腸道營養干預管理論文

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【摘要】目的研究早期腸道營養對血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和氧自由基水平的影響以及對機體的保護作用，為臨床燒傷患者早期腸內營養支持治療提供依據。方法建立Wistar大鼠重度燒傷模型。隨機將燒傷大鼠分為禁食組(n=10)和早期腸內營養組(早期營養組n=10)，另設未燒傷的對照組(n=10)。禁食組和早期營養組于燒傷后48h內分別給予腹腔注射平衡液和胃灌注營養制劑，均為30ml/(kg•次)，每6h一次；其后自由進食至實驗后第7天。統計各組死亡率；檢測各組大鼠6、12、24、48h及第7天時TNF-α及氧自由基；電鏡下觀察創面成纖維細胞；蘇木精-伊紅染色觀察肝細胞變性情況。結果禁食組、早期營養組和對照組的死亡率分別為80%、30%、0。與對照組相比，禁食組大鼠血清TNF-α和丙二醛(MDA)水平明顯升高，而超氧化物歧化酶(SOD)水平明顯下降(P<0.05)；與禁食組比較，早期營養組TNF-α和MDA水平降低，SOD水平升高。早期營養組創面成纖維細胞超微結構受損程度低于禁食組，并發現凋亡的成纖維細胞。早期營養組大鼠肝臟脂肪變性程度較禁食組大鼠為輕。結論早期腸道營養能夠在整體水平降低TNF-α及氧自由基的表達，有利于局部創面愈合和減輕內臟損傷。

【關鍵詞】燒傷；氧自由基；腫瘤壞死因子α；腸內營養

StudyoftheexpressionofTNF-α,oxygenfreeradicalandtheeffectsofearly

enteralnutritioninterventioninratswithsereveburninjury

LIZhihua1,LIXiangnong2

(1.DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,

Jiangsu221002,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofenteralfeedingatearlystageontheexpressionofTNF-αandoxygenfreeradical(OFR)andtheprotectiveeffectsontheorganism,soastoprovidetheexperimentalbasisofclinicaltherapyofenteralfeedinginpatientswithsevereburns.MethodsThesevereburnmodelwasestablishedwithWistarrats.BurnedWistarratswererandomlydevidedintofastinggroup(n=10)andearlyenteralnutritiongroup(n=10)tocomparewiththecontrolgroup(n=10).Theratsinthefastinggroupandearlynutritiongroupweregivenintraperitonealinjectionofbalanceliquidandgastricclysisofnourishmentproductrespectively,30mlevery6hwithin48hafterburninjury.Subsequently,theratswereallowedaccesstofoodadlibitumuntil7thdayandthemortalitiesofthethreegroupswerecalculated.TheexpressionofbloodTNF-αandOFRofthethreegroupsat6,12,24,48,72handon7dweredetected.ThefibroblastsinthewoundwereobservedundertheelectronmicroscopeandthedenaturalizationofhepatocyteswasobservedbyH-Estainingunderthelightmicroscope.ResultsThemortalityoffastinggroup,earlynutritiongroupandcontrolgroupwas80%,30%and0,paredwiththecontrolgroup,thelevelofTNF-αandmalonaldehyde(MDA)obviouslyascended,whilethelevelofsuperoxidedismutase(SOD)obviouslydescendedinthefastinggroup(P<0.05).Comparedwiththefastinggroup,thelevelofTNF-αandMDAdescended,whileSODlevelobviouslyascendedinearlynutritiongroup(P<0.05).Theultrastructureoffibroblastcellsinthewoundofearlyenteralnutritiongroupwaslessseverelydamagedthaninthefastinggroup,accompaniedbyvisibleapoptoticfibroblasts.Thedegreeofhepaticsteatosisintheearlyenteralnutritiongroupwaslowerthaninthefastinggroup.ConclusionEarlyenteralnourishmentcouldreducetheexpressionofTNF-αandOFRonthewhole,andhelphealthelocalwoundsrelieveinjuriestotheviscera.

Keywords:burn;oxygenfreeradical;tumornecrosisfactor-α;entericnutrition

本實驗應用重度燒傷大鼠模型，探討早期腸內營養對腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達和氧自由基產生的影響以及早期腸內營養對重度燒傷機體的保護作用，為臨床重度燒傷患者的早期腸內營養(EN)治療提供理論依據。

1材料和方法

1.1實驗動物及試劑Wistar大鼠30只，雌雄不拘，體重（220±20）g，購于徐州醫學院實驗動物中心。大鼠飼養于恒溫(22～25℃)、恒濕的SPF（specificpathogenfreecondition）層流罩中，經高壓滅菌的標準飼料和水供動物自由飲食。動物實驗根據NIH實驗動物的護理和使用指導說明實施。

