海馬神經元影響管理論文

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摘要：目的觀察鉛、硒對原代培養的海馬神經元生長及存活的影響，研究硒對鉛的神經細胞生長抑制的拮抗作用。方法建立新生Wistar大鼠海馬神經元原代無血清培養技術，通過PbCl2,Na2SeO3單獨及聯合作用，觀察神經細胞的生長和存活情況。結果10-5mol/L鉛明顯抑制了原代培養的海馬神經元突起生長，引起神經元存活率下降；單獨硒(2×10-6mol/L)有明顯促進海馬神經元突起生長的作用，尤其在神經元突起生長早期；但對海馬神經元存活率的影響不明顯。鉛和硒共同孵育時，培養早期硒能拮抗鉛對神經元突起延伸的抑制，但隨著培養時間延長，這種拮抗作用消失；從神經元存活率來看，在實驗劑量下，未見硒能拮抗鉛對神經元存活的抑制作用。結論鉛具有抑制神經元生長和存活的毒性，本實驗劑量下的硒在細胞培養早期有促進神經元突起生長和拮抗鉛對神經元生長和存活的抑制作用。

【關鍵詞】鉛；硒；海馬；神經元；神經突起

鉛具有顯著的神經發育毒性。毒理學實驗和人群流行病學調查表明，鉛能對神經系統造成不可逆性損害，嚴重損壞海馬神經元，影響學習、記憶及行為發育〔1，2〕。硒有防止鉛吸收和加速其排泄的作用，因此，硒有可能成為有效防治鉛神經毒性的重要資源〔3〕。為了解硒拮抗鉛神經毒性的效果和研究其拮抗作用機制，同時也為更多有效地利用硒，本試驗對體外原代培養的Wistar乳鼠海馬神經元進行低劑量PbCl2和Na2SeO3染毒，觀察低水平鉛、硒單獨和聯合作用對神經細胞生長和存活的影響。

1材料與方法

11材料

111試劑解剖液、種植培養液、無血清培養液［由98%Neurobasal培養基和2%B27(美國Gibco公司)無血清培養基添加劑和1%的青霉素、鏈霉素和005mol/L的谷氨酰胺(美國Sigma公司)組成］；胰酶、DNaseⅠ、左旋多聚賴氨酸和臺盼蘭(美國Sigma公司)；PbCl2(上海試四赫維化工有限公司)；Na2SeO3(天津化學試劑研究所)。神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗體和神經絲蛋白(NF)抗體(北京中山生物技術有限公司)。

112儀器CO2細胞培養箱(美國ShelLab公司)；全自動圖像分析系統(德國KONTRON公司)；圖像攝錄輸入儀(日本JVC公司)；倒置顯微鏡(德國ZEISS公司)。

113動物出生24h內Wistar大鼠(中山大學北校區動物中心)。

12方法

121海馬神經細胞的分散、移植和培養參考文獻〔4〕，將乳鼠全身消毒后分層剪開頭皮和顱骨，暴露兩側腦半球，分開顳葉皮層，暴露并取出海馬回，置解剖液中；清洗后剪碎成糊狀，0125%胰酶消化20min，終止消化后離心、過篩、CO2培養箱內培養。第2d更換無血清培養液，以后每隔2d換液1次，每次更換一半培養液。培養第2，3，4，5，6和7d在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

122分組及染毒設對照組、Pb組、Se組、Pb+Se組和先Pb后Se組。對照組加入30μl的磷酸鹽緩沖液，Pb組加入30μlNa2SeO3，Pb+Se組同時加入PbCl2和Na2SeO3各30μl，先Pb后Se組于培養第2d換液時加入30μl的PbCl2，次日半量換液并加入30μl的Na2SeO3。使PbCl2、Na2SeO3的終濃度分別為1×10-5mol/L和2×10-6mol/L。以后換液時補入相應量的PbCl2或Na2SeO3，維持終濃度不變。

123神經元存活率的測定每次到培養的時間終點，收集細胞，洗滌定容后取10μl細胞懸液臺盼蘭拒染法進行鏡下活細胞計數，獲得各個劑量組不同時間終點的活細胞總數，再分析與同一觀察時間的對照組的活細胞總數，比較計算各組細胞的相對存活率。

