聚酮化合物研究論文

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【關鍵詞】聚酮化合物；,,聚酮合酶；,,組合生物合成

摘要：聚酮化合物的組合生物合成是當前國際化學與生物學交叉學科研究的熱點之一，也正在發展成為藥物創新超常規的重要手段。本文對近十年來聚酮化合物，特別是I型聚酮化合物的組合生物合成的常用技術和方法學發展進行了回顧和展望。

關鍵詞：聚酮化合物；聚酮合酶；組合生物合成

ABSTRACTPolyketidecompoundsandtheirbiosynthesisbycombinatorialapproacheshadreceivedgreatattentionasacrossdisciplinarysubjectinanewfiledofchemicalbiologyforitsimportanceandgreatpotentialtocreatebrandnewdruginfuture.Inthisreview,wehopetosummarizemethodsandtechnologieswhichhadbeendevelopedoverpasttenyearsorsofortheimaginativediscoveryofnovelpolyketidecompoundsbycombinatorialbiosynthesis,whichincorporategenetic,chemicalandbiochemical,bioinformaticandbiotechnologicalapproaches.KEYWORDSPolyketide;Polyketidesynthase;Combinatorialbiosynthesis

1聚酮化合物及其聚酮合酶

聚酮化合物是一大類由細菌、真菌和植物將低級羧酸通過連續的縮合反應產生的天然產物，它包括許許多多具有抑制細菌(如紅霉素、四環素)、真菌(如灰黃霉素、兩性霉素)、寄生蟲(如avermectin、奈馬克丁)、癌癥(如多柔比星、enediynes)等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化合物同時還具有免疫抑制劑的活性(如雷帕霉素、FK506)，它被廣泛地應用于醫藥、畜牧和農業。如今，這一化合物越來越為人們所重視，這主要是由于該化合物具有：(1)無可比擬的生物學活性使之具有巨大的新藥物開發潛力和商業價值，聚酮化合物所形成的藥物已用于幾乎所有重要的疾病治療，每年的銷售額超過了100億美元；(2)獨特的結構和合成機制為人們研究酶催化的分子機制、分子識別和蛋白質的相互作用提供了空前的契機；(3)聚酮合酶所具有的可塑性可以使人們方便地通過組合生物合成手段來獲得新的化合物［1］。目前已發現了不少于10000種聚酮化合物，而由之衍生出的新產物更是難以記數。聚酮化合物是功能和結構最多樣化的天然產物之一，它們的合成包括酰基輔酶A活化羧酸的一系列重復的醇醛縮合而形成有一定長度的聚酮鏈骨架，然后經過環化或者芳香化、或者與脫氧糖等結構單位連接等過程。盡管聚酮化合物的結構和特性千差萬別，總的來說它可以分為兩大類：芳香族聚酮化合物和復合聚酮化合物。前者是乙酸通過縮合(起始單位除外)形成的大部分β酮基在酰基鏈的延伸和完成后都一直保持非還原狀態，經過折疊和醇醛縮合形成六元環，芳香環隨后被脫水還原，如放線紫紅素、柔紅霉素、四環素。