人類白細胞抗原基因管理論文

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摘要：目的研究人類白細胞抗原(HLA)-DR3、DR7、DR13、DR53等位基因與乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)宮內感染的關系，探討HBV宮內感染的遺傳易感性，確定HBV宮內感染的易感基因和保護基因。方法采用聚合酶鏈反應/序列特異性引物(PCR-SSP)技術檢測HBsAg陽性孕婦及其新生兒各187例外周靜脈血血塊中HLA-DR3、DR7、DRl3、DR53等位基因型分布及頻率。結果(1)宮內感染組孕婦HLA-DR3基因頻率為2414％(7／29)，顯著高于非宮內感染組孕婦的633％(10／158)(P=0007)。其余各表型比較，差異無統計學意義(P>005)。(2)宮內感染組新生兒HLA-DR3基因頻率為1724％(5／29)，顯著高于非宮內感染組新生兒的506％(8／158)(P=0033)。其余各表型比較，差異無統計學意義(P>005)。(3)母嬰HLA-DR3同陽性在宮內感染組與宮內未感染組間比較差異有統計學意義(P=0049)；母嬰HLA-DR7、DR13、DR53同陽性在宮內感染組與宮內未感染組間比較，差異無統計學意義(P>005)。結論HBsAg陽性孕婦及其胎兒同時或任一攜帶HLA-DR3，易導致HBV宮內感染；HLA-DR3是HBV宮內感染的易感基因。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒；宮內感染；人類白細胞抗原DR等位基因(HLA-DR)

肝炎是一種嚴重危害人類健康的世界性傳染病，我國是乙肝高發區，乙肝病毒的母嬰傳播不僅造成人群中眾多的HBsAg攜帶者，而且是引起成人慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要因素。迄今，多數學者認為，人類白細胞抗原DR等位基因(HLA-DR)與乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相關，而HLA-DR等位基因與HBV宮內感染的關系爭議較多。本文通過研究HLA-DR3、DR7、DR13、DR53與HBV宮內感染的關系，探討HBV宮內感染的遺傳易感性，為防制HBV宮內感染提供理論依據。

1對象與方法

11對象以2003年6月～2004年11月太原市省各市級醫院篩檢，并在太原市傳染病院婦產科進行產前檢查及分娩的HBsAg陽性孕婦及其新生兒各187例作為研究對象。并根據新生兒有無宮內感染，分為宮內感染組(29例)和宮內未感染組(158例)，2組在年齡分布、文化程度、職業構成等均衡可比。

12方法

121標本采集及處理收集孕婦肘靜脈血及新生兒出生24h內且未注射高效價免疫球蛋白(HBIG，hepatitisBimmuneglobulin)的股靜脈血各2ml，4℃冰箱保存，6h內以4000r/min4℃離心15min，分離血清與血塊，-20℃保存備檢。

122乙肝血清標志物檢測采用酶聯免疫吸附(ELISA)法，試劑盒（上?？迫A實業總公司）。

123HBVDNA檢測(1)HBVDNA提?。簠⒖嘉墨I〔1〕，采用異硫氰酸胍一步法提取血清DNA；(2)HBVDNA的擴增：采用巢式聚合酶鏈反應(nPCR)。

124HLA-DR等位基因檢測(1)人類基因組DNA的提取十二烷基磺酸鈉（SDS）蛋自酶K法提取血塊基因組DNA。(2)HLA-DR等位基因擴增：參考文獻〔2〕的引物設計采用聚合酶鏈反應／序列特異性引物(PCR-SSP)技術檢測孕婦及其新生兒外周靜脈血血塊中HLA-DR3、DR7、DR13、R53基因型分布及頻率。(3)PCR產物的檢測：取擴增產物5～10μl，按5：1(V：V)與溴酚蘭混勻，加樣于15％瓊脂糖凝膠(含05μg／ml溴化乙錠)板，在60V／cm電壓下泳動50min，紫外燈下觀察結果。

125新生兒HBV宮內感染診斷標準新生兒外周血血清HBsAg和/或HBVDNA陽性，即診斷為HBV宮內感染。

13統計分析

資料輸入SPSS115軟件進行統計分析；計算各指標的陽性率，四格表χ2、Fisher確切概率、OR值及OR95%CI。

2結果

21HBsAg陽性孕婦及其新生兒HLA-DR擴增圖譜提取的血塊DNA經PCR擴增后呈現明顯條帶，與標準分子標記物（Marker）條帶比較，確定HLA-DR基因型（圖1，2，3，4）。中國論文聯盟

DR3+：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR3陽性擴增產物，擴增產物片斷長度為151bp;DR3-：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR3陰性擴增產物；M：標準分子標記物(Marker)

圖1HLA-DR3等位基因的PCR擴增產物電泳結果（略）

DR7+：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR7陽性擴增產物，擴增產物片斷長度為232bp；DRT-：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR7陰性擴增產物；M：標準分子標記物(Marker)

圖2HLA-DR7等位基因的PCR擴增產物電泳結果（略）

DR13+：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR13陽性擴增產物，擴增產物片斷長度為130bp；DR13-：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR13陰性擴增產物；M：標準分子標記物(Marker)

圖3HLA-DR13等位基因的PCR擴增產物電泳結果（略）

DR53+：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR53陽性擴增產物，擴增產物片斷長度為213bp；DR53-：HBsAg陽性孕婦或其新生兒DR53陰性擴增產物；C：內對照