主要試劑包括TNF-αELASA試劑盒（北京幫定泰克公司）,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。主要儀器及設備有普通光學顯微鏡（Olympus公司）、TGL-16B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、H-600型透射電鏡（日立公司）、Spectrumlab22pc型分光光度計（上海棱光技術有限公司）及BIO-RAD550型酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2模型制備大鼠術前一天禁食過夜。2.5%戊巴比妥鈉35mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠固定于操作板上，8%硫化鈉制劑背部脫毛。3%凝固汽油涂抹背部燃燒18s致約30%燒傷體表總面積（TBSA）深Ⅱ度燒傷(病理證實)。擬燒傷面積按下列公式計算：燒傷面積(cm2)＝體表面積(cm2)×擬燒傷面積百分比(%)，體表面積(cm2)＝K×體重(kg)×2/3，K≈0.1)。燒傷后立即予腹腔注射平衡液50ml/kg復蘇。更換墊料，單籠飼養。

1.3動物分組及處理將20只燒傷大鼠隨機分為禁食組（n=10）及早期腸內營養組（早期營養組，n=10）。禁食組傷后2h開始腹腔注射5％葡萄糖鹽液30ml/(kg•次)，每6h一次。早期營養組傷后2h開始胃灌注，30ml/(kg•次)，每6h一次，所灌注的腸內營養制劑為能全力〔荷蘭Nutricia公司產品：4.18×103kJ/L，總熱量752.4kJ/(kg•d)，非蛋白熱量∶氮（NPC∶N）為133∶1〕。上述2組于傷后48h停止腹腔注射平衡液或胃灌注，自由進食。另設未燒傷大鼠10只為對照組，該組于整個實驗期間均自由進食。3組共喂養7天，7天后頸椎脫臼法處死取樣本。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠死亡情況記錄各組死亡大鼠死亡時間及數量。

1.4.2血清TNF-α及氧自由基檢測各組大鼠在傷后6、12、24、48h及7天時內眥靜脈取血0.5ml，1000r/min離心5min，取上清，-20℃保存，試劑盒檢測。中途死亡大鼠的標本棄之不用。

1.4.3肝組織切片蘇木精-伊紅染色檢查分別于第7天末，肝臟活體取材，利刃楔形切取少許肝組織固定于40g/L甲醛中，石蠟包埋，切片厚4μm，行蘇木精-伊紅染色，切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水等處理后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

肝臟脂肪變性的嚴重程度評估：根據肝細胞脂肪變性在肝臟的累及范圍將脂肪肝分為輕、中、重度。輕度：光鏡下（×400）每視野見1/3～1/2的肝細胞內含有脂滴。中度：每視野見1/2～2/3肝細胞有脂肪變性。重度：每視野2/3以上肝細胞發生脂肪變。

1.4.4創面組織電鏡觀察動物處死后剪取小塊燒傷創面組織放于下置有冰塊的蠟板上，其表面滴4℃預冷的3％戊二醛，用雙面刀片常規雙向切割創面組織成1.0mm×1.0mm×1.0mm大小的組織塊；浸入4℃預冷的3％戊二醛固定2h后過夜；然后脫水、包埋、超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸雙重染色。上透射電鏡觀察，拍照。

1.5統計學處理SPSS11.0統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，組間比較分別用用單因素方差分析（ANOVA）檢驗、秩和檢驗和Fisher′s確切概率法。P<0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1動物模型和動物死亡率動物模型的燒傷面積為（30±1）%TBSA。經病理證實，均為深Ⅱ度燒傷。

對照組大鼠麻醉清醒后活動正常。禁食組及早期營養組均出現較為明顯的感染癥狀，包括創面毀損、出血和膿性分泌物，大鼠的毛發無光澤并且有不同程度的脫落。對照組無死亡，禁食組于制模24h后4例死亡，早期營養組制模24h后1例死亡。7天后禁食組總死亡為8只，早期營養組總死亡為3只。見表1。表1各組大鼠死亡情況

2.2血清TNF-α變化模型制成后6h，禁食組及早期營養組血清TNF-α較對照組明顯升高，12h達到高峰，之后開始下降，但第7天時TNF-α水平仍高于制模后6h。早期營養組各時間點TNF-α水平均低于禁食組（P＜0.05），且于傷后12h差異最大（P＜0.05）。見表2。

2.3血清自由基的檢測模型制成后6h，禁食組及早期營養組血清SOD較對照組顯著降低，至第7天2組血清SOD水平仍維持在較低水平；禁食組各時間點的SOD水平均顯著低于早期腸內營養組（P＜0.05）。上述2組血清MDA水平于傷后6h顯著升高，至24h達到高峰，隨后開始下降；禁食組血清MDA水平在48h、7天時明顯高于早期營養組（P＜0.05）。見表3、4。表2各組大鼠血清TNF-α水平的變化與對照組比較：*P＜0.05；與禁食組比較：#P＜0.05表3各組大鼠血清SOD水平的變化與對照組比較：*P＜0.05；與禁食組比較：#P＜0.05表4各組大鼠血清MDA水平的變化與對照組比較：*P＜0.05；與禁食組比較：#P＜0.05