復合聚酮化合物比芳香族聚酮化合物在結構變化上大的多，其構成單位有乙酸、丙酸和丁酸等，而且由于與芳香族聚酮化合物在合成化學、β酮基還原過程、側鏈的空間位阻上的本質差別，許多不經過折疊和芳香化，而是通過內酯化成環，還有一部分仍保持酰基鏈，如大環內酯抗生素紅霉素和螺旋霉素、抗真菌抗生素雷帕霉素和兩性霉素、聚醚類抗生素莫能霉素和南昌霉素、抗寄生蟲抗生素avermectin等。聚酮化合物是通過聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)催化形成的，其催化過程類似于脂肪酸合酶(fattyacidsynthase,FAS)催化的脂肪酸生物合成，即通過?；鵆oA活化的底物之間的重復脫羧縮合而合成［2，3］，但兩者在合成單位的選擇(包括起始單位和延伸單位)、鏈裝配過程中每個酮基還原程度的控制、以及芳香聚酮或復合聚酮鏈長的決定等方面也存在著明顯的差異，主要體現在：(1)FAS一般以乙酸作為起始單位，而PKS往往使用不同的起始單位，最為常用的有乙酸、丙酸，此外還有丁酸，殺假絲菌素使用的對氨基苯甲酸等，而avermectin所利用的起始單位可多達40余種；(2)FAS一般只用乙酸為鏈延伸單位，而PKS除了利用乙酸作為鏈伸長單位外，還可利用丙酸或丁酸，在終產物中相應生成甲基或乙基側鏈；(3)PKS可以通過酮基選擇性地還原和脫水，從而在終產物的相應位置形成酮基、羥基、雙鍵或亞甲基等功能團，同時也決定了手性中心的立體化學構型。目前已經揭示的聚酮合酶可以分為三類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［4］。研究和報道最多和較為透徹的是Ⅰ型PKS，它是由幾個多功能的多肽組成，每一個多肽上都分別攜帶有參與聚酮生物合成所必需的各種酶的結構域(domain)，每個結構域只參與整個聚酮碳鏈構建中的一步生化反應(noninterative)，而參與一輪聚酮生物合成反應的所有結構域稱為一個合成酶單位(SU,synthaseunit)，編碼這個合成酶單位的DNA稱為一個模塊(module)。Ⅰ型模塊結構的PKS就猶如在軌道上行駛的一列火車，在起點由特定的“搬運工”――?；D移酶(acyltransferase,AT)把不同的起始單位裝車后，通過“裝配工”――酮脂酰ACP合成酶(ketoacylACPsynthase,KS)經過縮合反應將不同的“原料”――羧酸起始或延伸單位進行組裝，隨著火車的運行，不斷地從一個“?？垦b配站”――酰基載體蛋白(acylcarrierprotein,ACP)到下一個，聚酮鏈也不斷地得到延伸，中途根據模塊組成的不同和指令要求，在其它不同的“特殊工種裝配工”――脫水酶(dehydratase,DH)、烯醇還原酶(enoylreductase,ER)的作用下相應地進行還原(形成β羥酯鍵)或脫水(形成α,β烯醇酯鍵)或進一步還原(形成飽和的亞甲基)，直至到達終點，在“裝卸工”硫酯酶(thioesterase,TE)的幫助下，完成最后的工序并將聚酮前體產物從PKS上卸載下來。這種PKS模塊結構的發現有其非同尋常的意義。盡管各種聚酮化合物結構各異，PKS模塊的底物特異性決定了I型PKS對起始單位和延長單位的選擇，而PKS每個模塊上還原結構域的種類則使聚酮產物得到不同程度的還原。復合聚酮化合物結構的多樣性來自聚酮骨架組成單位的多樣性和每個碳單位的不同還原程度，這意味著聚酮抗生素的結構具有相當大的可塑性，故可通過模塊內或模塊間的合理重組，設計出新基因(簇)組成或新的生物合成途徑，這也是I型PKS作為組合生物學主要研究對象的重要原因之一。Ⅱ型PKS是一個多功能酶復合體，只包含一套可重復使用(interative)的結構域，每一結構域在重復的反應步驟中被多次地用來催化相同的反應，其首次報道是在1984年［5］。