細胞生物學研究進展范文

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篇1

與臨床病理學相比，腫瘤分子生物學標記為腫瘤生物學行為的分析、治療方式的選擇、臨床預后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，全文就目前國內外對膀胱移行細胞癌分子生物學標記物的研究概況作一綜述。

【關鍵詞】 膀胱移行細胞癌　標志物　分子生物學　免疫學

膀胱移行細胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易復發性，腫瘤細胞易于種植轉移，臨床上僅根據腫瘤病理判斷預后較為困難。鑒于此，目前對其分子生物學標記物的研究愈來愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文獻報道分析了相關分子生物學標記物與泌尿系統上皮腫瘤的病理分級、臨床分期、復發及生存率的關系，為診斷腫瘤、制定正確的治療方案及判斷預后等提供重要的信息，本文就目前已報道的分子生物學標記物作一綜述。

1　癌基因與抑癌基因

1.1　p53

p53的突變或丟失在膀胱癌的檢出率為50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年齡膀胱癌患者的p53表達，發現p53異常表達在小于45歲的膀胱癌患者更為常見。大量研究表明，p53的改變與膀胱癌的分期、分級、侵襲性有關，但其是否與膀胱癌的復發及生存率相關仍有爭議。Yeniyol等[2]采用免疫組化檢測48例膀胱移行細胞癌標本中p53的表達，p53異常表達在不同臨床分期和病理分級間差異顯著，但未發現p53陽性組與陰性組腫瘤復發率和死亡率有明顯差異。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出類似的結論。但另有多篇文獻報道，p53與膀胱癌的復發率和死亡率顯著相關。Sanchez等[4]報道復發的膀胱癌（n＝47）p53的異常表達明顯高于未復發者，p53的異常表達與膀胱癌的進展和生存率相關。Wolf等報道p53異常表達與pT1G3膀胱癌（n＝30）的預后關系密切。

p53突變可能與膀胱原位癌（CIS）的生物學行為有關，導致CIS的侵襲性增加，Shariat等[5]檢測47例膀胱CIS的p53及其中39例標本的p21表達，p53/p21聯合分析顯示出與腫瘤的復發、進展及生存率之間密切的相關性，p53（+）/p21（+）患者腫瘤復發進展和死亡的危險程度遠大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。

1.2　p21

關于p21與膀胱癌的報道結果并不統一，Chatterjee等[6]檢測p53、p21、pRb在164例TCC標本中的表達，結果顯示p53、p21、pRb可作為判斷TCC復發率和5年生存率的獨立因子，三者聯合分析顯示出與TCC預后之間良好的相關性。Kuczyk MA等也認為p21WAF/CIP1可以作為判斷膀胱癌生存率的獨立預后因子。Liukkonen等[7]檢測207例膀胱癌(pTa～pT1)標本中p21WAF1/CIP1和細胞周期素D1的表達，平均隨訪4.9年，分析其與腫瘤分期、分級、細胞增殖率（MIB?鄄1指數）、p53、bcl?鄄2、生存率的關系。結果只有MIB?鄄1指數與無瘤生存率顯著相關（P=0.03），腫瘤復發率只與腫瘤分級（P=0.002）和細胞周期素D1的表達相關（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1與其他因子相比預后作用較小，有關p21WAF1/CIP1在判斷膀胱癌預后中的意義有待進一步闡明。

1.3　p16 /CDKN2A

Hitchings等[8]檢測78例TCC 標本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表達，多因素分析顯示任何兩者的改變與腫瘤的進展密切相關，p53和 p16同時表達異常者腫瘤的進展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用來判斷pTa～pT1期膀胱腫瘤的進展情況。Benedict等發現腫瘤標本中p16/CDKN2A的表達與Rb的表達呈負相關，Rb強染色的標本罕見p16陽性染色，同時，伴染色體9p21的雜合丟失的腫瘤p16/CDKN2A失表達，Rb強表達。Primdahl等發現初診即為浸潤型膀胱癌p16/CDKN2A的表達顯著低于繼發于Ta 或T1的浸潤期腫瘤，有關進一步解釋尚待研究。

1.4　Rb

Sanchez Zalabardo D等[4]隨訪47例浸潤型膀胱癌患者，發現Rb表達異常的患者腫瘤進展速度、復發率顯著升高。Sunanda等檢測164例TCC標本pRb的表達，得出結論pRb可作為判斷TCC復發和生存率的獨立預后因子。另有報道對45例T1期膀胱腫瘤患者隨訪發現Rb基因的丟失與pRb的異常表達明顯導致患者無瘤生存率降低，此外，多篇文獻報道Rb在與p21、p16、Ki67、p53等聯合判斷膀胱癌預后時表現出良好的相關性，可作為較理想預后因子。

2　細胞增殖相關指標

細胞核相關抗原（Ki67）是增殖性細胞核的標記物，可通過單克隆抗體MIB?鄄1檢測，其在判斷膀胱癌預后中的重要意義被越來越多的作者證實。Migaldi等發現老年患者膀胱癌標本MIB?鄄1指數高于年輕者，并且與膀胱癌復發率、生存率密切相關[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究發現Ki67是膀胱癌良好的獨立預后因子。

Frank等[10]選取伴區域淋巴結轉移的尿道膀胱腫瘤139例，手術切除腫瘤并行化療，隨訪分析p53和MIB?鄄1在判斷腫瘤預后及化療療效中的作用，結果并未發現p53和MIB?鄄1與該類腫瘤患者的預后具有顯著性相關，但MIB?鄄1指數與腫瘤的化療療效呈顯著負相關，提示MIB?鄄1可以作為判斷膀胱癌化療療效的指標，指導臨床治療。同樣，Matsumoto等對62例膀胱移行細胞癌（pT1G3～pT4M0）標本進行類似研究，平均隨訪34個月，發現Ki67的表達與腫瘤化療完全緩解率顯著性相關，能較好地判斷療效。

3　細胞凋亡相關指標

3.1　bcl?鄄2/bax

bcl?鄄2被認為是抑制細胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax屬于凋亡調控基因bcl?鄄2 基因家族， 分別能夠阻遏和促進凋亡， bax?鄄bax同源二聚體促進凋亡，bcl?鄄2?鄄bax異聚體阻遏凋亡，突變的p53蛋白可起到與bcl?鄄2蛋白類似的作用，并抑制bax基因的轉錄，進而抑制凋亡。

Uchida T等觀察到119例膀胱癌患者中p53的表達與腫瘤分期分級相關，bcl?鄄2表達與腫瘤臨床病理特征無關，但p53和bcl?鄄2同時過表達提示不良預后[11]。Wolf、Gazzaniga等也證實bcl?鄄2的表達與腫瘤復發率和無瘤生存率明顯相關。但 Asci R等[12]報道年齡小于40歲患者TCC細胞漿bcl?鄄2和p53的表達分別為54%、37%，與腫瘤的進展無明顯相關。同樣，Fraile、Stavropoulos等報道bcl?鄄2的表達與膀胱癌的分期、分級及復發率無明顯相關，提示有關bcl?鄄2的作用仍需進一步研究。

3.2　Fas/FasL

Fas與FasL都是跨膜蛋白，分別屬于TNF受體和TNF家族，T淋巴細胞和NK細胞的活化可導致細胞表面FasL被激活，與Fas結合，使表達Fas的細胞發生凋亡。Lee SH等檢測37例膀胱癌標本，Fas/FasL的高表達達到92％。Lee等報道43例膀胱腫瘤標本28％有Fas基因的突變。目前對血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究較多，Mizutani等[13]報道sFas或sFasL的升高預示Ta期膀胱癌患者早期復發的可能，sFas或sFasL可作為判斷Ta期膀胱癌復況的預后因子。

4　血管形成因子

4.1　VEGF

與大多數實體瘤一樣，膀胱癌的形成也具有血管形成依賴性，與血管內皮生長因子VEGF關系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧誘導因子(HIF?鄄1α)之間的關系及兩者在TCC中的預后意義，結果顯示HIF?鄄1α與腫瘤病理分級顯著相關，VEGF和微血管密度（MVD）與腫瘤分級和臨床分期顯著相關。HIF?鄄1α與VEGF和MVD顯著相關，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，導致腫瘤預后不良。同樣，Santos（n＝66）也報道VEGF可作為判斷膀胱上皮腫瘤的預后因子。

4.2　血栓黏合素?鄄1

血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是細胞外基質中的一種糖蛋白，分子量為430kD。TSP?鄄1被認為是惟一抑制腫瘤血管形成的物質。Grossfeld等[15]分析了163例TCC標本TSP?鄄1、p53的表達與TCC復發生存率之間的關系，TSP?鄄1表達與TCC復發 （P=0.009）和生存率（P=0.023) 顯著相關，低表達TSP?鄄1患者腫瘤復發率增高，生存率降低。

5　生長因子及受體

5.1　EGFR

EGFR在眾多上皮腫瘤中有較高的陽性表達，Colquhoun等[16]綜述了近年來有關EGFR與膀胱癌的研究，得出結論EGFR的表達與膀胱癌的分期、分級、復發率、無瘤生存率明顯相關，EGFR過表達提示腫瘤預后不佳，使用抑制EGFR活性的物質如ZD 1839等可望成為臨床治療膀胱癌等的新手段。

5.2　TGFα

TGFα在膀胱癌中的表達顯著高于正常膀胱組織，Ravery等報道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表達，且與腫瘤死亡率顯著相關。Ravery等分析28例早期膀胱腫瘤TGFα?鄄mRNA的表達，隨訪兩年發現其與腫瘤復發顯著相關，對判斷早期膀胱腫瘤的預后有重要價值。Thogersen等則報道TGFα與EGFR的表達相關，但與患者生存率無明顯相關，其在判斷膀胱癌預后中的作用有待研究。

6　細胞外基質與細胞黏附分子

6.1　MMPs

Hara等[17]分析51例表淺TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)與腫瘤復發率間的關系，復發組MMP?鄄9的表達是未復發組的2.5倍，未發現MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表達的差異，MMP?鄄9高表達組無瘤生存率顯著低于正常表達組。同樣，Ozdemir等檢測60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表達，發現只有MMP?鄄9的表達與腫瘤的分期分級相關。Papathoma等報道隨著尿路上皮腫瘤分級和浸潤程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表達顯著升高，但兩者與腫瘤的復發率無明顯相關，提示其在判斷膀胱癌轉移和預后中的意義仍有待研究。

6.2　E?鄄鈣黏蛋白

E?鄄鈣黏蛋白的表達與腫瘤分化、癌細胞侵襲能力及轉移可能相關。Shahrokh等檢測53例膀胱CIS標本E?鄄鈣黏蛋白的表達，隨訪131個月，多因素分析表明E?鄄鈣黏蛋白是與CIS復發、進展、無瘤生存率顯著相關的獨立因素，提示E?鄄鈣黏蛋白異常表達的腫瘤侵襲性高，需要早期徹底治療。Rao等分析細胞支架蛋白－肌動蛋白（Gelsolin）和E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預后中的意義，結果示Gelsolin與膀胱癌進展和復發密切相關，但未發現E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預后中的顯著意義，其在判斷膀胱癌預后中的意義還有待明確。

