細胞培養范文

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篇1

[關鍵詞]動物細胞培養　動物血清

動物細胞培養培養基中要加入動物血清,而其在培養過程中究竟起什么作用,一直是高中教學的疑點。為了解決這個問題通過查閱相關資料從血清的成分出發得出以下結論。

一、血清及其成分

血清是血液凝固析出的淡黃色透明液體。如將血液自血管內抽出,放人試管中,不加抗凝劑,則凝血反應被激活,血液迅速凝固,形成膠凍。凝血塊收縮,其周圍所析出之淡黃色透明液體即為血清,也可于凝血后經離心取得。從成分上看動物血清的成分主要包括:水90.7血清白蛋白4.4血清球蛋白2.1氨基酸氮0.005尿素氮0.012其他非蛋白氮0.025葡萄糖0.08乳糖0.025各種脂肪酸0.38脂肪0.14卵磷脂0.2膽固醇O,22鈉離子0.38鉀離子0.02鈣離子0.01鎂離子0.0035亞鐵離子0.0001氯離子0.36磷酸氫根離子0.01硫酸根離子0.001碳酸氫根離子0.17DPG SGOT各種激素酶堿基各種氨基酸(以上數據均為百分比)。從成分上看血清在動物細胞培養中的作用是很復雜的。

二、各成分的功能

1　可以起到營養物質的作用

動物在代謝的過程中所需的營養包括水、無機鹽、維生素、糖類、脂肪、氨基酸和纖維素等。這些成分動物血清都可以提供給體外培養的動物細胞,但這些營養物質(除水以外)的含量在動物血清中所占的比例很少,而且主要的營養物質在動物細胞培養基的配制中已經添加了。所以,從這些角度看動物細胞培養加入的動物血清雖然能起到為培養的動物細胞提供營養物質的作用,但這并不是主要的作用。

2　可以起到調節的作用

動物細胞的代謝離不開調節。在動物體內有兩種調節方式來維持動物代謝的穩定,而細胞本身的代謝調節中激素調節的作用很關鍵。血清中提供了適量且比例適中的各種各樣的激素來保證動物細胞離體后的正常代謝。

3　可以為動物細胞提供必需物質

在微生物的培養中要為培養的微生物提供生長因子。同樣動物細胞代謝過程中有很多物質是動物細胞所必需而自身無法合成的的,例如堿基、維生素、氨基酸等微量物質,它們的作用非常重要,細胞需要它們合成核酸和蛋白質,缺乏-要導致細胞生長不良甚至死亡;提供結合蛋白,能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等,能結合或調變它們所結合的物質活力;,提供對維持細胞指數生長的激素,基礎培養基中沒有或量很少的營養物,以及主要的低分子營養物。這些物質都存在于血清中,如果在配制培養基的時候一項項添加是非常麻煩的。所以加入動物血清類似微生物培養中的天然培養基的做法,簡單方便、效果好。

4　可以為離體的動物細胞提供能量及解毒功能

血清中存在大量的糖類、脂類物質,這些物質可以為動物細胞提供大量的能量。有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合,起到解毒作用。

5　是細胞貼壁、鋪展在塑料培養基質上所需因子來源

動物細胞培養的一個很重要的用途就是用取自燒傷病人皮膚的健康細胞進行培養,可以獲得大量自身的皮膚細胞,為大面積燒傷的病人移植。人工皮膚的制備需要培養的細胞貼附在薄膜上形成皮膚組織,血清就為這個過程提供所需因子。

6　起酸堿度緩沖液作用

在動物血清中存在豐富的無機鹽,還具有很多緩沖物質,在培養基的酸堿度發生變化時起到緩沖作用。

7　提供蛋白酶抑制劑

使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活,保護細胞不受傷害。

總之,動物血清是細胞培養中用量最大的天然培養基,含有豐富的細胞生長必須的營養成份,具有極為重要的功能,更重要的是它含有細胞生長所必須的生長因子、激素、貼附因子等,這是合成培養基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質的毒性。故一般體外培養細胞時要加入一定量的小牛血清(10%～20%)。

參考文獻

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人體及動物生理學(第二版)

北京:高等教育出版社、2008

篇2

達情況，著重觀察單個細胞培養形成細胞克隆的形態與時間。結果 以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單個細胞，在96孔板中進行體外培養，獲取12個細胞亞系（獲取比例為6.25%），均有高成瘤性。癌干細胞相關標志CD44

與ESA均為高水平表達，而CD184表達則在12個細胞系之間有差異。在單個細胞培養中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態，12個細胞亞系均源于單個細胞形成的完全克隆，均可進行連續傳代與擴增，而部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡。結論 Tca8113M1細胞系中可能存在癌干細胞，而單細胞培養可形成完全克隆并建立細胞亞系，是進行舌癌干細胞后續研究重要的細胞培養模式。