以來自S.glaucescens的芳香族聚酮化合物tetracenomycinC研究的較多［6］，盡管已經發現了影響鏈長的兩個鏈長決定因子(CLF)KSα和KSβ，但確切機制仍然不是十分清楚。對Ⅱ型PKS的研究近年來也取得了一些進展，如Bao等［7］對柔紅霉素產生菌S.peucetius的研究結果顯示，dpsC基因決定了生物合成的起始單位，DpsC專一性地使用丙酰CoA為起始單位，一般來說，Ⅱ型PKS的起始單位均為乙酰CoA。另外，Bisang等［8］找到了Ⅰ型PKS和Ⅱ型PKS的鏈長因子之間的共同點，這是Ⅰ型和Ⅱ型PKS有機聯系的一個切入點。他們發現Ⅰ型PKS的KSQ(被認為可能是Ⅰ類PKS的鏈長因子)及Ⅱ型PKS的CLF和Ⅰ型PKS的KS結構域類似，惟一的區別是KS的活性中心殘基半胱氨酸被高度保守的谷氨酰胺代替，這個氨基酸對這一結構域的脫羧酶活性以及聚酮化合物的合成具有重要的作用。和Ⅰ型PKS相比較，Ⅱ型PKS在起始單位和延長單位的選擇方面變化不大，所以它的結構多樣性主要是來自于聚酮合成后的修飾步驟。1999年，日本東京大學的Funa等［9］發現了一種類似苯基苯乙烯酮合成酶的PKS(chalconesynthaselikePKS)――RppA，后來被稱為Ⅲ型PKS。RppA是一個在鏈霉菌中發現的與芳香族聚酮化合物苯基苯乙烯酮合成相關的酶，它是一種同二聚體酶并可重復進行縮合反應(interative)，催化芳香族聚酮化合物淡黃霉素(flavolin)生物合成。催化苯基苯乙烯酮(許多黃酮類化合物的前體物)形成的苯基苯乙烯酮合成酶被認為是植物所特有的，然而來自S.griseus的rppA基因所編碼的一個372個氨基酸的蛋白卻與苯基苯乙烯酮有著很大的同源性，它以丙酰CoA作為起始物，進行4個延伸反應將五肽釋放和環化成為1，3，6，8四羥基萘(THN)，THN將會被氧化成淡黃霉素，然后聚合成各種有色的化合物。由RppA催化合成的THN不僅是黑色素還是各種含萘醌環的次級代謝產物的中間產物。Ⅲ型PKS和其它兩種PKS迥然不同，它們不依賴于作為?；d體的ACP及其上的4′磷酸泛酰巰基乙胺。Ⅰ型和Ⅱ型PKS常常通過ACP活化酰基CoA的底物，而Ⅲ型PKS直接作用于?；鵆oA活化的簡單羧酸。盡管結構和機制不相同，但所有類型的PKS都是通過?；鵆oA的脫羧縮合和KS結構域或亞基催化CC鍵的形成。在進化關系上Ⅲ型PKS與其它PKS及已知的FAS也相距甚遠。在過去的十年里，隨著生物合成基因簇克隆方法學的創新以及DNA測序技術和生物信息學的不斷發展和研究成果的不斷積累，人們對于PKS的認識越來越全面，也越來越深入，但人們不禁還是想知道我們究竟對PKS了解多少？如今越來越多的報道顯示Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS并不能完全囊括不斷涌現出的新的聚酮合酶［4］。從結構的角度來看，有些Ⅰ型PKS的結構域也可以是被重復使用的，如AviM、CalO5、NcsB、SgcE和CalE8等；有些Ⅱ型PKS的結構域也可以是不能被重復使用的，如NonJKPQU；有些PKS似乎是Ⅰ型PKS和Ⅱ型PKS的雜合體，如LnmIJ/LnmG和PedFG/PedCD。從機制的角度來看，有些PKS依賴ACP，而有些PKS不依賴ACP。從合成的角度來看，有些PKS即可以催化形成CC鍵，也可以催化形成CO鍵，如NonJK。也許，我們眼前所發現和利用的PKS只是整個PKS龐大家族中的小小一員，更多更精彩的內容正等待人們去揭示。