與臨床病理學相比，腫瘤分子生物學標記為腫瘤生物學行為的分析、治療方式的選擇、臨床預后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，深入研究此類標記十分必要。目前對泌尿系統上皮腫瘤分子生物學標記物的研究雖已取得進展，但除了對個別標記物Rb、Ki67的意見較為統一外，對絕大多數標記物在腫瘤中的表達分布及預后價值仍存在爭議，目前的文獻報道多存在樣本量小的問題，缺少大規模研究的支持，再加上免疫組化法檢測蛋白受抗體選擇、陽性結果判斷、手工操作等外在因素影響的問題，導致研究結果之間缺乏可比性或對同類研究對象得出相反的結論，因此需要將實驗方法標準化以提高研究的可靠性和可重復性。此外，由于腫瘤的進展和轉移是涉及多種分子機制的極其復雜的過程，僅憑對單一預后指標的評估不能全面準確地反映腫瘤的惡性潛能，腫瘤免疫標記物最終的臨床應用可能是多個指標的綜合評估。

參考文獻

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篇2

【關鍵詞】細胞生物學；教學模式；

【前言】細胞生物學是生命科學中既基礎又前沿的一門學科，它是我國基礎學科發展規劃中的四大基礎學科之一[1]。細胞生物學是生命科學各個分支學科在細胞層次上的交匯，它從顯微、亞顯微和分子水平對細胞的各種生命活動開展研究，進而探討人體細胞結構、功能、發生、發展、衰老和死亡的生命活動規律及發病機理，是高等醫學院校的核心主干課程之一。

進入21世紀以來，細胞生物學的研究發展迅猛，新知識、新方法、新成果層出不窮，傳統的以教師為主的課堂教學模式已無法滿足新形勢下培養高素質人才的要求[2]。如何在有限的課堂教學學時內，切實提高教學質量與效果，讓學生在完整系統地掌握細胞生物學基礎知識的同時，及時了解細胞生物學的最新研究進展及其在臨床醫學中的應用，是目前亟待解決的問題。因此，對現有的教學手段和方法進行優化與改革，探索出符合時代要求的新的細胞生物學教學模式勢在必行。

1、高等醫學院校細胞生物學的教學現況

目前，大多數醫學院校的細胞生物學理論教學存在兩個主要問題：一是學時少，二是內容繁雜、抽象、枯燥且知識點瑣碎。作為醫學基礎的必修課程，我校的細胞生物學安排在大學一年級的第二學期，理論授課采用大班（130人左右）傳統的講授式教學法（LectureBasedLearning，LBL），即以教師為中心，以系統授課為導向的教學方法，這一方式雖可以系統講解基礎知識，但不利于學生自主學習能力的培養[3-4]。而病例教學法（CaseBasedLearning，CBL）是以典型病例為先導，將臨床與相關基礎問題相結合，以學生為主體的啟發式教學方法[5-6]。這種教學方式雖能克服LBL的不足，提高學生的學習主動性和積極性，但是否適合在超過百人的大班授課過程中實施，仍有待商榷。針對我校現存的細胞生物學的教學現狀，我們采用CBL與LBL相結合的教學方法，以期探索出適合我校的切實可行的細胞生物學教學模式。

2、引入臨床案例，提高學生的學習興趣

我校臨床醫療專業的細胞生物學理論教學只有28學時，學時相對緊張，因此我們在授課方式上采用靈活多變的教學模式。對于教材中理論性較強，通俗易懂的知識，仍采用傳統的LBL方式講授，而對于一些難點、重點且與臨床結合緊密的知識點則采用CBL模式。在CBL教學過程中，案例的選擇與問題的設計是關鍵。教師在備課過程中，搜集與授課章節密切相關的常見病例，查閱文獻資料，對病例進行適當的修改和補充，進而編寫成教學病例，并設計相關問題。例如在講授細胞膜物質運輸時，引入“家族性高膽固醇血癥”，引導學生學習受體介導的胞吞作用；利用“矽肺”病例，講解溶酶體膜穩定性的重要；通過囊性纖維化（CysticFibrosis，CF）病例分析，引導學生學習蛋白質在內質網腔中正確折疊的重要性。CBL改變了傳統的教師講、學生聽的教學模式，學生成為案例分析和課堂討論環節中的主體。學生通過學習、研究案例來掌握基礎理論知識，變抽象為具體，而不再是死記硬背單一的知識點，這充分調動了學生學習的主觀能動性，提高了學生的邏輯推理能力，同時也促進了其分析問題、解決問題能力的逐步提升，對學生綜合素質的培養及日后從事臨床工作頗有益處。

3、多媒體教學和網絡學習相結合

醫學細胞生物學的某些理論知識相對抽象、晦澀，因此在以LBL為主進行授課時，PPT課件的制作至關重要。我們力求在每一章節的授課過程中將圖片、動畫與視頻相結合，圖文并茂，充分調動學生的學習興趣，從不同的角度吸引學生的注意力。在充分利用多媒體這一教學手段的同時，我們還利用學校覆蓋全面的無線網絡，將教學過程延展到校園的每一個角落。目前，我校的細胞生物學已成功獲批遼寧省精品資源共享課，課程建設已順利完成。因此，教師可以將教學網站提供給學生，方便學生及時查閱PPT課件、課后自測習題、拓展學習等教學相關資料。同時，我們的SPOC網絡教學平臺也于2018年3月建設完成并投入使用，該平臺的應用進一步夯實了網絡教學基礎，也在一定程度上解決了課堂教學學時緊張的問題。另外，我們還建立了細胞生物學教研室的教學公眾號，定期推送細胞生物學研究的最新進展，課后教師和學生還可以利用微信群和QQ群進行交流與學習的互動。

4、優化理論教學內容，拓展研究型課堂

作為醫學基礎課程，細胞生物學與生物化學、生理學等其他課程的內容有部分的重疊和交叉，為了避免不必要的重復，保證細胞生物學與其他課程知識的緊密銜接，教研室與相關課程的授課教師進行溝通，刪減醫學細胞生物學與其他學科的部分重復內容，合理安排教學章節。同時，在教學過程中有選擇地補充了與本課程密切相關的科研進展，引導學生利用課外時間查閱相關文獻，了解本學科最新的相關研究進展，逐步深化、拓展研究型教學，提高他們自主學習的積極性和主動性。

5、反饋與評價

在2017年、2018年學期末課程結束后，我們連續兩年分別在2016級和2017級臨床醫學專業的260名學生中發放調查問卷，對教學過程和教學效果進行評價。問卷發放260份，收回有效問卷254份，有效回收率為97.7%。通過對問卷進行整理分析，得出以下調查結果：95.8%的學生認為開設細胞生物學課程非常必要或有必要；95.5%的學生認為非常必要或有必要建立網絡教學平臺；98%的學生認為在教學中介紹臨床相關知識非常必要或有必要；97.4%的學生認為非常必要或有必要在教學中介紹相關的研究進展和熱點問題；87.7%的學生喜歡并接受CBL與LBL相結合的教學模式，其中有92%的學生認為這種教學模式可以充分激發自己的學習興趣，但有21.4%的學生認為這種教學模式在對基礎知識的系統掌握和理解方面無顯著促進作用；87%的學生認為CBL與LBL相結合的教學模式可以明顯提高或提高自學能力在調查中，學生還結合自己的體驗對細胞生物學的教學提出了一些建議和意見，也在一定程度上反映了我們在教學方面存在的不足和問題。

綜合分析調查結果和學生提出的合理化建議、意見，我們將采取下列改進措施：由于授課對象是大一學生，學生相關的專業知識儲備不足，因此在選擇課堂教學案例時，應盡量選擇典型而淺顯的病例，并請教臨床的醫生，進行更為準確的描述，重新撰寫案例分析，結合實際教學情況完善教學案例素材；課堂教學及時補充與案例相關的知識點，逐步提升學生自主學習的主動性和積極性；進一步完善網絡教學平臺建設，并配備專業人員進行平臺監管，真正實現師生時時互動，充分發揮網絡資源的空間延展性。

總之，教無定法，因材施教。教學工作就是一個不斷優化的過程。在與學生的交流和互動過程中，我們將不斷總結反思，探索前行，選擇真正適合學生的教學模式，不斷完善教學過程，切實提高教學質量，培養學生成為符合時展需要的新型醫學人才。

【生物博士論文參考文獻】

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篇3

關鍵詞：研究生；創新能力；細胞生物學

中圖分類號：G643 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）26-0265-02

人類社會已經步入創新不斷涌現和競爭不斷加劇的重要時期。在知識經濟時代，科學技術創新是國家發展的決定性因素，是國家競爭力的核心，而科學技術創新離不開具有創新能力的高素質人才。高等學校擔負著全面推進素質教育，培養高素質的創新型人才的歷史使命，更新教育觀念，深化教育改革，構建高校創新型人才培養模式成為第一要務。教育觀念的更新，首要更新的是高等教育體系中龐大的師資隊伍，他們是教學改革的執行者，是課堂和實驗教學的組織者，是學生創新能力培養和素質提高中最有力的影響者，畢竟學生創新能力的提高是多學科、多層面長期共同努力的結果。

細胞生物學被列為生命科學的四大基礎學科之一，是在生命科學領域和高等教育體系中均占有重要位置的前沿學科。醫學領域的許多重大發現與細胞生物學實驗技術的發展創新有著密不可分的關系，掌握細胞生物學的基本理論和實驗技術對醫學院校的碩士研究生培養而言意義日益突出。在醫學研究生課程體系中開設的細胞生物學課程，在有助于幫助學生掌握基本技能、培養科研思維的同時，如何利用課程授課的機會，培養學生的創新能力，做好創新能力培養的關鍵一環，是我們當前面對的教育課題之一。我們在研究生細胞生物學教學中更有針對性地加強創新能力和實踐能力的培養，在教學內容、教學方法和考核方式等方面進行改革探索，在教學改革的實踐中對改革的迫切性、系統性有了更深的體會。

一、更新教育觀念，加強師資隊伍建設

1.教育觀念更新是前提。我們在教學實踐中也認識到忽視能力培養是制約創新型人才成長的主要原因，具體表現在三個方面：一是忽視實踐能力的培養，按著教學計劃和教科書一章一節地向學生講授，學生熟背理論而與實踐脫節。二是忽視自主能力的培養，限定領域不考慮學生的興趣和愛好，不主張學生的自主發揮，學生理解書本但不會思考。三是忽視學生探索能力的培養，只學習已有結論和經驗，忽視未知領域的大膽探索和形成結論的深入研究[1]。在實現碩士研究生創新能力培養的過程中，導師及教學團隊的教學觀念的更新是前提，也是基礎。各指導教師的創新力的保持和對教育教學先進理念和技術的不斷學習有助于保持教學的生命力。