[關鍵詞] 單細胞； 有限稀釋法； 舌癌干細胞； 完全克隆

[中圖分類號] Q 21 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細胞是癌組織中一小群具有干細胞特性的細胞，具有自我復制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強，少量細胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關腫瘤發生、轉移、耐藥與復發等諸多難題均從癌干細胞的角度進行研究。這種研究的基礎和前提是明確癌干細胞的標志或分離出癌干細胞，以提供研究的靶細胞。目前已發現多種永生性癌細胞系中存在有癌干細胞，Tca8113M1舌癌細胞系同樣可能存在有癌干細胞，可以作為舌癌干細胞的研究對象。鑒于癌干細胞獨特的自我復制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細胞系為研究對象，采用有限稀釋法分離出單個舌癌細胞進行體外培養，利用癌干細胞的自我復制能力進行分裂增殖，形成預期的單細胞克隆，進一步形成細胞亞系，以此證明Tca8113M1

舌癌細胞系中存在癌干細胞的可能性，同時檢測細胞亞系癌干細胞標志的表達情況，觀察不同細胞亞系的生物學特性，并且動態觀察單細胞培養中細胞克隆形成的規律，為從Tca8113M1細胞系中分離舌癌干細胞提供前期實驗依據。

1 材料和方法

1.1 舌癌細胞系來源

人舌癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系，四川大學華西口腔醫院贈送。右江民族醫學院腫瘤分子生物學實驗室在此基礎上建立了轉移人舌癌細胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培

養基（Gibco公司，美國）；PE標記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗人細胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗體，PE/cy5標記抗人CD184抗體，同

型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養箱（日本三洋公司），流式細胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日

本）。

1.3 體外單細胞培養、建系及細胞克隆生長的動態

觀察

采用有限稀釋法進行體外單細胞培養與建系。Tca8113M1細胞經復蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，轉移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個孔有1個細胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個細胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉移至6孔板擴增培養后，在培養瓶中反復傳代建立細胞亞系。此外，在此培養過程中動態觀察單個細胞形成細胞克隆的形態與生長情況，觀察時點分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細胞亞系成瘤性檢測

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細胞亞系細胞，選取形態良好的生長期細胞，在生長旺盛時接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細胞，800 r?min-1離心3～

5 min，棄上清液，計數細胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養液按每毫升1×107個細胞的密度稀釋細胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細胞接種于皮下，以皮下結節直徑超過1.0 cm為成瘤標準。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細胞亞系組，共12個亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細胞組，6只，為母系細胞系對照組；3）Tca8113舌癌細胞組，3只，為來源細胞系對照組。

1.5 流式細胞術檢測舌癌細胞亞系癌干細胞相關標

志CD44、CD184、ESA的表達情況

將舌癌細胞（密度為每毫升1×106個）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細胞吹散，將細胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標記抗人CD44、FITC標記抗人ESA、PE/cy5

標記抗人CD184）各5 μL，置于避光環境下室溫孵育30 min，然后于流式細胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達情況。

2 結果

2.1 Tca8113M1細胞體外單細胞建系培養

Tca8113M1單細胞培養12 h后，細胞貼壁；24 h后部分細胞出現變大變薄、空泡樣變等老化現象；3 d后，有7個孔的細胞出現增殖分裂現象；7～10 d后有12個孔的細胞開始增殖為單個或數個完全細胞克?。寺⌒纬蛇^程見圖l）。

培養4～6周后，細胞基本達到穩定生長并增殖的狀態，以癌細胞的克隆樣生長為主，細胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細胞，核分裂象多見。待培養孔接近80%鋪滿時，將細胞轉移至6孔板上擴增培養，1～2周后轉移至培養瓶中繼續傳代培養，穩定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細胞，并在96孔板中進行體外傳代建系培養，獲取12個細胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細胞體外單細胞培養形成細胞克隆

的動態觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時點，發現單個細胞形成細胞克隆的形態主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細胞亞系的細胞均源于單個細胞形成的完全克隆，均可以進行連續傳代與細胞培養擴增，而其他單個細胞培養形成的部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡，未能連續傳代進行細胞擴增。3種克隆在培養過程中的變化情況如下。1）完全克?。杭毎g緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時在細胞克隆中央出現細胞重疊生長現象（圖2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形態界于旁克隆與完全克隆之間，細胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細胞克隆疏松，形狀消散，

有轉變為旁克隆的趨勢（圖2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>

細胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細胞老化（圖2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌細胞亞系成瘤情況

將舌癌細胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結節，表面光滑、質硬、可活動；2周后可見皮下結節生長迅速；3～4周后皮下結節最大直徑達1.0 cm以上。含對照組在內的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞亞系癌干細胞相關標志

CD44、CD184、ESA表達情況

流式細胞術檢測結果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細胞亞系ESA的陽性表達率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個亞系的CD184表達存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經典的細胞培養技術，以舌癌Tca8113M1細胞系為研究對象，隨機選取192個舌癌細胞，在96孔板中進行單細胞培養，經過長期傳代培養，共建立12個舌癌Tca8113細胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強的成瘤性。進一步檢測12個Tca8113細胞亞系的癌干細胞相關標志，結果發現：CD44與ESA均為高水平表達，陽性表達率多在90%左右，而CD184的陽性表達率則各有不同。據此結果可以結合癌干細胞的生物學特性對本實驗獲得的細胞系進行分析。