2.4肝組織光鏡檢查見圖1。禁食組大多數見廣泛且較嚴重的肝細胞混濁腫脹、胞質疏松、氣球樣變、嗜酸性變及脂肪變性；部分肝細胞有壞死。肝細胞脂肪變性以小泡性脂肪變為主，主要分布于肝腺泡Ⅲ區和Ⅱ區，嚴重者脂滴彌散性分布累及肝腺泡Ⅰ區。壞死肝細胞多位于肝小葉中央和中間帶，呈橋接樣壞死或大塊性分布。壞死灶內的肝細胞見核固縮、核碎裂或核溶解，胞質嗜酸性增強或含色素顆粒；壞死灶內或其周圍有明顯的庫普弗細胞增殖，其胞質豐富、嗜堿性，有不同程度的吞噬現象。肝竇內常見數量不等的各類型炎細胞，包括中性白細胞、單核細胞、淋巴細胞及壞死細胞(圖1b)。

早期營養組肝細胞也有輕度的混濁腫脹及胞質疏松,肝竇內有少量炎細胞浸潤。肝小葉脂肪變性范圍較小,表現為散在性或小灶狀肝細胞脂肪變性，主要分布于肝腺泡Ⅲ區和Ⅱ區，累及整個小葉者少見。部分肝竇內有散在的壞死細胞(圖1c)。

2.5創面組織成纖維細胞電鏡觀察早期營養組細胞明顯腫脹，胞質空淡，核周圍間隙增寬，核仁濃縮或邊集，并可見核膜內陷，形成核內小管及核內假包涵體。細胞凋亡并可見凋亡小體。常染色質減少，圖1各組大鼠肝組織病理檢查結果比較

（蘇木精-伊紅染色，×400）

a.對照組：正常肝組織；b.禁食組：重度脂肪變性;c.早期營養組：輕度脂肪變性

異染色質邊集。胞質內空泡形成,溶酶體增多，可見數量不等的圓形、低電子密度的脂肪空泡及腫脹、脫落的微絨毛。線粒體腫脹，嵴縮短、減少或消失，基質透明，甚至空化成囊泡狀；少部分線粒體則固縮，基質電子密度增加而均質化。粗面內質網增生、肥大或呈扁囊狀、囊泡狀擴張；增生的內質網密集成片，形成指紋狀結構或圍繞著變性的線粒體(圖2a)。

禁食組細胞體積增大，胞質疏松化，或胞質空淡；核膜完整，邊集?？梢姶置鎯荣|網代償性增生、擴張；線粒體輕度腫脹，基質淺淡，嵴模糊；細胞內脂肪空泡體積小，溶酶體、髓樣小體數量多(圖2b)。

3討論

3.1燒傷動物模型的特點與死亡率本實驗中采用凝固汽油造成的30%TBSA深Ⅱ度燒傷模型，具有以下特點：用創傷單相打擊，較好地模擬了臨床上全身炎癥反應綜合征（SIRS）及單相速發多器官功能不全綜合征（MODS）的發病過程；器官功能不全發生率高，有一定動物死亡率；重復性好；所用動物大鼠相對價廉易飼養，且檢測各項指標的試劑和儀器最齊全。

本實驗中禁食組及早期營養組于術后24h均出現較為嚴重的感染癥狀，包括創面毀損、出血，大鼠的毛發無光澤并且有不同程度的脫落等。2組大鼠于術后24h相繼出現死亡，但早期營養組在24h、48h、7天3個時間點上的死亡數及死亡率均低于禁食組，提示早期腸內營養有利于提高燒傷后生存率。本實驗中早期營養組和禁食組的總死亡數（分別為3只和8只）差別較大。

3.2局部創面變化創面愈合過程涉及一系列快速增長的細胞群，這些細胞群一旦完成了修復任務，就必須從創面消除，從而進入愈合過程的下一階段。文獻報道，在創面愈合過程中，生長因子減少或消失，可誘發生長因子依賴的成纖維細胞發生凋亡［1］。

表皮細胞生長因子（EGF）、TNF、前列素（PGE2）等均能促進細胞凋亡［2-3］，而這些因子和介質恰恰以較高的含量存在于創面微環境中［3-4］。Desmouliere等［2］利用末端標記技術證實傷口愈合后期，功能活躍的修復細胞以細胞凋亡形式消退，因而使修復細胞數量減少。深Ⅱ度燒傷往往導致真皮的嚴重損傷，其愈合主要依賴于創面形成肉芽組織支架，并在此基礎上借助于創面殘存附件上皮及創周表皮的增殖爬行覆蓋創面。膠原蛋白和成纖維細胞均為肉芽組織的主要成分；膠原蛋白在創面的沉積主要依靠成纖維細胞的合成與分泌，并主要與成纖維細胞的數量相關。