2.師資隊伍加強是保障。國務院學位委員會辦公室主任、中科院院士楊玉良曾說過：“改革研究生培養機制、不斷提高研究生教育質量，加速培養創新型人才，是一個復雜的系統工程，不僅要重視提高研究生本身的質量，更要重視提高研究生導師的質量?！盵2]研究生和導師之間關系的滿意度調查顯示師生雙方的總體滿意度較高，但依然存在一定的問題，并認為導師的學術素質是影響研究生培養的關鍵因素之一[3-4]。我們的師資隊伍建設目標是業務精湛、勇于創新、師德高尚、教風嚴謹，梯隊合理。搭建技術力量雄厚的師資成為高素質創新人才培養的強有力的保障。我們在師資隊伍的建設中，重引進也更重培養，引進看學歷、選專業、重學緣，培養分批次、重堅持，力求優勢互補；在日常工作中，我們以小型的學術報告會的形式加強交流，互助共進；在梯隊建設上，看重專家教授的經驗，也注意吸納思維活躍的中青年學者；并依據多學科交叉和融合，學生的興趣主導，確立了雙導師制，并注意雙師型教師的培養。

二、深化課堂改革，推行創新課堂

1.課程設置合理化。研究生課程體系的設置做到適時調整，豐富選課資源的同時，加強學生選課的自主性，充分考慮學生的個性化培養的需求。

2.優化教學內容。創新型人才培養模式改革首要是課程改革，而課程改革首先要解決的問題是教學內容的優化。研究生創新能力的培養應該是建立在知識、能力、素質的辯證統一的基礎上。知識作為能力和素質的載體，是不可或缺的重要一環，研究生階段知識的獲取不應該局限于本科階段的某一本教材的重復拓展。我們在課堂設計中集思廣益，打破教材的局限，以學生興趣為出發點，設置了十個小的專題題目，專題內容涉及細胞生物學的基本技術及其創新、前沿知識、熱點領域，并充分考慮細胞生物學與醫學的密切關系。如細胞通訊、細胞信號跨膜轉導及其與疾病的關系，端粒、端粒酶和腫瘤的關系及其研究進展，細胞骨架與運動和神經系統疾病的關系舉例（原因分析、分子細胞學調整、研究進展）等。學生既能從中鞏固提煉的基本理論框架，又能獲得豐富的前沿信息，在學習中還有助于科研方向的確立和科研思維的培養。

3.改革教學方法。我們在前幾年的教學中留心對研究生的理論基礎、能力水平和喜歡的教學模式做了問卷調查，相對于本科生研究生階段學生的特點突出表現為：已經具有比較廣泛、系統的理論知識基礎，并具備一定的分析問題的能力，更向往自由的思維和互動表達。綜合研究生的特點和現代教育技術的發展，我們在課堂教學中試行教學方法改革，徹底改變教師灌輸知識的單一模式，更多地讓學生自主學習，教師擔負引導、組織實施、總結和考評的職責，更多的時候也是討論和爭論的主體之一，變師徒關系為伙伴關系。具體實施是依據學生興趣分組，3～4人/組，組內分工協作，依據自己所選的感興趣的專題查閱資料，開展討論并推舉一人以PPT文稿的形式圖文結合在課堂上匯報講解，同學可以自由提問，教師做針對性的點評、補充。創新的課堂組織從學生的興趣出發保障了自主學習的效率，協作中鍛煉了學生的團隊意識和合作能力，課堂表達和提問互動有效地活躍了學習氣氛，調動了學習的積極性，并提高了學生綜述及表達能力。此種形式受到了選課學生的一致好評，也吸引了更多的研究生加入我們的學習隊伍中。

4.考評手段合理化。在轉變教師單向傳授知識模式的同時，打破以考試分數作為衡量教育成果的唯一標準的劃一呆板的考評制度。對學生學習的評價主要是課堂表現和實踐實訓，各占50%。課堂表現的評價中以小組匯報講解中的綜合能力表現作為主要的考評指標，并逐步完善了評分標準，簡介如下：基本原理簡明扼要、切中要點、通俗易懂；研究應用舉例典型、兼顧多方面；重視結果分析（盡量使用圖表）；重視技術發展的進展和研究理論進展（突出新意）。除了陳述者有獎勵分之外，課堂提問及回答者都有酌情加分，極大地調動了學生的積極性。學生課前準備、課堂提問、課后總結的學習資料都可以組織建立個人學習檔案，學習檔案也可作為酌情加分的因素。

三、反饋與思考

教學內容、教學方法及新的考評方法改革的突出優勢在于愛護和培養學生的好奇心、求知欲，幫助學生自主學習，獨立思考，保護學生的探索精神、創新思維，營造崇尚真知、追求真理的氛圍，為學生的稟賦和潛能的充分開發創造一種寬松的環境。讓學生感受、理解知識產生和發展的過程，培養學生的科學精神和創新思維，重視培養學生收集處理信息的能力，獲取新知識的能力，分析問題和解決問題的能力，語言文字表達以及團結協作能力。

但在試行新的教學方法的同時，我們也發現了一些有待于改進的問題。在課程體系的設置中需要合理調研，依據社會、培養目標和學生主體的需求做出調整，充分適應多學科交叉融合的需求。在教學內容的優化上，學生更注重研究進展的討論和熱點文獻的分析，教學內容需要每年更新，不能一成不變。在教學方法改革中，試行討論式課堂的問題反應在四個方面：個別小組成員因自制力不強、計算機水平限制、口頭表達能力欠缺等原因對所選專題的基本理論或研究進展陳述不清楚，會一定程度上影響其他同學對該專題領域的學習。在課堂匯報環節，受部分同學表達能力的影響，學生的注意力不容易集中，課堂進展的節奏會略顯拖沓。在教學過程中容易出現兩極分化的現象，部分學生的主動性得到了很好的發揮，綜合能力得到了比較充分的鍛煉，也有個別學生在混學分，并沒有進行真正的自主學習。且教師對新的教學方法的理解和掌握的程度也一定程度上影響了學生的學習效果。在評價體系中，給學生公正、全面、合理的評價影響著學生的學習態度和熱情，但其過程是相當煩瑣的，需要教師團隊比較多的精力投入，適當的激勵機制能更好地配合教學改革的推進。

四、展望

創新能力是科技發展的核心動力，碩士研究生培養作為高等教育的重要一環，更需要創新能力。碩士研究生創新能力的培養需要更多體現在實踐實訓中，是一個循序漸進的過程，需要學校、學院、導師和學生等多個主體的重視和參與，但基礎是作為碩士研究生培養的導師或導師團隊中的每一位教師，都能保持教育改革的熱情，及時地發現現代教育中存在的問題，并能擁有足夠的改革的勇氣和決心。教師的教育理念的轉變和教學技術、方法的不斷提高完善，才能真正推動碩士研究生創新能力的培養。

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篇4

學時最少的維生素相關內容卻是目前社區衛生院臨床醫師最常用的知識點(圖1)。經典的三大代謝不僅常用也是臨床工作者希望詳細了解的知識點。社區醫院最大的患者群是退休的老年患者,患者群中糖尿病發病率居高不下,所以糖代謝、脂代謝等基本原理在社區臨床應用中占很大比重。其次常用的是與生理相關的水電代謝及酸堿平衡,與生理學內容有交叉與重復。癌基因與抑癌基因是醫學專業工作者目前最希望了解的知識點。腫瘤的高發,腫瘤標志物檢驗技術在社區衛生院的普及與開展,使臨床工作者迫切希望學習癌基因、抑癌基因這方面的知識,這也表明在教材編寫過程中要與時俱進,及時編入最新的醫學研究進展。

免疫及病原生物學知識點需求。

抗感染免疫是社區醫生最常用到的知識點(圖2)。社區醫院處于傳染病、地域性疾病、突發疫情的前沿陣地,對傳染病和突發疫情早發現、早隔離、早治療,對地域性疾病進行篩檢和治療,是其重要職責之一。而比較出乎教師意外的是即使是在農村,由于目前生活水平的穩步提高,寄生蟲學這一章節臨床醫生并不常用,對其要求不高?？贵w與補體是臨床醫生最希望詳細了解的知識點。臨床上不少檢測手段都需要用到免疫學的基本概念和原理,由此免疫學的應用和技術需要做些概括性的講解,使學生在實際工作中遇到相關問題不至于太茫然。

細胞生物學知識點需求。

細胞生物學最常用的和希望了解的知識點均集中在細胞的活動上,即細胞水平的增殖、分化、衰老、壞死和凋亡。這些知識點與腫瘤的發生、發展、轉歸密切相關,也與不少藥物的作用機制相關?？傮w而言細胞生物學與基層的醫學工作者并不是很密切。

課程整合初步大綱。

根據社區衛生院臨床醫師對生物化學、病原生物學、免疫學、細胞生物學知識點的實際應用情況和知識點的需求量,我們擬針對臨床專業(社區醫學方向)學生開設實用醫學生命科學課程,涵蓋以上學科部分知識點,力求達到在有限的學時內,傳授綜合性強,實用性強的知識點。

傳統的課程結構將臨床專業的課程分為公共基礎課、專業基礎課和專業課。這一模式系統性強,但各課程各自強調系統性、完整性,彼此之間缺乏聯系。由于面向農村社區臨床醫學人才培養不要求學生有十分寬廣的基礎理論知識,根據夠用、適度的原則,需要調整專業基礎課程,如細胞生物學、分子生物學的設置。目前的趨勢是社區醫生的培養重點在于大力發展全科醫學教育,這就要求教師在教學過程中將不同學科的知識點融會貫通,進行課程的重組,整合。江西醫學院上饒分院推行面向農村社區全科醫學教育改革,其專業基礎課程模塊中對課時進行了調整:生物化學與分子生物學占67學時(理論55+實驗17學時)、病原生物學與免疫學占66學時(理論54+實驗12學時)、細胞生物學占20學時(理論14+實驗6學時);遺傳學內容作為選修課程。目前,我校臨床醫學專業生物化學72學時,病原生物學與免疫學81學時,細胞生物學未開課。由此,我們在社區醫學專業課程設置上,擬將這三門課程進行整合并適當增加遺傳學的內容,形成一門貫穿一學年的153學時的實用醫學生命科學。

從而有效避免各課程為了強調自身學科的系統性和完整性而導致課程之間內容重復,相互重復的內容可統一在某一課程中單獨講述。除了課程結構上進行改革,還要根據培養目標重新編寫教學大綱和教材,刪除或弱化課程中對基層社區衛生工作無太大實際意義的內容,如本次課程整合過程中,弱化生物化學相關的蛋白質空間結構、等電點等,加強三大代謝的講授力度;即強調基本概念、生理意義等,而不是代謝步驟和調控。