2聚酮合酶的組合

生物合成自從以英國約翰英納斯中心(JohnInnesCentre)的DavidAHopwood為先驅的研究人員在鏈霉菌模式菌種――天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)中建立和發展遺傳操作系統以來，鏈霉菌的分子遺傳學一直成為國際生命科學領域的一個熱點。經過三十年廣泛而深入的研究，其中抗生素生物合成基因的克隆在抗生素領域已產生了深遠的影響。首先，這些基因的克隆和測序使我們對抗生素的特征有了新的認識，例如，對抗生素生物合成基因成簇排列規律的發現極大地幫助了新基因簇的克隆和分析。現代分子生物學技術使人們對抗生素有了更深入的了解的第二個方面是對聚酮類抗生素的認識。已知抗生素結構種類繁多，然而它們當中的最龐大的一類，包括大環內酯類、聚醚類、多烯類、蒽環類等都是通過聚酮合酶途徑合成的，聚酮鏈合成的底物選擇、還原程度和產物的立體化學構型都是由PKS上相應模塊中的結構域決定的，每個結構域的功能都一一對應在最終產物的結構上，這種多功能模塊化PKS中催化活性中心和化學合成步驟及終產物化學結構的一一對應關系，使得通過編輯生物合成基因來設計雜合產物成為可能，并由此產生出一個嶄新的研究領域――聚酮合酶的組合生物學。聚酮合酶的組合生物學就是通過基因工程等相關技術人為地對產生抗生素等微生物次級代謝產物合成途徑進行合理的改造，由此產生非天然的雜合基因或基因簇，從而形成新的非天然的天然聚酮化合物，與傳統組合化學的主要區別是它是在基因水平上由微生物來合成自然界原本并不存在的新化合物，而且這種化合物的數量是驚人的?？梢詮睦碚撋蟻硗扑阋幌峦ㄟ^聚酮合酶的組合生物學所衍生的聚酮化合物的潛力(CP,combinatorypotential)［10］。CP=ATL［ATE×4］MATL代表負責加載不同起始合成單位的AT結構域；ATE代表負責加載不同延伸合成單位的AT結構域；4代表由β酮基的經不同結構域催化形成產物的可能性；M代表基因簇中模塊的數目。這還不包括AT兩種立體化學可能性、KR結構域兩種立體化學可能性、加尾酶等其它可能增加產物數量可能性的因素。以一個像紅霉素這樣典型的包含6個模塊的PKS基因簇為例，若含有3種類型的AT(識別加載丙二酰CoA，甲基丙二酰CoA，乙基丙二酰CoA)，那么可能形成的聚酮化合物的理論值就接近10000000，這就為聚酮庫的建立奠定了堅實的理論基礎。縱覽聚酮合酶特別是Ⅰ型PKS組合生物學近十年來的發展，歸納起來采用技術有如下幾種［11～32］。

2.1聚酮合酶中模塊的減少聚酮鏈的構成單位與催化它形成的PKS模塊是一一對應的，因此，聚酮鏈的長度可以通過改變延長單位模塊的數目來完成，前提是最后一個模塊和環化酶結構域必須能夠識別非天然的中間產物。如前所述，在紅霉素PKS中，除了融合于模塊1中的兩個起始加載結構域(ATL和ACPL)和模塊6中的TE結構域外，有六個鏈延伸模塊分別位于DEBS1、DBS2和DEBS3中，紅霉素合成過程中內酯環的大小由DEBS中模塊數決定，利用基因工程方法重新調整TE的位置，使TE重新和一個、兩個、三個或五個DEBS模塊組合，結果產生了新的截短了的PKS，并合成了預期的二酮、三酮、四酮和六酮化合物，除二酮外，其它的幾個聚酮化合物都以內酯環形式存在［18，33～36］(圖1)。這些實驗表明，環化酶具有較廣的底物特異性，它的重新定位可以產生各種鏈長的聚酮。

2.2聚酮合酶中模塊的增加在基因中添加模塊直至2001年才獲得成功。Rowe等將來自S.hygroscopicus合成雷帕霉素PKS的模塊2、模塊5分別插入截短的DEBS1TE模塊1和模塊2之間，合成了在相應位置多出一個結構單位的四酮化合物；將雷帕霉素PKS的模塊2、模塊5分別插入全長DEBS的模塊1和模塊2之間，則合成了多出一個結構單位十六元環的聚酮化合物［36］(圖2)。

2.3聚酮合酶中模塊的替換在紅霉素DEBS1模塊1的N端，存在兩個起始加載結構域(ATL和ACPL)，它們負責紅霉素合成第一步反應――6dEB生物合成起始物丙酰CoA的選擇和加載，因此這兩個結構域也被稱為起始加載模塊(loadingmodule，LM)。已知不同的起始加載模塊對底物的選擇性不同，avermectin的起始加載模塊對起始物要求非常寬松，它可加載多達40余種不同化合物作前體［37］。Marsden用avermectin的起始加載模塊取代紅霉素的起始加載模塊構建的糖多孢紅霉菌突變體，通過添加不同的前體合成了新的C13位為異丙基、2丁基等紅霉菌A、B和D衍生物［38］(圖3)。Pfeifer用來源于合成利福霉素的起始加載模塊替換紅霉素的起始加載模塊也合成了在C13位結合苯環的紅霉菌衍生物［39］(圖3)。