本研究發現：舌癌Tca8113M1細胞系中有6.25%的單個細胞可以進行自我分裂、增殖，形成細胞亞系。還有研究[3]發現：Tca8113細胞連續經過兩次單細胞培養實驗，其中具備分裂增殖活性的細胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細胞系中，具備持續增殖能力的細胞占整個群體的比例都較少。根據目前的文獻[4]報道，在癌細胞群或組織中，癌干

細胞比例為0.01%～5%；體外培養的永生化癌干細胞系中，癌干細胞的比例可能偏高一些。本研究采用經典的有限稀釋法獲取單個細胞，這種細胞表現出強大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強的細胞亞系。這些單個培養的細胞是否就是癌干細胞尚需進行單細胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應該包含有癌干細胞。腫瘤干細胞的概念于20世紀60年代提出，并據此建立了腫瘤細胞克隆實驗。本研究在單個細胞培養中也發現，單細胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個細胞克隆后擴大生長，并且在周圍形成小的細胞克隆，最后融合成片，但究其細胞來源就是一個癌細胞而已，所有后續的細胞克隆與癌細胞就是源于它，所以可以認為該細胞具有癌干細胞的潛質，可以考慮從癌細胞系中篩選癌干細胞。

在12個Tca8113細胞亞系中，為明確其癌干細胞相關標志的表達情況，為后續舌癌干細胞的篩選提供前期實驗數據，本研究綜合文獻報道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細胞相關標志進行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌等上皮組織的癌干細胞的相關標志，CD184是胰腺癌干細胞的相關標志；ESA則是上皮來源的癌干細胞標志，而且屬于細胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細胞亞系中，

CD44與ESA均處于高水平表達，而CD184的表達則高低不一，其中亞系間均數差值最大者接近60%。從這3個指標的表達情況來分析，可以進行如下推測：1）CD44與ESA是不同細胞亞系共有的標志，提示這些細胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達提示Tca8113細胞系中存在細胞異質性，但從其比例來看，大致有3個等級，即15%、30%、50%以上，提示其生物學特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細胞研究的候選細胞群體進行研究。

此外，在單個細胞培養基礎上建立細胞亞系的過程中，筆者發現單個細胞形成細胞克隆的形態與細胞最后成系關系密切。在單個細胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細胞亞系，而且這些細胞亞系表現出腫瘤的異質性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴增培養過程中逐漸老化或消亡。這一結果可進行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個細胞確定為舌癌干細胞，而其形成的完全克隆則是癌干細胞自我更新與增殖的結果，其中可能富含癌干細胞。這一觀點也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經膠質瘤等相關研究[7-12]所證實。這些研究發現完全克隆細胞可以高表達癌干細胞標志；接種1 000個完全克隆前列腺癌細胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養的癌細胞球在消化后進行單細胞培養，可以形成高比例的完全克隆。有學者[13]進一步在頭頸腫瘤細胞系中發現，CD133與CD44陽性表達的癌細胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細胞的標志。由此可見，完全克隆為癌干細胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細胞及癌干細胞標志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細胞研究中逐漸被應用和關注[11]。此外，針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個細胞培養1～2周時形成，最好不要超過3周；擴增培養后，可使癌干細胞比例減少或分化細胞比例增加，從而影響對癌干細胞行為學的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細胞的前期性和階段性實驗，但是結果很有意義，這12個細胞亞系表明了Tca8113M1細胞系中有存在舌癌干細胞的可能性，而其最初的來源細胞系Tca8113也應存在癌干細胞。結合細胞克隆形態分析的單個癌細胞培養模式可為深入研究舌癌干細胞提供細胞研究平臺。

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篇3

關鍵詞：天然氣；催化燃燒；細胞；培養

中圖分類號：F407文獻標識碼： A

隨著我國大氣污染的日益嚴重，霧霾天氣區域性頻發，環境問題已變成當前棘手的問題[1]。天然氣催化燃燒能從源頭上防治污染和保護生態環境，有助于形成低投入“低消耗”低排放和高效率的節約型增長方式，有利于對消耗高“污染重”技術落后的工藝和產品實施淘汰，降低污染物排放總量，加強資源綜合利用，加強污染防治[2]。

天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒能達到CO和NOx均小于5ppm的近零污染物排放，是一種節能環保的燃燒方式。天然氣燃燒溫度在1000℃以上，燃燒后的煙氣無菌潔凈[3-4]，對環境無污染，可將煙氣與空氣和CO2按照一定比例配比，配比后的氣體達到干細胞所需要的氣體成分，[5-7]，由于高溫煙氣與空氣和CO2混合的，所以混合后的氣體潔凈無菌[4]，可將其經過過濾和降溫通入無菌箱或超凈工作臺使工作區域潔凈無菌，也可將氣體通入到CO2培養箱中，應用到干細胞培養。

