人肺上皮細胞蛋白酶激活論文

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【摘要目的摘要:蛋白酶激活受體（proteaseactivatedreceptors,PARs）廣泛分布在多種組織細胞上，但4種PARs在肺上皮細胞的表達情況尚不清楚.我們用A549細胞探究PARs在肺上皮細胞的表達.方法摘要:采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）、流式細胞儀和免疫熒光細胞染色分析技術分析肺上皮細胞系A549細胞PARs的表達情況.結果摘要:4種PARs在肺上皮細胞上均有不同程度的表達.結論摘要:肺上皮細胞同時表達PAR1~44種受體，這為進一步探究PARs在肺上皮細胞的功能奠定了基礎.

【蛋白酶激活受體；肺上皮細胞；RTPCR；流式細胞術；免疫熒光細胞染色

0引言

蛋白酶激活受體（proteaseactivatedreceptors,PARs）屬G蛋白耦聯受體家族，目前共發現4個成員摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系鎖配體的新的N末端，可自我激活PAR功能［1］.探究顯示，PARs分布在多種組織細胞上，包括血小板、白細胞、肥大細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞、消化道上皮細胞等.PAR被激活后，可介導跨膜信號轉導從而參和凝血、炎癥、變態反應等生理和病理過程的發生［2］.許多組織上皮表達的PARs可能在不同的病理過程中起功能，雖然一些組織的PARs的分布已有探究，但4種PARs在肺上皮的表達情況和功能還不是十分清楚.因此，我們利用培養的人肺癌上皮細胞系A549細胞探索四種PARs在肺上皮細胞上的表達特征.

1材料和方法

1.1材料

人肺癌上皮細胞系A549細胞購自中國科學院上海細胞探究所,青、鏈霉素、非酶性細胞分離液購于Sigma公司，DMEM培養液、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，TRIZOLReagent購自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,購自TAKARA公司，SYBRGreenI核酸凝膠染料購自BMA公司,PCRMarkers購自Biolabs公司.PE標記的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗體及相應的同型對照均購自SantaCruz公司.FITC標記的羊抗兔IgG二抗購自BDPharmingen公司.PCR儀PTC200購自MJResearch公司，激光掃描共聚焦顯微鏡系統購自日本Nikon公司，FACSCalibur流式細胞儀購自BectonDickinson公司.

1.2方法

1.2.1細胞培養人肺癌上皮細胞系A549細胞接種于50mL培養瓶內，用DMEM完全培養液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L鏈霉素），于37℃,50mL/LCO2培養箱中培養.

1.2.2RTPCR收集培養的A549細胞，用TRIZOLReagent提取細胞總RNA，具體操作步驟按試劑說明進行.RNA經10g/L瓊脂糖電泳后，按TAKARARTPCRkit說明進行cDNA合成.逆轉錄的條件為摘要：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特異性引物均由上海博亞生物技術有限公司合成.βactin（F）5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCACCTGCGTG3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR擴增條件為摘要：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35個循環,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR擴增條件為摘要：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35個循環,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4擴增的目的片段分別為500,461,403和401bp；βactin的擴增片段為202bp.PCR擴增片段經測序驗證.

1.2.3流式細胞術分析待培養細胞生長至70%~80%時，用非酶性細胞分離液懸浮細胞，10g/LBSA/PBS洗2次，調整細胞密度為5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室溫固定10min,按說明書分別加入1∶20PE標記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應的同型對照抗體，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC標記的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500μL1×PBS懸浮細胞，使用流式細胞儀CELLQUEST軟件檢測和分析上皮細胞PAR的表達情況.

1.2.4免疫熒光細胞染色將A549細胞接種于8孔顯微鏡玻片培養過夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入1∶20的PE標記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應的同型對照抗體，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC標記的羊抗兔Ig二抗，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察.

2結果

2.1肺上皮細胞PARsmRNA的表達肺上皮細胞表達PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，擴增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的長度分別為500,461,403和401bp（Fig1）.

2.2肺上皮細胞PARs蛋白質的表達流式細胞儀檢測發現肺上皮細胞表達PAR1，PAR2，PAR3和PAR4，其中PAR4的表達為最強，PAR1和PAR3的表達水平較相似，PAR2的表達水平最弱.免疫熒光細胞染色分析進一步證實上述PARs在肺上皮細胞上的表達（Fig2）.

Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells

圖2免疫熒光細胞染色分析檢測肺上皮細胞PAR的表達

3討論

PARs家族共有PAR1，PAR2，PAR3和PAR44個成員，凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4，而PAR2可被胰蛋白酶、肥大細胞類胰蛋白酶和活化的凝血因子Ⅹ所激活［3-5］.另外，這些受體還可被相應的PARs激動肽所激活.其中PAR1是凝血酶的高親和力受體，而PAR4只能被高濃度凝血酶激活.探究顯示，凝血酶通過PAR1和PAR4途徑協同互補介導血小板的活化，而PAR3作為PAR4的輔助因子，在血小板活化中也起著一定功能［6］，除參和凝血外，多種細胞類型PARs的廣泛激活還可參和血管損傷反應［7,8］.PAR2的激活可參和細胞因子及炎癥介質的釋放,增加微血管的滲出以及中性粒細胞的趨化,血管擴張,血管收縮,細胞增殖等炎癥的病理過程.此外，在不同的生理和病理條件下，體內不同的內源性蛋白酶的存在，可能會激活同一細胞上的PAR2.

我們利用RTPCR、流式細胞儀和免疫熒光細胞染色分析技術檢測到了4種PARs在肺上皮細胞上的表達.肺上皮細胞作為首先接觸吸入性抗原的組織細胞之一，在變態反應性疾病的發病機制中起重要功能，它能夠合成和釋放許多前炎癥細胞因子和趨化性細胞因子，包括IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等［3,9］，還可以合成抗炎因子如PGE2和NO［10］.通過這些因子的功能來募集、激活炎癥性細胞從而調節機體的炎癥過程，尤其是PAR2的激活可多方面參和肺部炎癥的發生和發展.我們也曾經用胰蛋白酶和PAR2激動肽激活肺上皮細胞，誘導其產生了趨化性細胞因子MCP1［11］，但其釋放的機制及肺上皮細胞表達PARs的生理和病理生理意義還有待進一步的探索.

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