2.4模塊中結構域的減少關于PKS基因工程改造的第一例成功的報道就是對紅霉素PKS模塊5中KR結構域的缺失失活。在紅霉素PKS模型提出時，為驗證模型的正確性，Donadio等通過同源重組同框缺失DEBS3中模塊5的KR5結構域的80個氨基酸，正如預料的那樣，突變體合成了新的在C5位是酮基的紅霉素衍生物5，6dideoxy3αmycarosyl5oxoerythronolideB［39］(圖4)。這不僅證實了6dEB生物合成模型的正確性，還給人們以極大的啟示：在DEBS中結構域的功能和結構是相對應的；DEBS以及6dEB后修飾酶對底物的要求并不十分嚴格，突變產生的中間產物能被下游的結構域有效的加工利用。另一個類似的實驗是針對DEBS2模塊4中烯?；€原酶結構域(ER4)的功能失活，它衍生的大環內酯中C6C7由單鍵變成了雙鍵［40］(圖4)。此外，還有一些關于使結構域功能喪失的成功報道，但主要是集中于與還原功能有關的KR、ER、DH結構域，這是因為它們決定了相應碳單位不同的還原程度，通過改變β酮基的還原程度可以產生更多的雜合聚酮。

2.5模塊中結構域的增加β酮基的還原程度不但影響聚酮碳骨架的多樣性，而且影響內酯化的方式和以羥基為中介進行的其A：紅霉素全長DEBS；B：只包含模塊1、2和TE結構域的截短了的紅霉素DEBS；C：只包含模塊1、2、3和TE結構域的截短了的紅霉素DEBS；D：只包含模塊1、2、3、4、5和TE結構域的截短了的紅霉素DEBS圖1聚酮合酶中模塊減少示意圖A：只包含模塊1、2和TE結構域的截短了的紅霉素DEBS；B：在截短了的紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個來自雷帕霉素PKS的模塊2(灰色區)；C：在截短了的紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個來自雷帕霉素PKS的模塊5(灰色區)；D：紅霉素全長DEBS；E：在全長紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個來自雷帕霉素PKS的模塊2(灰色區)；F：在全長紅霉素DEBS模塊1、2之間增加了一個來自雷帕霉素PKS的模塊5(灰色區)它官能團與聚酮的結合。KR結構域的增加或KRDH結構域的增加或KRDHER結構域的增加，都有可能影響β酮基的不同程度的還原而改變其它基團連接以及改變內酯環化的位點。McDaniel等將紅霉素PKS的模塊2的KR替換為來自于雷帕霉素PKS的模塊4的DHKR，相當于模塊2比原來多增加了一個DH結構域，使原有的羥基發生了脫水，形成了C=C雙鍵［16］(圖5)。同樣，Kao等將DEBS模塊2的KR替換為雷帕霉素PKS模塊l的DHERKR也得到了一個新的八元環化合物。用來自雷帕霉素PKS的模塊4的DH4KR4雙結構域(灰色區)替換只包含模塊1、2、3和TE的截短了的紅霉素DEBS的KR2結構域。