1.天然氣催化燃燒煙氣分析

中國計量科學研究院對天然氣催化燃燒煙氣檢測報告結果如表1所示：

表1 天然氣催化燃燒各組分氣體濃度

天然氣催化燃燒，燃料燃燒充分，并且其燃燒溫度在1100攝氏度左右，基本上全部轉為CO2和H2O，CO 和 NOx均小于5ppm，基本為零，由于天然氣中摻加極少量的H2S，燃燒產物為SO2和SO3，但其含量小于5ppm，幾乎為零，所以天然氣催化燃燒效率高，燃燒產物潔凈無菌，可將其用到無菌箱中。

2.干細胞培養所需氣體環境

除了滿足營養的需要以外，培養環境還必須具備細胞生存并繁殖的生理學能接受限度內的物理化學特性，包括溫度、氣相及PH等。

2.1溫度

體外培養的細胞需在保持一定恒溫的環境中才能生長，其適宜的溫度與取材的動物種類有關。

2.2氣相及pH

體外培養細胞需要理想的氣體環境。包括O2及CO2，但其量則須恰當。多數細胞需要在有O2條件下才能生長，氧張力通常維持在略低于大氣狀態，若O2分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。體外培養細胞采用開放培養時，其氣體環境一般應為5%CO2＋95%空氣的混合氣體。大多數細胞適于在pH7.2~7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6可能對細胞有害，甚至退變或死亡。

3.3 無污染及無毒

體外培養的細胞必須生長于無污染及無毒的環境。無毒是培養細胞的必需條件 [5]。

3. 催化燃燒煙氣在細胞培養上的應用

無菌箱或超凈工作臺是細胞培養中要使用的，催化燃燒煙氣作為潔凈無毒無污染的煙氣可作為無菌氣體持續不斷地通入無菌箱，可使無菌箱持續保持無菌的狀態[4]，燃燒的煙氣與空氣、CO2按照一定比例混合后經過過濾降溫通入無菌箱可以持續的保持無菌箱的無菌狀態，我們將在無菌箱中對細胞操作完之后，將處理后的細胞放入CO2培養箱，傳統形式下需要一個5%的CO2瓶專門向CO2箱通入所需氣體，現在我們只需要將通入無菌箱的氣體通入CO2培養箱即可。

4. 實驗裝置

天然氣催化燃燒V型爐煙氣分析系統如圖1所示，本次實驗采用了兩塊獨石并排的催化燃燒V型燃燒器，所用獨石為堇青石蜂窩陶瓷，獨石內表面上鍍著鈀（Pd）和銠（Rh）催化劑，獨石采用正方形截面尺寸為150mm×150mm，厚度為20mm，獨石孔道尺寸1mm×1mm，壁厚0.18mm，軟化溫度為1380℃。

圖1. 天然氣催化燃燒V型爐系統圖

反應氣體天然氣和空氣分別通過量程為0~50 L/min 型號為GMS005 0BSRN200000的流量計和量程為0~80m3/h 型號為CMG400A080100000的空氣流量計進行調節，這兩個有穩流穩壓器提供電流。在催化燃燒器點火前需要對燃燒器內部的混合腔利用風機進行吹掃5 分鐘左右，來保證內部無殘留的燃氣。點火過程中，先將過量空氣系數調整到1.3左右進行氣相燃燒從而達到預熱的目的，期間觀察催化劑獨石表面待表面火焰基本消失且內部變為紅色時，將空氣量調大使過量空氣系數達到2.0左右，此狀態為催化燃燒的穩定燃燒狀態。此時，通過煙氣分析儀測量排放的煙氣，NO-NO2-NOx分析儀測量煙氣含量，待數據穩定后進行記錄。在箱體出口處插入熱電偶測量煙氣溫度。

5. 實驗結果分析

5.1 實驗結果

我們做了四組實驗分別是燃氣流量為6.1L/min 、7、8、9，相應的空氣流量為7.3m3/h、7.8、9.2、10.3，對應的空氣系數是2.09、1.94、2、2。圖2為記錄的煙氣成分CO、CO2、NOx濃度以及煙氣溫度。

圖2.不同燃氣流量下煙氣各成分濃度圖 3.不同燃氣流量下煙氣溫度

從圖2可以看出，NOx體積分數都在1ppm以下，CO體積分數在5ppm以下，接近于0，污染物含量極低，燃燒效果較好，CO2含量在5.7%上下，略高于細胞培養要求的5%，若將其應用到細胞培養必須改變CO2含量。從圖3可以看出，排煙溫度在300℃以上，接近400℃，與細胞培養要求的37℃相差甚遠，必須降溫。因此需要考慮將煙氣中通入某種氣體或者某幾種氣體將CO2和O2含量調節到細胞培養要求的含量。下面具體分析煙氣的主要成分。