因此，成纖維細胞凋亡是創面進入愈合期的標志。Darby等［5］報道在創面閉合早期，創面內的肌成纖維細胞就發生凋亡，并且該作用對靶細胞是持續的。本實驗中，早期營養組成纖維細胞體積變小，呈現核固縮、染色體沿核膜聚集及胞質減少等退行性變細胞凋亡的表現，并可見凋亡小體；而禁食組成纖維細胞體積增大，胞質疏松化、空淡，核膜完整，邊聚?？梢娫缙跔I養組創面進入愈合期較禁食組早，提示早期營養有促進創面早期愈合的作用。

3.3肝臟病理研究的結果和意義燒傷主要死因是MODS，其發病機制公認為是嚴重燒傷后過度應激，發生SIRS。腸黏膜正常結構和功能的維持是腸道正常吸收和屏障功能的基礎。燒傷時，腸黏膜損傷，通透性增強，導致內毒素、細菌、細胞碎片等刺激腸相關淋巴系統，使腸黏膜成為大量炎性細胞因子的早期釋放器官；隨著腸黏膜通透性進一步增高，大量內毒素、細菌、細胞碎片進入肝臟，激活肝臟巨噬細胞系統，成為SIRS的主要原因［6-7］。一般認為，微循環障礙、嚴重感染和腸道細菌與內毒素移位是導致SIRS及MODS的機制［8］。而肝臟作為人體最大的化工廠和血庫，在上述3種病理生理改變中起著關鍵的作用。

本實驗試圖通過對肝細胞病理變化的觀察，從一個側面了解早期腸內營養對重要器官的干預結果。實驗結果顯示：早期營養組與禁食組均出現不同程度的肝細胞脂肪變性，但早期營養組脂肪變性程度較禁食組輕，2組間比較差異有統計學意義。這一結果顯示：燒傷早期腸內營養的干預可以顯著減輕肝臟的病理損害，可能有助于抑制SIRS及MODS的發生作用。

3.4細胞因子和氧自基的變化和意義TNF可刺激外周血多形核白細胞（PMN）生成、釋放和趨化反應，并活化產生大量毒性產物損傷組織細胞［9］。TNF對內皮細胞具有直接毒性，如作用于內皮細胞，使其表面成為促凝性致血栓形成；或使內皮細胞分泌遞質而使PMN黏附、活化。TNF又可作用于肝細胞抑制白蛋白的生成和促進某些急性期蛋白合成［10］。本實驗觀察到傷后6h血清TNF即顯著增高，至12h達到高峰。雖然隨后有所下降，但至7天時仍高于正常值，提示燒傷后有大量TNF產生；其產生機制可能與嚴重燒傷后發生的體液大量丟失或嚴重休克造成的組織缺血缺氧、壞死組織的大量產生、某些遞質如補體的活化以及應激反應等有關［11］，因為這些因素均可激活單核巨噬細胞系統(MPS)，從而使TNF大量產生。

3.5早期腸內營養嚴重燒傷后機體缺血/再灌注損害可生成大量氧自由基,后者可導致血管內皮細胞損害，使毛細血管通透性明顯增加［12］。由于腸黏膜上皮細胞富含黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，XO)，當腸黏膜發生缺血/再灌注后，將產生大量來源于黃嘌呤氧化酶系統的氧自由基，后者能攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，形成脂質自由基和脂質過氧化物［13］。本實驗中我們觀察到早期營養組SOD高于禁食組，而MDA則低于后者，提示早期腸內營養對抑制燒傷患者氧自由基的產生具有積極作用。

在重危感染患者，腸內營養的藥理作用大于其營養作用。EN之所以能改變疾病的治療效果，不僅是由于糾正患者的營養不足，更重要的是通過其中特異營養素的藥理學作用達到治療目的，如一些營養物質能以某種特定方式刺激免疫功能,恢復免疫反應，調控細胞因子的產生及釋放，維護腸道功能，即營養藥理（nutritionalpharmacology）或免疫營養（immunonutrition）作用。有研究表明［14］只要提供不低于所需總熱量20%的腸內營養就可避免腸道屏障功能的破壞與腸道細菌移位。

本研究結果顯示，燒傷后早期腸道營養可降低血中TNF-α和氧自由基水平、促進燒傷創面愈合并減輕內臟器官如肝臟的損傷，其機制尚不完全清楚。推測早期腸內營養有利于燒傷后整體調節和腸道的局部調節，既可以減輕應激、保護腸道黏膜、增加內臟血流量、減輕氧自由基損害，又可調理免疫和代謝，使營養支持更有效。

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