同時增設代謝相關疾病的檢測等臨床實用操作實訓課,強調農村常見病、多發病的診斷。其次,不能一刀切地取消分子生物學和遺傳學課程,或者只作為選修課,而是在生物化學教學中融入這些內容,比如在蛋白代謝章節中強化分子病。有研究表明88.1%的人認為,社區醫院的診療水平值得改進,提高社區醫生的疾病診斷和大病發現能力尤為重要。

篇5

關鍵詞：細胞生物學；教學效果；探索

目前，我國正大力推進研究生教育綜合改革，研究生教育已從規?；l展全面進入以質量為核心的內涵發展。重視課程學習、提高課程質量是保障研究生質量的重要環節，也是當前研究生教育改革的一個重點。然而，調查發現，目前研究生課程教學普遍存在一些問題，如學校對教學不夠重視、教學內容不當、教學手段單一、考核方式不靈活等問題[1]。細胞生物學是研究并揭示細胞基本生命活動規律的科學。著名的細胞生物學家威爾遜（E.B.Wilson）講到“每一個生物科學問題的答案都必須在細胞中尋找”[2]。細胞研究涉及到生命科學的各個層次和領域，細胞生物學已成為生命科學的四大基礎學科之一。目前，各個高校生物學研究生均開設有細胞生物學課程，但同樣存在以上問題，教學效果不容樂觀。為了更好地保障和提高研究生細胞生物學教學質量，筆者從課程的教學內容、教學方法和手段、課程考核方法等方面進行了一些探索與實踐，取得了較好的教學效果。

一優化課程內容，融入最新科研動態

知己知彼方能百戰不殆，要想教好細胞生物學這門課，必須充分掌握課程及授課對象的特點。研究生理論課的課時一般較本科生少，更加注重前沿性和綜合性，生源來自不同本科院校，學生的專業理論基礎和背景也稍顯參差不齊。細胞生物學涉及的內容極為廣泛，與多門課程內容之間有相互交叉與聯系。若想在有限的課時內，適應不同生源，拓寬學生的知識面，開闊學生視野，對提高教學效果起到事半功倍的效果，必須調整和優化課程內容。

（一）調整課程內容，避免重復和遺漏

細胞生物學課程與分子生物學、微生物學、遺傳學等多門課程內容之間有交叉[3]。因此，需要各門課程負責老師就各自的講授內容進行研討，確定核心授課內容，避免教學重復。目前，越來越多的交叉學科出現并發揮出重要作用，多學科交叉融合是高校學科發展的必然趨勢。細胞生物學的生源也由單純的生物背景轉變為由生物學、化學、食品科學、材料學等多種背景。為適應不同的生源，教師需要充分掌握學生的專業基礎。如在開課前設計問卷，將課程知識點細化，每個知識點都分成熟悉、了解、陌生三個級別。統計出哪些知識點是學生都熟悉的，可以簡單概括講解甚至忽略，對多數人只是了解或完全陌生的內容需要詳細或重點講解，從而避免教學遺漏。

（二）優化課程內容，增強新穎性

教學內容在很大程度上決定了學生的知識結構和能力形成，因此，教學內容的新穎性對提高教學質量有重要作用。細胞生物學是當今發展最快的基礎學科之一，知識更新快，信息量增長迅速。教師應與時俱進，掌握本學科的最新發展動態，引導學生關注、跟蹤科研的發展動向。可以摒棄固有教材，加大前沿領域理論、技術及相關知識的內容比例，以增強課程內容的新穎性，激發學生的學習興趣，拓寬眼界，活躍學生的科研思維。

二豐富教學手段，引入先進教學方法

傳統的教學模式是講授式，以教為中心，注重知識的傳輸，忽視了學生個性和能力的培養。為了讓學生能夠更加積極、主動地參與到教學過程中，應采用多樣化的教學方法，注重啟發式、研究式、討論式等多種教學手段的綜合運用。

（一）進行專題學習

專題學習就是結合該學科發展現狀，精選具有代表性的關鍵內容，就某項專題進行學習，引導學生討論與思考，讓學生對該問題有更全面更深入認識的教學方式。細胞生物學課程專題的選擇可參考國內或國際細胞生物學會議論文集。也可以是當前領域的熱點問題，如誘導多能干細胞是十年來細胞研究的一個熱點，在學習細胞分化這部分內容時，即可選擇多能干細胞的誘導這一專題，既有干細胞的內容與教學內容相連貫，又涉及到新的干細胞類型作為課程內容的延伸。

（二）采用雙語教學

隨著國際化交流的日益增多，開展雙語教學已成為必然趨勢，教育部也提出了在高校開展雙語教學的要求，研究生階段開展雙語教學尤為需要。近年來，細胞生物學發展迅猛，重大成果不斷涌現。然而，據統計細胞生物學90%以上的新發現都以英語方式報道、傳播。中文版教材存在知識滯后性及新專業術語定義模糊等弊端。為了讓研究生準確把握細胞生物學的前沿知識，實行雙語教學勢在必行。實行雙語教學對教師素質有很高要求，青年教師一般具備較好的英語應用能力，豐富的知識技能儲備以及充沛的精力保證，可作為重點對象進行培養。在進行雙語教學的過程中，教師應注意教材的選擇要合適、采取滲透式雙語教學方式，循序漸進，并應加強與學生溝通，重視學生反饋，以提高學生專業英語水平，提高學生興趣為目的，同時，又不能給學生帶來過多的學業壓力。

三完善考評體系，建立綜合考核機制

傳統的考評即為試卷考試，難以真正反映學生的學習態度，無法充分調動學生的積極性。為了讓所有學生真正做到主動學習，參與到整個教學過程當中，必須摒棄傳統的單一考核方式，建立新的課程綜合考核體系。如實行注重多元化的考核方式，將課程考核分為3部分，分別為理論考核（占30%）、文獻學習討論（占30%）、專題匯報（占40%）。其中每部分都側重對學生綜合能力的測評。即使在理論考核部分，除了涉及基礎理論知識，還要涉及最新的研究進展和科研動態，以及實驗設計環節，以綜合考察學生學習的深度、廣度及靈活運用能力。這樣的命題方法改變了傳統死記硬背的考試方式，可防止學時考前臨陣磨槍，臨時抱佛腳，督促學生注重加強平時的理論學習。文獻學習方面，要求學生之間、師生之間進行互動交流，會促使學生積極思考，能夠提出問題并找到解決問題的方法，相應地學生就必須查閱大量相關文獻，可考查學生檢索文獻和匯報文獻的能力。專題匯報部分，要求學生凝練出一個科學問題，圍繞專題背景、熱點、難點、常規及最新研究技術方法等展開講述。通過學生的發言情況，了解學生對專題知識的掌握情況及學生對專題活動的參與程度。

四重視教學能力，提高教師教學水平

近年來，很多高校學校定位發生變化，以建設研究型大學為發展目標，以高水平科研工作為重點中心任務，對教學工作重視不夠[4]。重科研、輕教學已成為高校普遍存在的嚴重問題，許多教師尤其是年輕教師由于剛到工作崗位，缺乏教學經驗，教學能力明顯不足。對此，高校應加強青年教師教學能力培養，可以采取以下措施。

（一）舉辦教學基本功競賽

一般情況下教學基本功競賽會對選題、備課、制作課件、上課等各個環節制定嚴格標準，并優選教學名師做評委。通過親歷比賽過程，年輕教師能夠較快的掌握教學各環節要點。有些老師可能存在某些小問題，平時自己卻沒有意識到，通過比賽，有經驗的評委老師很容易發現，并針對性幫助其解決、改進。另外，學校應重視教學，如加大教學成果在工作考核、職稱評定中的比例，以激發教師教學積極性，促進教師教學能力的快速提升。

（二）建立“老中青傳幫帶”機制

建立專業教研室，充分發揮老教師對青年教師的傳幫帶作用。鼓勵青年教師先助課、多聽課，多參加教學研討活動。加強學校教學指導委員會的督導和指導作用。教學指導委員會成員一般都是學校統一組織選舉的有責任心、師德高尚、專業知識淵博、教學經驗特別豐富的優秀教師。教學指導委員會可以不定時去聽課，或針對特定教師進行跟蹤聽課，可以起到一定督促作用，同時幫助他們解決教學過程中遇到的各種問題。

（三）加強網絡精品課程學習

現如今網絡信息日益發達，尤其是教育資源的開放共享已成為一種世界潮流。我國教育部于2003年正式啟動中國精品課程建設項目，擬建成數千門覆蓋各學科領域，面向本科、研究生等不同層次的精品課程，而且免費面向公眾，以實現優質教學資源網絡共享。如中山大學、北京大學、清華大學等知名高校都有細胞生物學的資源共享課。課程計劃、重點難點、課件、課后題以及教學案例都可供免費參考和學習。

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篇6

關鍵詞：中藥 乳腺增生 細胞凋亡 表達

Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.02.005

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1671-8801（2014）02-0005-01

細胞凋亡是在自身基因調控下，細胞自主產生程序性死亡的方式，現已成為醫學及生物學的熱點研究之一[1]。它涉及一系列的基因的激活、表達和調控的作用，通過這一死亡過程可使機體能夠更好的適應生存環境，細胞凋亡已經成為醫學領域的研究熱點，通過細胞凋亡的研究可以導致疾病新療法的出現，特別是細胞凋亡與腫瘤之間的密切關系倍受人們重視[2]。乳腺增生作為女性最為常見的疾病，占乳腺疾病的70%以上，乳腺增生與乳腺癌之間關系密切，全國腫瘤會議將非典型乳腺增生列為乳腺癌的前期病變。

1 細胞凋亡的簡述

細胞凋亡的特性。細胞凋亡不同于細胞壞死，它是細胞在一系列基因的激活、表達、調控等有序作用下細胞自動死亡的過程，它不造成自體的損傷[3]。

細胞凋亡在形態學表現為早期變化為超微結構的全部連接消失，微絨毛消失，細胞密度密度增加，核質濃縮，核裂解為碎塊，細胞被分割數個凋亡小體，凋亡小體被鄰近細胞吞噬，凋亡小體被吞噬后快速降解。除形態學改變外，在細胞凋亡還發生許多內部的變化，包括染色質DNA的降解出現180～200bp的DN段、RNA/蛋白質大分子的合成、鈣離子濃度的升高、內源性核算內切酶參與等[4]。

細胞凋亡的檢測方法。隨著分子生物學和細胞生物學的不斷發展，對細胞凋亡研究也有了更多認識，并且針對細胞凋亡特征及機制而不斷出現新的細胞凋亡檢測方法[5]。目前常見的細胞凋亡檢測方法主要有，細胞凋亡的形態學檢測，DNA斷裂/片斷檢測、磷脂酰絲氨酸外翻檢測、線粒體膜電位檢測、細胞活力檢測、細胞膜通透性檢測、Caspase-3等細胞凋亡相關蛋白的分析、細胞內DNA含量的分析、細胞凋亡相關mRNA水平的分析、細胞色素C定位檢測等。