5.2 天然氣組分說明

表 3-2 為通過氣相色譜儀所測得的實驗過程中所使用的天然氣組分及各組分的體積含量。

表1.天然氣各組分體積分數

5.21由于天然氣的主要成分是甲烷，所以天然氣燃燒的化學反應方程式如下[8]：

實驗用到的天然氣中甲烷占燃料總體積的 93%以上，所以實驗中是以甲烷的不完全燃燒情況進行了計算。所有含碳燃料在燃燒過程中都會產生CO這一中間產物。根據上述反應方程式可知，反應前后C原子個數是守恒的，反應后CO和CO2的總體積與反應前CH4的體積相等，即 。因為含量微乎其微，可以忽略不計，所以可以認為和燃燒前的含量相等，即；產生水蒸氣的量為，需要氧氣量，需要空氣量

煙氣總體積:

5.22 過量空氣系數為時，過量空氣相當于多出未參加燃料反應的那部分空氣產生的和水蒸氣的量不變，即，

過量空氣相當于多出未參加燃料反應的那部分空氣，煙氣中氧氣的體積:

煙氣的總體積：

干煙氣的總體積：

二氧化碳的體積分數:

氧氣的體積分數:

干煙氣中二氧化碳的體積分數:

氧氣的體積分數:

催化燃燒空氣的空氣系數是2，當過量空氣系數為2時，帶入上式

二氧化碳體積分數（煙氣中有水蒸氣）:

氧氣體積分數（煙氣中有水蒸氣）:

二氧化碳體積分數（煙氣中沒有水蒸氣）:

氧氣體積分數（煙氣中沒有水蒸氣）:

5.23 煙氣分析儀使用塑料管將氣體通入分析儀分析煙氣成分，在管道中煙氣降溫到室溫，水蒸氣冷凝，所以可以近似認為煙氣分析儀分析的氣體為干煙氣，數據計算CO2含量5.5%與實驗相當接近。

由于需要將煙氣中通氣體，雖然向濕煙氣中通氣體調節，但通入細胞培養儀器時的溫度為37℃，中間水蒸氣還會冷凝，所以調節氣體的體積分數時仍然需要按照干煙氣的計算調節。

對比煙氣成分含量與要求的成分含量可以看出，需要降低CO2含量，提高氧氣含量。因為氧氣提高到略低于21%所以可以通入空氣，即能提高O2含量又能降低CO2。假定煙氣總體積為V，通入空氣體積為Vx，則CO2體積為5.541，O2為11.082。

通過計算通入空氣后CO2含量會低于要求的含量，因此還需通入CO2，通入CO2體積為VY

將，，，

解得，

當煙氣的體積為V（不含水蒸氣）時，通入的燃氣量為0.0554V，空氣量為1.0554V，所以只要通入體積，燃氣量：空氣量：CO2量=0.0554:155；0.0523=1:2797:0.944時，輸出的煙氣的成分即為，。

6. 結論

天然氣屬于清潔能源，天然氣催化燃燒煙氣潔凈無菌，將燃燒廢氣收集重新利用通入CO2培養箱進行干細胞培養，此種方法使用即可以將煙氣充分利用，減少CO2排放，并且操作簡單，只需要向燃燒完的高溫煙氣中通入定量的空氣和CO2即可，而且從通入氣體的比例來看，生成需要的氣體向煙氣中通入的空氣很多，通入的CO2確很少，比較經濟，因此天然氣催化燃燒煙氣應用到細胞培養是種經濟環保的方式。

致謝

本資金由北京市供熱供燃氣通風及空調工程重點實驗室提供，項目編號cxy2012019。

參考文獻

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篇4

關鍵詞：高職教育;工學結合;細胞培養;課程開發

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）05-0044-02

一、工學結合的定義

工學結合是一種學習和工作相結合的人才培養模式，是將理論與實踐相結合，從而提高課堂教學效果的一種教學模式。2001年4月由東北大學主持召開的“美國合作教育大會”指出，工學結合是將理論知識和職業技能以及工作實踐結合在一起，是使學生提高就業率的一種有效的教學方法。

二、工學結合培養模式的開發背景及現狀

工學結合人才培養模式的主要功能是提高學生綜合素質和就業競爭力。這種模式涉及面很廣，牽涉到了社會、教育、產業等多個方面，從而需要獲得社會、教育和政府等多個方面的配合和支持。在教育教學方面，工學結合的模式需要建立對應的教學制度和管理體制，多個部門相配合，同時還是要聘請一些大企業的優秀工程師做相應的講解等活動，以增加學生的社會實踐經。

在產業方面，學生去企業單位實踐需要滿足三個要求：一是雇傭實習生需要付出的費用較低。企事業單位的部分崗位技術要求和風險較低，用成熟的老手費用高，因此才會考慮剛畢業的技術不成型的學生;二是國家政策的需求。國家支持鼓勵企事業單位吸納實習學生，同時還推出稅收優惠的政策，從而使更多的單位樂于接受實習生;三是著眼于長遠之計，企事業單位由于每年的人流量很大，雇傭實習生也能夠為企業儲備后繼力量。