2.6模塊中結構域的替換不同PKS模塊選用不同的聚酮鏈延伸單位，延伸單位的選擇是由每個模塊的AT結構域控制的，AT結構域的替換也可以導致新的聚酮化合物的產生［41］，例如，用RAPS模塊2中具有丙二酰CoA特異性的AT2替代DEBS1TE中模塊1中具有甲基丙二酰CoA特異性的AT1，產生了預期的兩個新的三酮內A：只包含模塊1、2和TE結構域的截短了的DEBS；B：將avermectin的起始加載模塊(灰色區)取代紅霉素的起始加載模塊；C：紅霉素全長DEBS；D：將利福霉素的起始加載模塊(灰色區)取代紅霉素的起始加載模塊圖4聚酮合酶模塊中結構域減少示意圖圖5聚酮合酶模塊中結構域增加示意圖酯，這兩個新產物在內酯環的C4位都缺少了一個甲基［42］。在另外一個實驗中，用丙二酰CoA特異性的三個異源AT結構域來替代甲基丙二酰CoA特異性的DEBSAT1或AT2結構域，也產生了新的紅霉素衍生物。Lin等第一次嘗試在全長的PKS中進行結構域的替換，他們將紅霉素PKS模塊6的甲基丙二酰專一性AT替換成來自于雷帕霉素PKS模塊2的丙二酰專一性AT，結果在產物中產生在C2位缺少一個甲基側鏈的新化合物(圖6)。在6dEB的立體結構中，其羥基有S和R兩種構型，而羥基的構型由相應模塊中的KR酶域決定，通過替換KR酶域可以改變6dEB的立體結構。例如用雷帕霉素KR2替換紅霉素DEBS3中的KR6合成了3位羥基差向異構的6dEB衍生物［22］。

2.7前體指導下的新聚酮化合物的合成除上述方法外，還可用破壞PKS模塊1的KS結構域活性，再通過添加適當前體合成新的聚酮化合物［43，44］。Jacobsen等嘗試了用不同前體產生化合物的構想［44］，他們首先獲得了紅霉素合成途徑中第一步縮合步驟被阻斷的突變株，然后再通過外加不同的人工合成的小分子化合物，得到不同的聚酮化合物(圖7)。

3展望

自1990和1991年英國劍橋大學的PeterLeadlay和美國Abbott實驗室的LeonardKatz在紅霉素生物合成途徑中第一次揭示基因和酶所具有的模塊特征以來［45，46］，通過遺傳工程對模塊PKS基因進行可預測的人工改造已被各國研究人員所證實，利用模塊或結構域增加、減少、替換等多種組合生物學手段設計和改造基因簇，形成一系列非天然的天然性化合物，在藥物創新方面取得了一系列突破，這種突破不僅具有其重要的基礎理論的價值，也具有潛在的應用前景，但仍然存在許多未解之謎和艱難挑戰值得人們進行更深入研究和探索。一個重要的挑戰就在于盡管目前人們可以有的放矢地對PKS模塊或結構域進行基因的定向操作，但要面臨和解決的問題是這些發生了生物合成途徑變化所產生的新的結構中間體如何被下游的模塊或結構域或后修飾基因所“一視同仁”予以接納而發揮作用？這直接影響整個流水線的順利運轉和最后產量。隨著人們的努力，越來越多的呈模塊結構的聚酮生物合成途徑被發現，但仍然還不清楚哪些模塊或結構域必須存在于同一個多肽中才能發揮作用？哪些模塊或結構域可以以單個蛋白的形式來發揮功能？在這樣一條裝配線上，如果可以裝配的單個部件越多，那么可以想象通過排列組合所形成的產品的種類就越豐富。盡管如此，某個改造的特定的生物合成途徑目前只能產生一個或少數若干個新的產物，它仍然屬于低通量，還無法“隨心所欲”、“輕而易舉”地產生一整套包含多個不同突變的PKS，從而一次性地獲得結構特定而且種類繁多的新的聚酮化合物庫，這還有待于人們對聚酮中間物在PKS不同模塊之間轉運規律的深入揭示。此外，許多聚酮化合物在合成的初期往往是沒有生物學活性的，只有當其從PKS裝配線上釋放下來后經過一系列不同的后修飾，如氧化、糖基化等過程才最終完成。因此，這也為通過組合生物合成創造新產物提供了機會，例如可以通過改造和替換相應的后修飾基因來實現產物創新。除了對現有基因的人為改造之外，人們還在繼續從自然界中尋找更多、結構更新穎、活性更特別的新的“原材料”，在這些新的原材料發現的同時，也可能伴隨著新的生物合成途徑的揭示，這無疑也為新的非天然“天然產物”的創造帶來新的設計藍圖。另一個挑戰來自于從技術和應用的角度可用于聚酮化合物高效表達的宿主系統的發展和應用。

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