劑量組大鼠體質量減輕，腹瀉動物數增加，結腸組織損傷加重，血清與結腸組織SOD活性降低、MDA水平升高（P<0.05）。結論UC模型大鼠體內存在氧化應激，口服補充FeSO4可能會進一步加劇其體內氧化應激狀態及結腸組織病理學損傷。

【關鍵詞】硫酸亞鐵;潰瘍性結腸炎;三硝基苯磺酸;氧化應激;大鼠

潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種病因不明的直腸和結腸慢性非特異性炎癥，臨床主要表現為反復發作的腹痛、腹瀉及黏液膿血便，重癥或病情持續活動的患者可出現缺鐵性貧血。臨床觀察發現，給予UC患者口服鐵劑不能很好地被耐受，甚至會加重胃腸道癥狀或促進疾病活動［1］。硫酸亞鐵（ferroussulfate，FeSO4）是臨床最為常用的鐵劑之一，同時也是一種強氧化劑，可能會因產生自由基（oxygen-derivedfreeradicals，OFR）而加重組織損傷［2］。本實驗利用三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，TN-BS）復制UC模型，觀察FeSO4對UC模型大鼠氧化應激狀態的影響，為臨床治療提供依據。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

TNBS購于Sigma公司，5%（W/V）水溶液，批號為P2297;FeSO4，上海黃浦制藥有限責任公司生產，批號為050606，輕輕把FeSO4片研碎，稱取一定量的粉末，加入蒸餾水配成100mg·ml-1的混懸液備用;丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮蘭蛋白檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品，批號為20060323。

1.2動物

雄性SD大鼠60只，體質量200～220g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，普通級。

1.3儀器

756MC紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），TGL-16H高速離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司），可控式硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司），QL-901漩渦混合器（江蘇海門麒麟醫用儀表廠），電子分析天平（上海天平儀器廠），DIAX-900內切式組織勻漿機（德國Heidolph公司）。

1.4大鼠UC模型制備［3］

健康大鼠60只，隨機分為6組。留2組作正常對照組與FeSO4對照組，余4組均制備模型，禁食不禁水24h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1ml·kg-1）使大鼠輕微麻醉后，將直徑2mm的乳膠管經肛門輕輕插入大鼠體內大約8cm處，將TNBS（125mg·kg-1）的50%乙醇溶液緩緩注入到大鼠腸腔內，提起大鼠尾部，倒置30s，使造模劑充分滲入大鼠腸腔。

1.5分組及給藥

將正常大鼠隨機分為正常對照組與FeSO4對照組，每組10只;將造模大鼠隨機分為模型對照組，Fe-SO4給藥高、中、低劑量組，每組10只。FeSO4對照組大鼠，按照100mg·kg-1·d-1灌胃FeSO4混懸液;Fe-SO4高、中、低劑量組大鼠，分別按照300mg·kg-1·d-1、100mg·kg-1·d-1、50mg·kg-1·d-1灌胃FeSO4混懸液;正常對照組及模型對照組大鼠每天灌胃同體積生理鹽水，各組大鼠均在造模后6h開始給藥，連續給藥2周。

1.6癥狀觀察

每天對各組大鼠進行稱重，觀察體質量變化并記錄;觀察大鼠糞便形狀，記錄大鼠發生腹瀉、血便的數量。

1.7結腸黏膜組織損傷評分

各組大鼠給藥2周后，3%戊巴比妥鈉過量麻醉，腹主動脈取血2ml，離心后置-80℃冰箱保存備用。將肛門以上10cm腸段取出，沿腸系膜縱行切開，用冰生理鹽水沖洗，并稱量。將黏膜向上展開，觀察黏膜損傷并按照Wallace和Keenan1990年的評分標準［4］進行評分:0分為無炎癥和潰瘍;1分為局部充血但無潰瘍;2分為有潰瘍但無充血;3分為有1處潰瘍及炎癥;4分為有2處或2處以上潰瘍及炎癥;5分為潰瘍延伸超過2cm。同時取少量炎癥腸組織，迅速放置液氮罐中備用。

1.8病理組織切片觀察

取肛門以上8cm腸段卷起，置10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，行4μm厚連續切片，HE染色觀察組織學變化。