124神經元突起的測定倒置顯微鏡下(200×)，隨機選擇3個視野，利用圖像自動分析儀測量形態可辨的所有神經元突起的長度。

2結果

21海馬神經元形態觀察對照組和單獨硒作用組的海馬神經元鏡下呈圓形，體積小，透亮，散在分布；培養2h后開始貼壁，6h后絕大部分細胞已貼壁，光暈明顯；12h細胞幾乎全部貼壁，且長出短小的突起；2d后細胞有明顯增長的突起，胞體飽滿多數呈梭形、錐形，胞漿豐富，核大，核仁隱約可見，背景中可見極少數扁平狀多邊形的神經膠質細胞鋪墊；5～6d細胞相互間搭連成片，胞體間突起連接成網狀逐漸明顯；7d神經元數目不等地聚集成團，突起聯結成網。與對照組比較，單獨硒作用組的神經元胞體更豐滿，神經元突起更長、更粗壯。鉛單獨作用組(10-5mol/L)的神經元生長改變情況如下：(1)貼壁減少：24h后，培養基中懸浮細胞數目較對照組多，貼壁細胞數減少，致使細胞在培養皿底部分布不均勻；(2)生長遲緩：第3d與對照組比較，散在分布的小體積圓形透亮細胞仍然較多，形態和大小與細胞剛種植時的情形無明顯差別；(3)出芽延遲：對照組12～24h即可見短小突起，鉛細胞種植后第2d才開始看見細胞變成梭形，伸出短小突起；(4)碎片增多：倒置顯微鏡下的視野中懸浮細胞和死亡細胞的碎片較多，培養后第7d，培養皿中的神經元已極其稀疏；(5)成團提前：正常神經元在本培養條件下第7d可見明顯的成團現象，鉛組于第4d即可見神經元細胞5～10個聚齊成團，第5d可見成團細胞中間神經元邊界模糊，核仁消失，部分出現裂解，第7d成團神經元消失，皿中細胞數目顯著減少。鉛硒同時作用組神經元生長的改變情況與鉛作用組相似，也出現了貼壁減少、生長遲緩、碎片增多和成團提前的改變，但是二者不完全相同，鉛硒同時作用組神經元出芽晚于對照組但較鉛組早，培養第6和第7d，貼壁神經元數目明顯較鉛組多。先加鉛后加硒作用組早期改變與鉛組相同，但從培養第4d開始，與鉛組相比，貼壁神經元數目增多，細胞碎片減少，突起較多且較為粗壯。

22海馬神經元存活率分析(表1)表1可見，10-5mol/L鉛引起神經元存活率明顯下降；單獨硒(2×10-6mol/L)對海馬神經元存活率的影響不明顯；鉛硒同時孵育組，存活率最低，提示使用的硒作用劑量可能偏高。

表1Pb、Se對海馬神經元存活率的影響（略）

23海馬神經元突起長度分析(表2)表2可見，10-5mol/L鉛明顯抑制了原代培養的海馬神經元突起生長(P005)，單獨硒(2×10-6mol/L)作用有明顯促進海馬神經元突起生長的作用，尤其在神經元突起生長早期(P005)；鉛和硒共同孵育時，培養早期硒能拮抗鉛對神經元突起延伸的抑制(P005)，但隨著培養時間延長，這種拮抗作用變得不明顯。

表2Pb、Se對海馬神經元突起長度的影響（略）

注：與對照組比較，aP005；與Pb組比較，bP005；與Se組比較，cP005

3討論

低劑量的鉛一方面可以引起包括神經細胞在內的多種細胞發生凋亡〔4，5〕，另一方面可以通過多種途徑引發神經元死亡〔6，7〕。因此，本研究所觀察到的鉛抑制體外培養的神經元的存活，應該是鉛誘導神經元凋亡和誘發神經元壞死共同作用的結果。本次實驗發現，硒對體外培養的海馬神經元突起的生長有很明顯的促進作用，但作用機制不清楚，硒是否在神經元生長發育過程中參與了對神經細胞粘附因子(NCAM)表達調控需進一步研究。本實驗中未觀察到硒對體外培養的海馬神經元的存活有明顯的影響。鉛硒共育組較鉛組在神經元突起長度上存在差異，尤其在生長早期，提示硒對鉛抑制神經元突起生長具有一定的拮抗作用，至于這種拮抗作用隨培養時間延長而逐漸減弱至不顯著，認為可能與鉛的毒作用劑量過高有關，從神經元存活率的結果也能反映這一點，由于高劑量的鉛導致對神經元生長的累積毒效應已經超過了硒的拮抗能力。提示應進一步降低鉛的毒作用劑量再進行觀察研究。

參考文獻

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