細胞凋亡的發生途徑。細胞凋亡大致可以分為起始階段、整合階段和執行階段3個階段，其過程總結起來為：接受凋亡信號凋亡調控分子間相互作用蛋白水解酶的活化進入連續的反應過程。就細胞凋亡發生途徑來說，目前可以分為死亡受體信號途徑、線粒體信號途徑和內質網信號途徑3種[6]。

細胞凋亡的調控基因。細胞凋亡是受基因高度調控的主動死亡過程，影響細胞凋亡的基因按其表達產物作用不同可分為促進細胞凋亡和抑制細胞凋亡的基因兩大類。

促進細胞凋亡的基因。p53基因是一種重要的抑癌基因，它與腫瘤的發生、發展密切相關。研究表明[7]，p53基因可以誘導細胞進入G1期，抑制細胞增殖，直到DNA損傷得到修復，如修復失敗，突變型p53（mt p53）就誘導細胞凋亡。Bax接到死亡信息后，由胞質移位并插入到線粒體膜中，形成Bax通道，促進細胞色素c釋放并進入胞質，使Bcl-2與apaf-1分離，后者可激活Caspase，從而誘導細胞凋亡。此外，促進細胞凋亡的基因還有c-myc、Smac、Bak、Bok、Bax-xs、PUMA等。

抑制細胞凋亡的基因。Bcl-2被證實是最重要的有明顯抑制細胞凋亡作用的基因[8]，Bcl-2的亞細胞定位已經明確，它在不同的細胞類型可以定位于線粒體、內質網以及核膜上，并通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用。IAP主要通過直接抑制Caspase或pro-caspase，阻斷 caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應，從而抑制凋亡的進程。IAP家族主要成員：survivin、livin和XIAP等。此外抑制細胞凋亡的基因還有C-myc、C-abl、Ras、V-src、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等。

2 中藥干預對乳腺增生組織細胞凋亡相關蛋白表達的影響

乳腺增生占乳腺疾病的70%以上，在育齡期女性最為常見，且發病年齡呈現出低齡化趨勢[9]。目前，主要采用藥物及手術治療乳腺增生。西醫采用性激素類藥物和碘制劑，如三苯氧胺、甲狀腺激素等；中醫治療乳腺增生的藥物有逍遙散、乳癖消I號等。手術只能切除局部病變，并不能起到完全根除的效果，其他部位仍可能發生或繼續生長。乳腺組織的細胞凋亡在乳腺增生疾病中普遍存在，在乳腺組織的生理、病理發展過程中以及維持乳腺組織正常形態結構方面具有重要作用。近年來中藥對于乳腺組織細胞凋亡的干預治療研究在不斷的進展。細胞凋亡研究對闡述發病機制具有推動作用，通過研究乳腺增生細胞凋亡表現和基因調控情況，將有助于探討乳腺增生發生的基本規律，為尋找乳腺增生病因和闡明發病機制提供理論依據，同時也會為治療乳腺增生和預防乳腺癌提供有力的幫助。

劉運江等[10]采用免疫組化SP法檢測25例乳腺正常組織、25例乳腺腺病、35例乳腺不典型增生、13例乳腺增生惡變和12例浸潤性乳腺癌的乳腺組織中的skp2和p21的表達情況發現，在乳腺正常組織、乳腺腺病中skp2和p21的表達為陰性，在乳腺不典型增生、乳腺增生惡變和浸潤性乳腺癌組織中的skp2和p21的表達陽性，Skp2和 P21均為乳腺增生惡變的危險因素，結論是Skp2和 P21可作為診斷乳腺增生惡變及判斷乳腺不典型增生預后的指標。

劉少杰、關健等[11，12]通過免疫組化SP檢測乳腺組織中凋亡抑制蛋白survivin的表達發現，普通性導管增生、非典型性導管增生和導管內癌的survivin表達水平依次增高，浸潤性乳腺癌組織survivin高表達率為53.0%。乳腺非典型性導管增生、導管內癌和浸潤性癌組織的survivin表達水平高于癌旁正常乳腺組織。

張霞等[13]通過采用免疫組化SP法檢測41例乳腺良性增生，20例乳腺導管內癌，91例乳腺浸潤性導管癌（有淋巴結轉移61例，無淋巴結轉移30例），對乳腺良、惡性病變組織中livin和Smac的表達研究發現，正常乳腺、乳腺良性增生、乳腺導管內癌和乳腺浸潤性導管癌組織中livin的陽性率依次增高；乳腺良性增生、乳腺導管內癌、乳腺浸潤性導管癌組織中中Smac的表達下降，有淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中Smac蛋白陽性率低于無淋巴結轉移組，TNM分期越高，乳腺浸潤性導管癌組織中Smac蛋白陽性率越低，結論 Smac蛋白表達下降可能與乳癌的惡性發展有關。

蘇莎[14]通過溫陽散結法對大鼠乳腺增生病治療的研究發現，正常乳腺Ki67、PCNA幾乎無表達，Ki67和 PCNA 的表達水平隨著乳腺增生-癌前病變-乳腺癌病變程度的加重而升高，通過應用溫陽散結法治療大鼠乳腺增生，Ki67和PCNA陽性表達率逐漸降低（P

王非等[15]通過消癖湯對肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺組織PCNA、BcL-2、VEGF表達的影響發現，中藥消癖湯對乳腺增生大鼠乳腺組織細胞中的PCNA、BcL-2、VEGF呈抑制作用，能夠降低實驗大鼠乳腺組織PCNA、BcL-2、VEGF的表達。說明消癖湯能夠通過抑制大鼠乳腺組織細胞增殖誘導凋亡和抑制腺體新生血管的形成來實現抑制大鼠乳腺增生的作用。

李湘奇等[16]通過對疏肝健脾方對模型大鼠乳腺增生組織細胞增殖/凋亡的影響研究發現，疏肝健脾方能夠抑制乳腺組織增生，降低 PCN A 和 Bcl - 2 的表達活性，增加 Bax的表達活性和凋亡指數，抑制乳腺組織細胞增殖，促進細胞凋亡。得出結論為疏肝健脾方能夠有效治療大鼠乳腺增生，可以降低大鼠乳腺增生組織中 PCN A 和 Bcl - 2 的表達，增加 Bax的表達，通過對大鼠乳腺增生組織細胞凋亡增殖/凋亡，阻斷/逆轉大鼠乳腺組織增生。

3 展望

乳腺增生嚴重影響到婦女的身心健康，甚至引發惡變而威協到婦女生命，且全國腫瘤會議已將非典型乳腺增生列為乳腺癌的前期病變。細胞凋亡的功能表達和維持個體正常生理過程具有重要的生物學意義，細胞凋亡可以闡明一類疾病的發病機制，也可由此產生治愈疾病的新療法。隨著我國中藥對乳腺增生組織細胞凋亡的研究不斷深入，使得乳腺增生組織細胞凋亡研究不斷取得突破性進展。通過研究乳腺增生中細胞凋亡的基本表現、發生機理和基因調控，將有助于進一步探討和揭示乳腺生物學的基本規律，在乳腺疾病的發生機理尋找新的治療藥物和方法人為調控細胞凋亡預防乳腺疾病的發生等方面均將具有重要的學術價值。

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篇7

【摘要】 目的： 基于側群（SP）細胞分選方法，初步鑒定卵巢癌干細胞（CSC) 表面標志，為臨床靶向治療卵巢癌提供靶分子。方法： 檢測、分離卵巢癌細胞株A2780中的SP細胞，并對SP與NonSP細胞作細胞生物學鑒定，包括克隆形成能力、致瘤能力、耐藥性、定量ATP結合框蛋白家族G2蛋白 (ABCG2)檢測等；進一步用免疫磁選方法篩出ABCG2+及ABCG2-細胞，同樣作上述細胞生物學鑒定，探討ABCG2分子能否作為卵巢CSC的表面標志。結果： 卵巢癌A2780細胞株中的SP細胞在體外強克隆形成能力、裸鼠體內的高致瘤性、對化療藥物長春新堿較強耐受性及高表達ABCG2分子等生物學特性基本符合CSC的特征。ABCG2＋細胞的克隆增殖能力略強于ABCG2-細胞；ABCG2+細胞的耐藥性與SP細胞的耐藥性一致。結論： A2780細胞株中的SP細胞基本符合CSC的生物學特征，其高表達的ABCG2分子參與維持SP細胞表型，特別是多藥耐藥性。ABCG2分子可作為靶向治療CSC的靶分子，逆轉腫瘤的多藥耐藥性。

【關鍵詞】 側群細胞　卵巢癌　癌干細胞　ABCG2分子　靶向治療

Abstract： Objective To explore a target molecule for the clinical targeted therapy of ovarian cancer. Methods The SP cells and non SP cells were isolated respectively from the human ovarian cell 2780 strain by fluorescence activated cell sorting (FACS) and their biological characteristics were identified by analysis of their ability to form colonies in common media， tumorigenicity in Balb/c nude mice， and of their resistance to chemotherapeutic agents vinblastin. The expression of ABCG2 was detected with realtime quantitative RTPCR (qRTPCR). The specific ABCG2 phenotype cells were further isolated from the ovarian cell A2780 strain for the same identification as above by the monoantibody labeled with immune magnetic beads by magnetic activated cell sorting system. Results The SP cells proliferative potency， clone formation ability in the common media， the tumorigenicity in Balb/c nude mice， and resistance to vinblastin in vitro were basically coincident with characteristics of cancer stem cells（CSC）. The ABCG2＋cells proliferative potency and resistance to vinblastin in vitro were higher than those of the ABCG2-cells. Conclusion The SP cells in the ovarian cell 2780 strain possess the traits of ovarial CSC and expressed ABCG2 molecule maintains the SP cells phenotype， especially in multidrug resistance. The ABCG2 molecule may be responsible for target molecule of the targeted therapy of ovarian cancer and for inversion of multidrug resistance in ovarian cancer.