注：DR53引物與內對照引物可能發生了引物間的錯配等，故分管同時擴增

圖4HLA-DR53等位基因的PCR擴增產物電泳結果（略）

22HLA-DR與HBV宮內感染的關系

221孕婦HLA-DR等位基因分布及頻率比較（表1）宮內感染組孕婦HLA-DR3基因頻率明顯高于宮內未感染組，經檢驗，差異有統計學意義（OR=4709,P=0007）；HLA-DR7、DR13、DR53基因頻率在宮內感染組與宮內未感染組孕婦比較，經檢驗，差異無統計學意義（P>005）。

表1宮內感染組與宮內未感染組孕婦HLA-DR基因分布及頻率比較（略）

注：*為fisher確切概率法計算結果

222新生兒HLA-DR等位基因分布及頻率比較(表2)宮內感染組新生兒HLA-DR3基因頻率明顯高于宮內未感染組，經檢驗，差異有統計學意義(OR=3906，P=0033)；HLA-DR7、DR13、DR53基因頻率在宮內感染組與宮內未感染組新生兒比較，經檢驗，差異無統計學意義(P>005)。

223母嬰HLA-DR等位基因同陽性分布及頻率比較（表3）母嬰HLA-DR3同陽性在宮內感染組與宮內未感染組間比較，經檢驗，差異有統計學意義（OR=596,P=0049），母嬰HLA-DR7、DR13、DR53同陽性在宮內感染組與宮內未感染組間比較，經驗驗，差異無統計學意義（P>005）。

表2宮內感染組與宮內未感染組新生兒HLA-DR基因分布及頻率比較（略）

注：*為fisher確切概率法計算結果

表3宮內感染組與宮內未感染組母嬰HLA-DR同陽性分布及頻率比較（略）

注：*為fisher確切概率法計算結果

3討論

KilpatrickDC〔3〕的研究發現，HLA-A3是人類免疫缺陷病毒(HIV)宮內感染的保護基因，HLA-DR3是HIV宮內感染的易感基因。BosiL等〔4〕采用Logistic回歸分析發現，HLA-DR13與發生HCV宮內感染呈負相關，即HLA-DR13是HCV宮內感染的保護因素。在母親同時感染HIV者中，HLA-DR13和HIV同時感染在HCV宮內感染的發生中具有獨立而相反的作用，即HLA-DR13是HCV宮內感染的保護因素；HLA-DR13表達在未發生HCV，宮內感染和發生了HCV宮內感染者的OR值為84(95％CI=11～608)，且母乳喂養不影響該HCV宮內感染的危險度。王素萍等〔5〕以HBsAg陽性孕婦新生兒為研究對象，隨機選擇發生及未發生HBV宮內感染的新生兒各20例，應用試劑盒提供的序列特異性引物(sequencespecificprimers,SSP)采用PCR-SSP技術擴增HLA-DR基因區18對等位基因，判定HLA-DR抗原的型別，計算HLA-DR抗原各型別出現頻率并分析其在2組間的差別，發現DR3、DR51在宮內感染組的頻率較高，分別為45％，40％。在非宮內感染組分別為20％，15％，P值分別為018，016。DR53在非宮內感染組的頻率較高，為60％，在宮內感染組為35％。推測HLA-DR3、DR51可能是HBV宮內感染的易感型，而DR53有可能是具有保護作用型別。劉海英等〔6〕采用PCR-SSP法合成相應的特異性引物序列，對HLA-DR3、DR4、DR13、DR15進行研究。結果顯示，宮內感染組孕婦HLA-DR3的基因頻率為50％，顯著高于宮內未感染組的147％(RR=58，χ2=490,P<005)，其余各基因表型比較，差異無統計學意義；宮內感染組新生兒HLA-DR3的基因頻率為30％，明顯高于宮內未感染組的74％，但差異無統計學意義(P>005)，提示孕婦或胎兒攜帶HLA-DR3，易導致HBV宮內感染，即孕婦或胎兒HLA-DR3陽性是HBV宮內感染的易感基因。本文同樣采用PCR-SSP技術研究HLA-DR特異性等位基因與HBV宮內感染的關系。結果表明，HBsAg陽性孕婦及其胎兒同時或任一攜帶HLA-DR3，易導致HBV宮內感染；HLA-DR3是HBV宮內感染的易感基因。提示在防制HBV宮內感染時不能忽視人類遺傳因素的作用，應采取綜合措施防制HBV宮內感染。

參考文獻

〔1〕向海平，郭雁賓，孟慶華，等.聚合酶鏈反應定量檢測乙型肝炎病毒DNA及其臨床意義分析［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，1999，13（1）：89-90.

〔2〕OlerupO,ZetterquistH.HLA-DRtypingbyPCRamplificationwithsequencespecificprimers(PCR-SSP)in2hours:analternativatoserologicalDRtypinginclinicalpracticeincludingdonor-recipientmatchingincadaverictransplantation［J］.TissueAntigens,1992,39:225-229.

〔3〕KilpatrickDC,HagueRA,YapPL,etal.HLAantigenfrequenciesinchildrenborntoHIV-infectedmothers［J］.DisMarkers,1991,9(1):21-26.

〔4〕BosiI,AncoraG,MantovaniW,etal.HLA-DR13andHCVverticalinfection〔J〕.PediatrRes,2002，51(6)：746-749.

〔5〕王素萍，孔憲毅，薛淑蓮，等.HLA-DR抗原與HBV宮內感染關系研究［J］.中國公共衛生，2003，19（7）：772-774.

〔6〕劉海英，孔北華，羅霞，等.乙型肝炎病毒母嬰垂直傳播與人類白細胞抗原DR區域基因相關性的研究［J］.中華婦產科雜志，2003，38（10）：599-603.