從政府方面來說，很多發達國家都制定了相關政策。一是支持鼓勵企業單位雇傭實習生;二是鼓勵學校更多的運用工學結合教學模式。而我國由于開展工學結合模式較晚，所以各個方面的條件還不是很完善，尤其在產業和政策方面，國家處于發展的階段，一些政策還不能滿足用人單位的雇傭條件，不能夠讓單位和學生產生較高的積極性。在教育教學方面，政府沒有鼓勵學校實施工學結合人才培養模式的專項經費投入，造成因條件不健全學校實施工學結合人才培養模式困難重重：首先，多數學校都沒有建立專業的管理部門，管理上比較薄弱。由于教學管理部門的功能設定和主要服務對象是校內，因此很難勝任大量的對外聯系和過程管理。其次，在人員結構方面，由于沒有專門的管理機構，缺乏真正意義上的“雙師結構”隊伍。高職院校大部分教師缺乏生產實踐鍛煉，受傳統普通高等教育的影響，課程體系和教學內容設計過分強調理論的系統性。第三，在教學制度方面，我們尚沒有成熟的“完全學分制”和“彈性學制”，學生的自主選擇受到一定的限制。第四，在課程方面，我們還是從教學而不是從育人的角度看待課程。第五，在社會層面，國人也還停留在重知識、輕技能的傳統思想里，希望孩子通過讀書改變自身現狀，家長更愿意看到孩子在校讀書，而不是進入企業工作。

三、細胞培養課程的開發思路

由于政府、產業、教育和社會等各方支持系統要素的短缺，現有國情限制了學生大規模、有序地進入企業工作、學習，我國高等職業院校的教育與企業生產實際需求脫節，已經造成了目前勞動力市場上高等職業教育培養的畢業生與企業需求供求失衡的現象，只能摸索適合中國國情的工學結合人才培養模式。這種情況下，教師可以通過社會調研，掌握相關企業及研發機構的職業領域、崗位知識、崗位技能及職業素養等。

《細胞培養》是生物制藥技術專業的重要課程，課程目標是培養能夠從事細胞分離制備、純化及檢驗的專業人員。通過企業調研，將崗位工作任務進行能力分析，設置學習項目，通過一個個子任務來強化學生技能，循序漸進安排教學過程。引導學生熟悉細胞培養所需要的無菌空間、常見設備及操作規范、細胞分離、純化、檢驗及凍存方法，提升學生職業操作能力，提高職業素養，實現實踐教學與企業崗位需求的對接。

四、細胞培養課程內容的開發及設計

《細胞培養》是在充分進行崗位調研的基礎上設立的。課程內容是以符合實際崗位能力需要的工作任務為載體，以工作過程為導向，結合學生的認知規律和實際教學需求進行設計，包含無菌操作空間設計和儀器設備操作維護、實驗前準備、動物細胞的制備、細胞的分離純化、鑒定和保藏等，共9個項目、24工作任務及相關職業能力培養，突出實踐課程的重要性，注重學生技能操作和職業素質培養，基本涵蓋生物制藥企業和科研院所細胞培養崗位所必須具有的制備、培養、分析鑒定所需的全部方法和技術。

五、有效課程評價體系的開發與設計

為了檢驗學生是否具備從業崗位所需的綜合職業能力和素質，保證課程內容能夠有效實施，我們建立了《細胞培養》課程評價體系，采用項目過程考評（任務考評）的方法，課程總成績=項目過程考評成績（70%）+理論應知考試成績（30%），項目課程考評成績=素質考評成績（25%）+實操考核成績（75%）。具體分類見表2。

六、教學實施中的有關問題分析

工學結合開發《細胞培養》課程是針對高職院校設計的，考慮到高職學生的特點，在教學實施中有以下幾個問題需要注意：

1.為了不污染無菌環境，無菌空間應該避免一次性進入過多學生。學教師帶領分組學生在無菌間實操時，無菌間外學生的安全衛生及紀律問題需要設計周全。

2.受學時限制，任務以團隊形式完成，少數學生會完全依賴團隊“主力”，參與程度不夠。項目實施過程過中必須細化任務，確保每個學生都參與了項目的實施。

3.本課程是理論教學和學生實踐交叉進行，理論是根據實踐任務所需的知識構建，不同任務之間構建的學習領域以細胞制備工作流程排序。

參考文獻：

[1]陳解放.基于中國國情的工學結合人才培養模式實施路徑選擇[J].中國高教研究，2007，（7）.