Key words：side population cells; ovarian cancer; cancer stem cells; ABCG2 molecule; target therapy

卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤，發病率在婦科惡性腫瘤中列居第三，但其致死率卻為各類婦科腫瘤之首［1］，因此，探索治療卵巢癌的新途徑，已成為進一步提高卵巢癌患者生存率的關鍵。隨著干細胞(stem cells， SC)研究的深入，人們發現腫瘤是一種SC疾病。許多證據表明，大多數的腫瘤組織中存在著具有SC特征的“起始腫瘤細胞”(tumor initial cells， TIC)，稱為癌干細胞(cancer stem cells， CSC)，其是腫瘤增長、耐藥及復發的根源［2］。分離與鑒定是CSC研究的第一步，由于CSC缺乏已知的統一特異性標記，分離和鑒定成為CSC研究的難點。本研究主要通過側群（side population，SP）細胞分選結合ATP結合框蛋白家族G2蛋白（ATPbinding cassette G2， ABCG2)等方法初步研究卵巢CSC，其中SP細胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細胞外、表現弱熒光信號的細胞群，占總體細胞的很少部分［3］。在缺乏顯著CSC分子標記的情況下，SP細胞的篩選分析可以作為CSC鑒定的一種實用而簡易的重要方法［4］。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞株

Balb/c系的4～6周雌性裸鼠，購于上海動物模式中心。人卵巢癌細胞株A2780購于南京中醫藥大學，于加10%新生小牛血清的1640培養液中，在37 ℃、5%CO2環境下培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 A2780細胞中SP/NonSP細胞流式檢測和分選實驗

取對數生長期的單層培養細胞，制成單個細胞懸液，實驗組加入Hoechst33342至終濃度5 μg·ml-1，對照組再加入Verapamil至終濃度50 μg·ml-1，37 ℃水浴90 min，重懸于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，上流式細胞分選儀(fluorescenceactivated cell sorting， FACS)檢測。以355 nm UV激發光源、610 nm雙色短通反射濾鏡、450 nm和675 nm邊緣長通濾片分別檢測散射光藍光及紅光部分，線性模式采集信號，將細胞中熒光信號分為兩個部分，以Hoechst 紅點為X軸，Hoechst 藍點為Y軸作二維散點圖，將低Hoechst 紅點及低Hoechst 藍點且對照組缺失的區域設定為SP細胞的“門” ［5］，將只加入Hoechst33342的實驗組細胞分選出SP細胞及NonSP細胞。

1.2.2 克?。洌┬纬蓪嶒?/p>

1.2.2.1 平皿克隆形成實驗

將分選的SP及NonSP細胞懸液按每皿含100個細胞接種于培養皿中。在37 ℃、5%CO2環境下培養。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時終止培養，甲醇固定，姬姆薩染液染色后計數，用肉眼直接計數克隆數，或在顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數。按公式“克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%”計算克隆形成率。

1.2.2.2 軟瓊脂克隆形成實驗

24孔培養板中每孔分別澆入含0.5%低熔點瓊脂的底層瓊脂0.8 ml以及含0.3%瓊脂和一定細胞密度（分別含有100個細胞）的上層瓊脂0.8 ml，置于室溫使瓊脂凝固。在37 ℃、5%CO2及飽和濕度環境下靜止培養。第10天鏡下計數直徑大于75 μm或含50個細胞以上的克隆，并計算克隆形成率。

1.2.3 裸鼠體內致瘤實驗

1.2.3.1 SP/NonSP細胞裸鼠體內致瘤實驗

4～6周齡Balb/c系雌裸鼠隨機分為SP細胞組及NonSP細胞組，每組3只裸鼠，背部皮下注射對應的細胞懸液100 μl 5×104個細胞，隨后監測各組小鼠腫瘤生長時間。

1.2.3.2 ABCG2+/ABCG2-細胞裸鼠體內致瘤實驗

4～6周齡Balb/c系雌性裸鼠隨機分為ABCG2+細胞組及ABCG2-細胞組，每組6只，背部皮下注射對應的細胞懸液100 μl 5×104個細胞，隨后監測各組小鼠腫瘤生長時間。

1.2.4 MTT法檢測SP和NonSP細胞對長春新堿耐受性

取分選得到的SP/NonSP細胞接種于96孔板，實驗組加入濃度為10 μg·ml-1的長春新堿溶液10 μl至終濃度0.5 μg·ml-1， 培養72 h后 MTT法檢測細胞的存活率。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測SP/NonSP細胞ABCG2基因表達

檢測ABCG2：PCR上游引物5′GGCAGATGCCTT

CTTCGTTATGATG3′，下游引物5′TGGTTGTGAGATT

GACCAACAGACC3′。 檢測βactin：PCR上游引物5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG3′，下游引物5′AGC

ACTGTGTTGGCGTACAG3′。

反應體系置入ABI 7300 RealTime PCR儀按如下程序進行PCR擴增：94 ℃預變性4 min，進入3步循環(94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃35 s，共45個循環)，在3步循環中的每個反應循環結束時，RealTime PCR儀記錄SYBRGreenⅠ釋放的熒光。以逆轉錄合成樣品的cDNA產物作為模板，按相同的反應體系進行目的基因ABCG2和內參βactin的Real TimePCR擴增反應，并以ddH2O為模板設陰性對照，電腦采集每個循環的數值。使用7300 System SDS Software進行數據分析和統計學處理。

1.2.6 利用免疫磁選技術分離獲取ABCG2+表型細胞

制備A2780單細胞懸液，每107 個細胞加20 μl一抗，混勻后6～12 ℃孵育10～15 min。每107個細胞再加20 μl磁珠二抗，混勻后6～12 ℃孵育15 min或冰育20～30 min。然后用1000 μl緩沖液洗滌細胞兩次以去除多余的抗體，每107個細胞重懸于100 μl Buffer中過柱，在磁場力的作用下，未能標記上ABCG2分子抗體的細胞不會在磁場中停留，用1500 μl Buffer沖洗柱子。收集陰性細胞培養，移開分離柱收集陽性細胞。

1.2.7 ABCG2+/ABCG2-/經抗體孵育ABCG2+細胞對長春新堿耐受性

取分選得到的ABCG2+/ABCG2-，接種于96孔板，實驗組加入濃度為10 μg·ml-1的長春新堿溶液10 μl至終濃度0.5 μg·ml-1，經抗體孵育ABCG2+細胞組同時加入ABCG2單抗2 μl·孔-1，培養72 h后MTT法檢測細胞的存活率。

2 結 果

2.1 SP/NonSP細胞流式檢測、分選及細胞生物學功能的鑒定

FACS檢測出A2780 細胞中的SP細胞比例約為2.6%（B值2.7%減去A值0.1%，圖1）。將圖1B中門區域的細胞分選下來，分選所得的SP/NonSP細胞分別行相關的細胞生物學鑒定?？寺⌒纬蓪嶒炇菧y定單個細胞增殖能力的有效方法之一［6］，常見的方法有平板克?。▓D2A）和軟瓊脂克?。▓D2B）形成實驗。本實驗顯示，SP細胞的平板克隆率及軟瓊脂克隆率均明顯高于NonSP細胞（圖2C），兩者差異有統計學意義（P＜0.01）。在軟瓊脂克隆實驗中SP細胞多為克隆球形式存在，而NonSP細胞則很難形成克隆球，多以散在細胞存在（圖2B）。裸鼠體內致瘤實驗中，2周內SP細胞組2只裸鼠長出了腫瘤(2/3)，NonSP細胞組在8周后仍無腫瘤生長（0/3），余鼠在10周后均無腫瘤生長(圖2D)。 SP/NonSP細胞對長春新堿耐受性實驗中，0.5 μg·ml-1濃度長春新堿作用于這兩種細胞72 h，用MTT法檢測發現，對SP細胞的生長抑制作用不明顯，其存活率約為81%，而對NonSP細胞的抑制作用明顯，其存活率僅為37%，差異有統計學意義（P＜0.01，圖3）。用定量RTPCR檢測SP細胞與NonSP細胞ABCG2表達量，結果顯示，SP細胞約是NonSP細胞的5.8倍（圖4）。

2.2 A2780細胞中ABCG2+/ABCG2-細胞生物學鑒定

首先利用免疫磁珠分離技術獲取A2780細胞中的ABCG2+表型細胞，1×107 個A2780 細胞可得到約2×105個ABCG2+細胞，即A2780細胞中ABCG2+表型細胞占2%左右，其含量與SP細胞的比例相似。將分選所得的ABCG2+/ABCG2-細胞行相關的細胞生物學特性鑒定，在細胞體外克隆形成實驗中，ABCG2+細胞在平板克隆率及軟瓊脂克隆率均略高于ABCG2-細胞（圖5），但差異無統計學意義（P＞0.05)。在裸鼠體內致瘤實驗中， ABCG2+細胞組在細胞接種后5周時6只裸鼠中2只長出了肉眼可見的腫瘤(2/6)， ABCG2-細胞組在細胞接種后第5周時6只裸鼠中1只長出了肉眼可見的腫瘤(1/6)，其余鼠在接種后10周始終沒有腫瘤的生長，兩組間差異無統計學意義。分別將A2780細胞株分選的ABCG2+/ABCG2-、ABCG2+加抗體孵育的各組細胞進行長春新堿耐受性比較，發現藥物對ABCG2+細胞的生長抑制不明顯，其細胞存活率約為79%，而對ABCG2-細胞組的生長抑制明顯，其細胞存活率僅為35%，對ABCG2+細胞且加入抗ABCG2抗體共同培養組的細胞生長抑制也很明顯，其細胞存活率約為38%，較未加抗體組明顯下降，反映了ABCG2分子可能介導了細胞對藥物的耐受（圖6）。

3 討 論

分離與鑒定是CSC研究的第一步，由于多數CSC缺乏明確的特異性標記，分離和鑒定成為CSC研究的難點。目前，從形態學上很難區分CSC與腫瘤細胞間的差異，只能用功能學方法即從其自我更新能力和分化潛力來鑒定CSC。分離CSC主要有：SP細胞分選、無血清培養富集干細胞及通過CSC表面特異性標志篩選3種方法［7］。其中SP細胞是1996年Goodell等［3］在用Hoechst33342染色法研究全骨髓時，發現有極少一部分細胞可以將進入細胞核的熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀檢測時表現為不著色，他們將這類細胞命名為“SP”細胞，將這種表型命名為“SP表型”，該表型細胞還表達干細胞標志 Sca1+ Linneg/low。現發現SP細胞廣泛存在于多種生物的多種正常組織中，并同時存在于多種腫瘤細胞系及腫瘤組織中［89］。隨著對SP細胞研究的深入，發現SP細胞的功能與正常干細胞相似，如SP細胞可發生不對稱分裂、進行自我更新等［10］。多項研究表明，部分腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、腦膠質瘤等)中SP細胞具有CSC特性，即表達干細胞相關表面標志，具有自我更新、強致瘤能力和高表達轉運蛋白ABCG2［11］等。研究顯示，在卵巢癌細胞中存在致瘤性較強的SP細胞［1213］，因此，我們利用SP細胞與干細胞、CSC具有許多共性的特點來探討SP細胞分選法能否作為卵巢CSC分離鑒定的有效方法，并以此為基礎初步研究卵巢CSC表面特異性標志。本研究的結果顯示，卵巢癌A2780細胞株中的確有SP細胞存在，雖然僅占很少部分（約2.6%），但其較強的克隆形成能力、致瘤能力、耐藥性及ABCG2基因表達顯示，SP細胞的生物學特性基本符合CSC 的特征。本研究使用實時熒光定量PCR檢測結果顯示，SP細胞中ABCG2分子的表達量明顯高于NonSP細胞，因此我們推測ABCG2分子可能是卵巢CSC表面的一個特異性分子標志。ABCG2分子屬ATP結合框轉運體(ATPbinding cassette transporter， ABC)家族所介導的腫瘤細胞多重耐藥分子家族中的一種，屬跨膜藥物轉運蛋白，是抗腫瘤藥物難以發揮效應的關鍵耐藥蛋白［1417］。本研究發現，ABCG2+細胞的體外克隆能力及裸鼠體內致瘤能力僅略高于ABCG2-細胞，差異無統計學意義，說明ABCG2分子的高表達與卵巢CSC的強細胞增殖能力無明顯關系，維持卵巢CSC高增殖能力的特性可能還有其它分子參與，如其它干細胞標志等還需進一步研究。而ABCG2+細胞對化療藥物的耐受能力則明顯高于ABCG2-細胞，且ABCG2+細胞加入ABCG2單克隆抗體孵育后能使ABCG2+細胞對化療藥物的耐受性明顯降低，說明ABCG2分子是參與維持卵巢癌細胞多藥耐藥性的一個主要分子標志。