1.9生化指標測定

血清及結腸組織MDA、SOD均按照檢測試劑盒說明書進行操作。

1.10統計學處理

計量指標以x-±s表示，多組間比較行方差分析，各組間兩兩比較行LSD檢驗，采用SPSS12.0軟件進行統計分析。

2結果

2.1一般狀態及大便性狀的變化

見表1。正常組與FeSO4對照組大鼠活動如常，反應機警，毛發有光澤，飲食正常，體質量增長較多，無腹瀉及便血;制模大鼠精神萎靡，毛發無光澤，飲食減少，均出現不同程度的腹瀉、便血。正常對照組與FeSO4對照組大鼠體質量增加、腹瀉及便血無顯著性差異;與正常對照組比較，模型對照組大鼠體質量增加明顯減少（P<0.01）;FeSO4中、高劑量組大鼠體質量增加顯著低于模型對照組（P<0.05），發生腹瀉、便血動物只數明顯增多。表1各組大鼠發生腹瀉數及體質量變化（略）

2.2結腸損傷評分及生化指標改變

見表2。觀察大鼠結腸外觀及黏膜表面發現，正常對照組與FeSO4對照組大鼠結腸黏膜無明顯充血水腫，未見糜爛及潰瘍灶;模型對照組大鼠的結腸多數與相鄰臟器有輕度的粘連，結腸充血水腫，在距肛門8cm的腸段有較大的潰瘍病灶，病灶處結腸壁增厚，腸黏膜表面發生潰瘍糜爛壞死，與正常對照組大鼠相比，結腸明顯變短，結腸質量增加;FeSO4各劑量組大鼠結腸水腫、糜爛等炎性癥狀明顯加重，潰瘍面積增大。模型組結腸病理損傷評分、結腸組織和血清MDA水平均高于正常對照組（P<0.01），結腸組織和血清SOD水平均低于正常對照組（P<0.01）;與模型對照組比較，Fe-SO4中、高劑量組結腸組織損傷評分、結腸和血清MDA水平顯著升高（P<0.05），結腸和血清SOD水平顯著降低（P<0.05），中、高劑量組之間無明顯差異;上述指標在FeSO4對照組與正常對照組未見統計學差異（P>0.05）。表2各組大鼠結腸損傷以及生化指標的影響（略）

2.3結腸組織病理學變化

見圖1。正常大鼠結腸組織結構清晰，黏膜完整，腸腺豐富，排列緊密（圖1A）;TNBS造模后，大鼠結腸組織黏膜壞死脫落，潰瘍形成，大量中性粒細胞浸潤，腺體消失（圖1B）;FeSO4對照組大鼠結腸組織粘膜結構完整，未見潰瘍形成（圖1C）;FeSO4低、中、高劑量組大鼠結腸組織腸黏膜上皮脫落缺損加重、潰瘍區域明顯增大，黏膜周圍上皮增生修復減慢，炎細胞增加（圖1D～F）。

3討論

TNBS是一種半抗原，其誘導產生的大鼠模型除發生腹瀉、便血、體質量減輕等臨床癥狀外，還可以誘發大鼠腸道炎癥，腸黏膜發生潰瘍、水腫、糜爛、大量炎性細胞浸潤等組織病理學改變，類似于人類的UC，由于制備簡單省時而被廣泛應用。研究發現，氧自由基在UC的發病中起重要作用，氧自由基對自身組織產生攻擊作用，參與并通過脂質過氧化反應產生炎癥介質（白三烯、前列腺素等）活化炎癥反應［5］。MDA是氧自由基觸發細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的產物，其含量反應了組織過氧化損傷程度，它能使腸粘膜組織損害進一步加重。MDA水平的高低又間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是重要的過氧化物分解酶，能有效清除氧自由基從而抑制脂質過氧化反應，并能穩定細胞膜，SOD水平的高低間接反應了機體抗氧化能力。Aghdassi等［6］報道，給予UC模型大鼠腹腔注射右旋糖苷鐵，可以加重其結腸損傷，加劇其粘膜氧化應激狀態。

本研究中，FeSO4中、高劑量組給藥均可以惡化TN-BS造模導致大鼠的腹瀉、體質量減輕等癥狀，加重UC模型大鼠結腸的組織學損傷，降低結腸組織及血清SOD的活力，升高結腸組織及血清MDA水平，對UC模型大鼠的氧化應激狀態表現出明顯的加劇作用;但在給予正常大鼠同等劑量FeSO4時未見上述情況發生。

綜上所述，UC大鼠機體抗氧化能力減弱，處于氧化應激狀態;當給予口服一定劑量FeSO4時，可能通過Fe2+作用產生大量氧自由基，導致機體的氧化應激進一步惡化，從而加劇機體的氧化損傷。因此，對于UC合并貧血補鐵治療時，應選擇正確的補鐵方式（如非離子鐵），合理的營養干預，提高機體抗氧化能力，對于預防口服補鐵引起的氧化應激，減輕氧化損傷，減少并發癥的發生有重要意義。

【參考文獻】

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