篇5

【關鍵詞】羊水細胞培養；染色體制備；方法

文章編號：1009-5519（2008）15-2221-02 中圖分類號：R71 文獻標識碼：A

羊水細胞培養及其染色體制備技術是胎兒染色體病產前診斷的重要手段。由于羊水細胞培養技術要求高、羊水中活細胞少、培養周期長、易污染、分裂相少；細胞收獲、低滲、固定、顯帶、染色諸多環節，相對于外周血染色體的制備，羊水細胞染色體制備的難度較大，任一環節不合適都可能導致失敗。針對上述情況，借鑒國內外的一些經驗[1~5]，我們摸索出了一種簡便、易行，提高羊水細胞培養及染色體制備成功率的方法，收到良好效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料：（1）標本來源：選擇來我院遺傳門診咨詢的15~29孕周，年齡25~45歲疑有染色體病胎兒的孕婦50例，其中產前篩查后，風險率大于1/270的40例，年齡大于35歲的孕婦10例。（2）培養器皿：CO2培養箱，純度99.99%的CO2，25 ml培養瓶（CORNING，型號：3289），離心機，倒置顯微鏡等。（3）試劑：羊水培養基購自浙江貝因美公司。20 ?滋g/ml的秋水仙素，1%的檸檬酸三鈉，0.075 mmol/L的KCl，0.25%的胰蛋白酶，固定液由甲醇與冰醋酸按3∶1比例配成。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：囑孕婦平臥在手術床上，讓其左右翻身10次左右，以使羊膜腔內脫落的細胞懸浮，在B超引導下，用7號穿刺針經腹抽取羊水，先用5 ml注射器抽出2 ml羊水丟棄，再換用20 ml注射器抽取羊水20 ml，并迅速送到無菌間。

1.2.2 羊水細胞培養：（1）細胞收集：在生物安全柜內，將羊水注入2只15 ml無菌離心管中，每只10 ml，1 000轉/分，10分鐘，棄上清，留0.5 ml，用無菌吸管輕輕吹打混勻。（2）接種：將混勻的羊水細胞接種于2個25 cm2細胞培養瓶中，每瓶加入5 ml羊水培養液，輕輕混勻。（3）培養：酒精燈過火瓶口，擰緊瓶蓋臥式靜置于CO2培養箱中，溫度37 ℃，CO2濃度5%，培養6~7天后觀察細胞貼壁及生長情況。（4）細胞培養情況觀察：細胞培養6~7天后方可在倒置顯微鏡下觀察。此時，可見瓶底貼壁細胞已形成6~10個克隆，可換液。無菌操作將瓶內液體收集于1個15 ml無菌離心管，重新加入4 ml羊水培養液，繼續培養1~2天，鏡下可見較多大而亮圓的分裂期細胞，可終止培養進行收獲。換液時換下的培養液可重新離心后將細胞接種于一個25 cm2的培養瓶內繼續培養，在培養6~8天后仍會有新的細胞貼壁，并形成克隆，能有效防止第一次羊水細胞收集及染色體制備失敗。（5）終止培養：每瓶加秋水仙素（20 ?滋g/ml）40 ?滋l，旋緊瓶蓋37 ℃繼續培養1小時。

1.2.3 羊水細胞收獲：將羊水細胞培養液倒入一個干凈離心管中，用吸管吸干凈，快速將37 ℃溫?。?0分鐘以上）的0.25%的胰蛋白酶和1%的檸檬酸三鈉1∶9混合液1 ml加入培養瓶中，輕搖培養瓶，使消化液與培養瓶底面充分接觸，立即放回37 ℃培養箱中溫浴0.5~1分鐘，取出培養瓶，將上述離心管中的培養液倒入培養瓶中，輕搖培養瓶，終止胰蛋白酶的消化作用，用細胞刮片輕輕刮下細胞。用吸管將培養瓶中的細胞轉移到離心管中，1 000轉/分，離心10分鐘，棄上清，保留細胞沉淀。

1.2.4 低滲：加入37 ℃預溫30分鐘以上的0.075M KCl低滲液7 ml，用吸管輕輕吹勻細胞，使細胞懸浮于低滲液中，放回37 ℃溫浴箱中，靜止30分鐘。

1.2.5 預固定：沿管壁緩慢加新鮮固定液（冰醋酸∶甲醇=3∶1）1.5 ml，用氣泡輕輕吹打溶液使其混勻；1 000轉/分，10分鐘。然后吸棄上清液，保留沉淀。

1.2.6 固定：沿離心管壁加入新鮮固定液5.5 ml，用氣泡吹勻，繼續固定30分鐘。1 000轉/分，離心10分鐘。棄上清液，保留沉淀。

1.2.7 再固定：再加入新鮮固定液5.5 ml，用氣泡吹勻，靜止30分鐘。1 000轉/分，10分鐘。棄上清，保留沉淀。

1.2.8 3次固定：加入新鮮固定液0.5 ml制成細胞懸液。

1.2.9 滴片、烤片和顯帶：用滴管吸細胞懸液2~3滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，并在酒精燈的火焰下過火幾次，置75~80 ℃烤箱中烤片2小時。用預溫15分鐘的0.01%的胰蛋白酶消化25~30秒，Giemsa染色液染色10分鐘。