綜上所述，卵巢癌A2780細胞株中的SP細胞符合CSC的特性，分離SP細胞能夠富集卵巢CSC，這為下一步研究CSC的特異性標記奠定了基礎，并為開展對卵巢CSC藥物防治，尤其是為有效的靶向治療等研究提供了科學的實驗依據。

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篇8

摘要:概述了植物細胞分化的模式系統———管狀分子分化實驗系統的建立以及基于該系統的管狀分子分化的生理學、細胞學、生物化學和分子生物學等方面的研究進展，并對今后的研究方向進行了展望。

關鍵詞:百日草;次生細胞壁;細胞分化;管狀分子

管狀分子(TraehearyElements，TEs)是維管植物木質部內導管和管胞的總稱，皆為長柱狀細胞，次生壁木質化，成熟后均缺乏原生質體，其功能是輸導水分、礦質元素和機械支持作用。導管和管胞差別是，管胞無穿孔，管胞間壁僅有具緣紋孔，借以實現物質轉運;而導管分子間的某些區域具有穿孔，多個導管分子通過末端的穿孔連接形成一個長的管道，即導管，與管胞相比，其輸導能力大大增強。管狀分子來源于形成層，由形成層細胞經過細胞擴增、次生壁沉積、胞內物質自溶、形成端壁穿孔等步驟而形成。管狀分子分化已被作為植物細胞分化的模式系統，在形態結構、生化和分子組成、發育及生理功能上都具有明顯的特點，是植物解剖學、發育生物學和細胞生物學的研究熱點之一。多年來，各國學者建立了整體實驗系統和離體實驗系統，對管狀分子的形態解剖學、生理學以及分子機制進行了一定的研究。其中，百日草(ZinniaelegansJacq．)葉肉細胞離體培養系統是目前分化效果最好的實驗系統，人們利用該系統開創性地研究了離體條件下管狀分子分化的基本過程，并對管狀分子分化的細胞學、生理學、生物化學和分子生物學進行了卓有成效的研究。筆者擬對30多年來人們利用百日草葉肉細胞離體培養系統的研究成果進行概述，為進一步闡明管狀分子分化機制提供基礎。

1離體實驗系統的建立

因為管狀分子形態隨著分化進程而發生顯著變化，其中包括環紋、螺紋和網紋次生細胞壁(SCW)的形成以及自溶作用。所以，管狀分子分化被認為是植物細胞分化的模式系統。然而，大多數早期關于分化的研究，采用的是多細胞系統，這樣的系統包含幾種作為起始材料的細胞類型，為追蹤單個細胞分化過程帶來了困難。Kohlenbach和Schmidt發現，以機械法分離的單個百日草葉肉細胞可直接分化為管狀分子，這促使Fukuda和Komamine在此基礎上，建立了一個有效的、高頻分化的實驗系統。該系統已被全世界許多實驗室廣泛應用，有時根據特定情況僅僅對一些細節進行了修改。用液體介質浸漬百日草葉片，研磨后，以小網眼篩過濾，液體介質反復漂洗懸浮液，分離得到單個葉肉細胞。要注意:(1)材料要適當。取幼苗第一對葉，而非成年植物最嫩的葉片。(2)條件要適當。旋轉培養轉速為10r/min，0．3～0．4mol/L山梨醇調節滲透壓，生長調節劑為0．1mg/La-萘乙酸(NAA)和1mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，起始細胞濃度為(0．4～3．8)×108細胞/L。這樣，幾乎30%分離葉肉細胞，在適當的離體培養條件下，可半同步地分化為管狀分子。

2細胞學、生理學和生物化學方面的研究

百日草實驗系統的建立促進了管狀分子分化諸多方面的研究。初步的細胞學和生理學研究表明，細胞分裂不是管狀分子分化的前提條件，而一些DNA合成在分化中發揮重要作用;以肌動蛋白依賴的微管重組，限定了次生細胞壁的特有格局;分化過程是動態的，細胞變化表現在次生細胞壁沉積前細胞器數量的增加，次生細胞壁沉積開始不久次生細胞壁木質化啟動，原生質體逐漸自溶，初生壁非木質化部分的局部水解，分化過程終止。另外，百日草系統已清晰地證明，管狀分子分化受植物激素諸如生長素、細胞分裂素、油菜素內酯、赤霉素、一氧化氮、乙烯、信號肽(例如CLE肽、木質素、植物磺肽素)的調控;另外，大量生化和免疫學研究，揭示了細胞壁成分諸如纖維素、木聚糖、木質素和其他次生壁特有分子的變化，以及自溶過程中的各種事件，諸如蛋白質和核酸的降解等。

3相關基因的鑒定與描述

人們也用分子生物學方法，進一步分析了百日草實驗系統中管狀分子分化的分子機制。運用同源克隆法(例如，核酸酶ZEN1，肉桂醇脫氫酶和過氧物酶，b-微管蛋白，油菜素內酯合成酶和Rho/RacsmallGTPases)，差示篩選法(例如，分化標記，管狀分子分化相關的(TED)2-4(Tra-chearyElementDifferentiation-related(TED)2-4)，果膠裂解酶)，消減雜交法(例如，核糖核酸酶及分化標記、蛋白酶和木質素合成酶)、全面的轉錄組分析微陣列和cDNA-AFLP，分別鑒定了許多與編碼管狀分子特定事件相關蛋白質的cDNA，和限定管狀分子分化特定階段的標記蛋白。因為百日草轉化方法尚不穩定，所以其分離基因的功能分析受到很大制約(例如，果膠裂解酶ZePel，TED4，過氧物酶ZPO-C)。然而，最近，通過基因槍法和電穿孔轉染法，瞬間將基因或雙鏈RNAs導入百日草細胞，成功地描述了其他基因的功能，這可能為管狀分子分化相關基因功能的分析提供了有益的線索。

4其他植物的研究

在利用百日草實驗系統，研究管狀分子分化調控的基礎上，建立了擬南芥人工培養細胞的管狀分子分化系統，該系統在油菜素內酯調控下，有30%～50%繼代細胞分化為管狀分子。后續的基因芯片分析表明，多數擬南芥基因在管狀分子分化期間特異表達，這些基因包括編碼植物特定NAC-do-main轉錄因子VND1-7的基因家族，借以最終揭示長久以來尋找的管狀分子分化的轉錄開關。在某些植物和人工培養細胞中，VND基因被作為管狀分子異常分化的有效誘導物。

5待解決的問題和未來研究展望

管狀分子分化百日草葉肉細胞離體實驗系統的研究在草本植物中廣泛展開。該系統為誘導和促進管狀分子分化的研究建立了有效的平臺，并獲得了一些關鍵基因和調節因子，初步揭示了管狀分子分化的機制，為在單細胞水平上認識細胞分化和轉分化途徑、分化過程影響因素提供了可能，但復雜、精確的分子機制的構建仍需進一步研究。

(1)管狀分子分化具有復雜的時空特異性，調控網絡綜合而龐大，雖然生長素和細胞分裂素是管狀分子分化的基本調節激素，已有學者對2者進行了大量研究并取得一定的成果，但是其他激素諸如赤霉素、乙烯、脫落酸、油菜素內酯等作用效果研究資料極少，所以，植物激素作用機制的研究尚未明確。

(2)管狀分子分化是植物細胞凋亡的典型例子，成熟的管狀分子喪失了細胞核和細胞內容物，成為死的、中空的管狀細胞。目前對管狀分子細胞凋亡的信號轉導途徑知之甚少，需要進一步探索。

(3)以草本植物百日草，甚至擬南芥為材料得到的管狀分子分化的初步機制，是否適合木本植物，尚需驗證。

(4)雖然百日草系統較為成熟，管狀分子分化率和同步性較高，但隨著研究的深入，仍需進一步改進和優化游離單細胞的離體培養方法，摸索分化的最佳條件，提高分化率和同步性。

篇9

【關鍵詞】 鼻息肉；致病因素；研究進展

鼻息肉是由于鼻黏膜長期炎性反應所引起的組織水腫，是耳鼻喉科常見的疾病，其發生與發展與全身疾病相關。鼻息肉多來源于中鼻道竇口，鼻道復合體與篩竇，高度水腫的鼻黏膜常經由中鼻道、竇口向鼻腔內膨出下垂，從而形成鼻息肉，由于其病因具有多元性且術后易于復發，是目前鼻科疾病中較為棘手的問題。近年來，隨著免疫學、細胞生物學、分子生物學等學科研究的進展使鼻息肉在致病因素研究方面取得了較大的進展[1]。目前臨床上普遍認為該病多因素共同作用下黏膜慢性持續性炎癥所引起的，相關致病因素在其發生與發展過程中有著至關重要的作用?，F根據相關資料對鼻息肉致病因素做一綜述，進一步探討其研究進展。

1 感染性因素

目前臨床研究領域對鼻息肉的發生機制多認為是由多種致病因素作用，導致黏膜的持續炎性反應，不同患者的致病因素也不盡相同。感染性因素是指由細菌、真菌、病毒等引起黏膜的慢性持續性炎癥，其始終是鼻息肉發病機制研究的重點。國內外許多學者在研究鼻息肉發病機制時紛紛提出了金葡萄菌腸毒素不能夠促使淋巴細胞與嗜酸粒細胞的大量聚集和黏膜浸潤，分析可能是導致鼻息肉發生的原始因素[2]。部分報道中還指出，在接近50%的鼻息肉患者組織標本中發現了金葡萄菌腸毒素，在正常人的組織標本中則未發現。大量臨床研究表明，鼻息肉的發生與發展與機體抗感染免疫因素有密切關系，在鼻息肉患者中Tool樣受體2與TLR-4均呈現高表達，進一步證明了感染性因素在鼻息肉發生過程中的重要性[3]與此同時，感染性因素在鼻息肉發病中的重要地位從呼吸道感染患者鼻息肉發病較高這一點也可以得到佐證

2 變態反應因素

在現階段的臨床研究中，認為EOS浸潤是大多數鼻息肉患者病理組織學表現的重要特點之一，傳統學術觀點認為，變態反應因素在鼻息肉的發生及發展中起到了關鍵作用。然而仍有研究表明以EOS浸潤為主要病理組織學表現的鼻息肉患者，與局部IgE增高和過敏疾病史的關系并不密切。在青年及兒童鼻息肉患者中合并特應性鼻炎、外源性哮喘、枯草熱等存在確定變應原的病例并不多見，而在中年內源性哮喘患者中鼻息肉卻比較常見，因此，有部分學者認為鼻息肉在非特應性疾病患者中的高發病率說明了鼻息肉患者組織中EOS增多與變態反應并無密切聯系，可能是同時發生，并不具備因果關系。王鴻等研究中指出慢性鼻竇炎鼻息肉患者中大多數患者伴有不同程度的變應性癥狀及體征，部分患者合并變應性鼻炎，少數患者合并支氣管哮喘。研究發現在存在既往手術史的慢性鼻竇炎鼻息肉患者中，38.3%的患者鼻息肉的發生與變態反應因素有關。此外，在慢性鼻竇炎鼻息肉合并變應性鼻炎的患者中，58.7%的患者存在前期手術史[4]。進一步說明了在鼻息肉的發生及發展中，變態反應因素雖然不能全面揭示鼻息肉的發生機制，但變應性因素卻與鼻息肉的發生、發展，以及術后復發有著十分密切的聯系

3 過敏性因素

在目前的臨床研究中過敏因素也被認為是鼻息肉發生的潛在因素之一，關于鼻息肉發病機制的大量研究認為鼻息肉的發生與局部微環境中以EOS為主的炎性細胞因子與細胞因子調控自身延續所行程的慢性炎癥性腫塊。許多研究表明鼻黏膜局部所發生的由TGE介導引起的變態反應，能夠釋放出大量白三烯、組胺及炎性細胞趨化因子，導致病變周圍局部血管擴張、水腫、滲出增加、腺體增生等病理組織學變化。目前也有研究提示，變應性鼻炎尤其是長期變應性鼻炎可能促進鼻竇炎鼻息肉的發生和發展進程。分析其作用機制與過敏性因素導致的竇口鼻道復合體區域的鼻粘膜和鼻竇黏膜持續腫脹有關[5]。還有研究表明，過敏性鼻炎患者的鼻息肉根蒂部與其他部位想比較，可分泌大量活化的炎性細胞因子，分析這也與鼻息肉的發病機制和術后復發緊密相關[6]。

4 相關細胞因子

目前許多學者認為，炎癥中的多種細胞因子的高表達是鼻息肉發生發展中的重要環節。因此，對于相關細胞因子與鼻息肉之間關系的深入探討，能夠幫助我們更好的了解鼻息肉的發生與復發機制。已有研究表明，參與鼻息肉發生和發展進程的相關細胞因子多達上百種，不同細胞因子對鼻息肉的產生都呈現出特定的作用，但眾多細胞因子中，哪一種細胞因子最為重要，現階段臨床研究領域仍未形成統一說法，普遍認為鼻息肉的形成是各種細胞因子協同作用所導致的[7]。近年來，臨床研究較多的細胞因子主要有嗜酸性粒細胞、白細胞介素8、干擾素γ、Th2型主要細胞因子、核因子-κB、血管內皮生長因子。上述細胞因子均為免疫細胞所產生的小分子蛋白質，具有調節細胞的重要功能，其增殖與分化在機體防御中起到重要作用[8]。

目前許多研究表明細胞因子的高表達與鼻息肉的發展進程有一定聯系，嗜酸性粒細胞及淋巴細胞作為上述細胞因子的主要來源，嗜酸性粒細胞對變應原所引起的炎性反應和致炎因子的作用極為重要。當嗜酸性粒細胞在組織中被激活，能夠黏附于血管內皮細胞壁，穿過皮層滲透到組織間隙，同時釋放出大量的白三烯、堿性蛋白和嗜酸性粒細胞陽離子蛋白等過氧化酶及活性物質，這些物質對于鼻息肉的致病原、寄生物、周圍組織均可發揮出毒性作用和破壞作用，從而增加了血管的滲透性及超氧化物調節的組織破壞，造成上皮組織損傷，因此嗜酸性粒細胞也是炎癥進程中的關鍵因素之一

參考文獻

[1] 陳玉：抗體芯片分析炎性細胞因子在復發性鼻息肉中的表達[J].中南大學學報（醫學版），2009，34（10）：1086-1089.

[2] RostkowskaNadolskaB，etal.Diversityof nasalpolyps inmicroarray technology research[J].OtolaryngolPo，2008，62（3）：261-266.

[3] RostkowskaNadolskaB，etal.Amicroarray studyofgene expression profiles in nasal polyps.AurisNasus Larynx，2010.

[4] 王鴻.慢性鼻竇炎鼻息肉與變應性因素相關性的探討[J].中華耳鼻喉科雜志，2005，40（3）：168-171.

[5] 滕霞娟：鼻息肉的組織細胞學變化和形成機制探討[J].上海第二醫科大學學報，2001，21（2）：165-167.

[6] 趙鄰蘭：變應性真菌性鼻竇炎研究進展[J].耳鼻咽喉頭頸外科，2002，（9）：1842-1871.

篇10

【摘要】16S rRNA分析的實驗技術為微生物生態學的研究提供了新的研究方法，因此越來越多的學者利用16S rRNA進行各種實驗的研究并取得了驕人的成績。本文對16S rRNA基因的獲得做一簡單介紹，重點介紹16S rRNA基因的應用。16S rRNA在細菌菌種鑒定、環境保護、疾病診斷等方面都取得了很好的研究進展，不久的將來16S rRNA基因將會為人類做出更大的貢獻。

【關鍵詞】16S rRNA；菌種鑒定；疾病診斷；環境保護

前 言

隨著遺傳學、分子生物學、細胞生物學等學科的迅速發展，越來越多的新方法和新技術被應用于分子水平研究領域。在這樣的背景下，16S rRNA基因的研究無論在廣度和深度上都取得了顯著的成就，16S rRNA基因技術的應用在微生物多樣性、微生物種群分析、重要基因的發現、以及遺傳物質在微生物之間或微生物與非生物環境之間相互關系等方面均做出了巨大的貢獻，并開辟了微生物生態學研究新的領域。關于16S rRNA基因方面的綜合性論述尚未見報道，本文將為該領域的進一步研究提供必要的綜合信息。

1 16S rRNA基因的簡介:細菌rRNA按沉降系數分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。其中位于原核細胞核糖體小亞基上的16S rRNA長約1540bp，結構和堿基排列復雜度適中，較易于進行序列測定和分析比較。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌染色體基因中，它的內部結構由保守區及可變區兩部分組成，因此可用PCR擴增其相應的rDN斷，來快速、靈敏地檢測樣品中是否存在某些細菌或致病菌，或進行細菌多樣性分析。

2 16S rRNA基因在細菌菌種鑒定中的應用:1977年C.Woese通過對各種生物的rRNA進行分析，認為16S rRNA基因及其類似的rRNA基因序列作為生物系統發育指標最為合適，提出了可將自然界的生命分為細菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之間的系統發育關系，使微生物學進入到成熟時期，因此許多研究采用測16S rRNA基因部分序列的方法進行多樣性分析。Funke等測定從人體分離到的棒桿菌依賴補體細胞毒性Ⅰ組及其類似棒桿菌的16S rRNA序列，通過對這些序列的比較發現這兩個棒桿菌組都屬于放線菌屬，再結合其它的分子實驗結果及以前的生化試驗結果，提出其為放線菌一個新種，即鈕氏放線菌。Gaydos等通過對肺炎衣原體的1554bp 16S rRNA序列與鸚鵡熱衣原體及砂眼衣原體的16S rRNA序列進行同源性比較并繪制了系統進化樹，發現肺炎衣原體與后二者的同源性分別為96%和94%，證實了以前根據其它方法研究所得出的結論，同時說明從遺傳進化角度來看，肺炎衣原體與鸚鵡熱衣原體的進化關系比與砂眼衣原體的關系更近。

隨著大部分細菌的16S rRNA序列的獲得以及核酸擴增16S rRNA序列測定自動化分析系統的問世，必將引起細菌分類的一次重大變革，它可以使人們進一步了解細菌的進化關系，從而產生以16S rRNA序列分析為主體的所有細菌的系統發育樹。

3 16S rRNA基因在疾病的診斷方面的應用:目前，幾乎所有病原菌的16S rRNA基因測序均已完成，因此被選為細菌病原體PCR擴增部分或全部序列的目標。16S rRNA序列分析為基礎的細菌檢測法在目前識別異常細菌引起的疾病上扮演著重要的角色。Relman等利用16S rRNA 序列中的保守區段設計了寡核苷酸引物，用來擴增桿菌性血管瘤病人的靶DNA序列。他們還發現現在具有一定病癥的病人的組織污染物中已發現有細菌形成，但并沒有培養出致病菌。近幾年，人歐利希氏病、腸原性脂肪代謝障和少菌性骨髓炎的致病因子也是通過PCR擴增 16S rRNA 進行序列分析發現的；同樣，疏螺旋體的不同區域分離物根據此法也已被鑒定。

由于細菌種間16S rRNA基因序列間隔區在長度、序列上具有相對多變性，所以利用保守區的基因作為引物，對間隔區進行克隆和分析，就能為病原微生物的各菌株、種、屬的鑒定、分型提供依據。該檢測技術目前已被成功的運用到了病原菌的種、屬以及家族種類的鑒定中。

4 16S rRNA基因在環境的保護中的應用:16S rRNA序列分析隨著微生物核糖體數據庫日益完善已應用于海洋、湖泊、土壤、大氣等環境微生物多樣性分析。不少學者利用16S rRNA基因序列分析技術研究了多種環境的微生物多樣性，并得到了一些有意義的結果。如Glovanoni等研究了Sargasso海洋中浮游細菌的遺傳多樣性，因此提高了海洋微生物中致病菌的檢測速度，對于提高海產品質量，維護人類身體健康有重要的實際意義；Tanner等發現不同污染物對細菌群落多樣性有顯著的作用；Oureas等發現農業土壤微生物群落顯著生理活性差異及其多樣性；Nuble等發現氧化光能利用菌群落16S rRNA基因的豐度與其形態型顯著相關。吳春篤教授等對鎮江城市污水中微生物的16S rRNA進行檢測，發現污水中細菌16S rRNA基因主要來自變形細菌(proteobacte-ria)的各亞族，占總檢序列的86.3%，還有脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等類群，該發現為制定治理城市污水生物性污染的措施提供了科學依據。隨著各種學科的不斷發展和學科間的交叉應用16S rRNA基因將會在環境保護中發揮更大的作用。

參考文獻

［1］ 劉文強，賈玉萍，趙宏坤. 16S rRNA在細菌分類鑒定研究中的應用［J］. 動物醫學進展，2006，27（11）：15-18.

［2］ 王鳳蘭，王曉東. 分子微生物生態學技術在中國油田開發中的應用［J］. 應用與環境生物學報，2007，13（4）：597-600.