2 結果

2.1 羊水細胞生長情況：實驗結果顯示，50例孕婦羊水細胞培養均獲得成功，成功率100%，其中2例血性羊水細胞培養也獲得成功。

2.2 羊水細胞收集及染色體制備：實驗結果顯示，50例孕婦羊水細胞培養通過細胞收集及染色體制備，有49例獲得滿意的染色體分裂相，成功率98%，見圖1和圖2。

3 討論

羊膜腔穿刺技術具有一定的創傷性，一旦失敗孕婦難以接受再次穿刺。在實際工作中，影響羊水細胞培養及染色體制備成功率的因素很多[6，7]。實驗結果顯示，雖然50例羊水細胞培養均獲得成功，但在細胞收獲、制片、消化、顯帶等環節上有1例出現問題，導致結果分析失敗。說明羊水細胞培養在加秋水仙素的時機、細胞收獲、低滲、固定、顯帶、染色等環節，也非常重要。在實驗中對以下環節進行了改進和優化，取得了滿意效果。

3.1 羊水細胞培養的環境

3.1.1 細胞培養瓶：使用CORNING 3289型細胞培養瓶，細胞易于貼壁，快速生長。

3.1.2 在實驗中，使用純度為99.999%的高純CO2，細胞生長旺盛、舒展，在培養至第七天時，形成多個克隆。我們認為高純度的CO2有利于羊水細胞的生長。

3.1.3 收獲時機的掌握非常關鍵：我們在換液后第二天，低倍鏡下見到5~10個細胞克隆，克隆中央基本無細胞老化，且細胞大而亮圓，有比較多的雙核細胞，即進行收獲。我們發現培養時間越長，細胞越易老化，不宜收到較多的分裂中期的細胞。并不是細胞生長的時間越長、細胞越多獲得的中期細胞就越多。如果發現細胞老化的太多，可進行傳代培養。

3.1.4 秋水仙素的濃度：加秋水仙素的終濃度為0.20 ?滋g/ml，置37 ℃繼續培養1小時，獲得的染色體長短適中，易于分析。

3.1.5 收獲時消化液的選擇：采用1%的檸檬酸三鈉于0.25%的胰蛋白酶1∶9混合。消化時間短，僅需1~2分鐘即可。檸檬酸三鈉能使細胞連接松散，易于吹打成單個細胞，易于進行低滲。

3.1.6 滴片：用滴管吸細胞懸液2滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，使細胞平鋪于載玻片上，并在酒精燈的火焰下通過幾次。載玻片過火可使染色體散開，便于找到好的染色體分裂相。

參考文獻：

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篇6

支原體是細胞培養中最常見、不易被察覺和干擾實驗結果的污染物，約有30.3％～50.5％的細胞培養物中有支原體污染。培養細胞中支原體污染的來源包括：所使用的動物來源的一些產品如血清或已被支原體污染的細胞株系。細胞培養上清液中支原體的濃度可達107個/ml，而培養的細胞看起來很正常，在肉眼觀察或普通光學顯微鏡下觀察，受污染的細胞可無明顯變化。由于競爭營養及支原體有毒的代謝產物，支原體污染可顯著影響培養細胞的生理活性，使研究結果的真實性和可靠性大大下降。本實驗擬使用4種方案處理體外培養的支原體污染貼壁細胞，并就其療效進行比較，現報道如下。

1 材料

1．1 試劑及動物：(高糖)DMEM培養基：Giboco；胰蛋白酶：Gi-boco；DNA熒光法染色檢測支原體試劑盒：Epitomics；BM-Cy-din：Roche；Bab/c裸鼠：北京動物所。

1．2 細胞的來源和培養：人乳腺癌MCF-7細胞株，購自四川大學華西醫學中心分子遺傳學研究室。體外于不加抗生素的內含10％小牛血清的DMEM培養基，37℃、5％CO2恒溫培養箱中培養。

2 方法

實驗分為試驗組、陽性對照組和陰性對照組。試驗組為支原體污染且用不同方法作用的細胞，陽性對照組為支原體污染常規培養未作特殊處理的細胞，陰性對照組為常規培養支原體未污染的正常細胞。

2．1 支原體污染檢測：被檢細胞接種在無菌的6孔細胞培養板中，接種密度為2×10O4/ml。5天后，先吸去培養液，再加入1ml的固定液，靜置20min，吸去固定液，風干10min。于每孔中，加入lml的Hoechst33258工作液，37℃，20min。吸去Hoechst 33258工作液，風干后加入1滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。用400x熒光顯微鏡觀察細胞。

2．2 支原體污染清除：試驗組細胞按5×104/ml密度接種于25ml培養瓶內。利用各種方法作用后，檢測支原體污染情況。陰性對照組及陽性對照組用不加抗生素的含10％小牛血清的DMEM培養基在37℃、5％CO2恒溫培養箱中培養。

2．2．1 加溫法：試驗組細胞放入41℃溫箱內，分別在8h、12h、16h、24h及48h末進行支原體的檢測。

2．2．2 多西環素、環丙沙星聯合排除法：多西環素和環丙沙星聯合用藥，試驗組分為3組，兩種藥物用量分別為30μg/ml，50μg/ml和100μg/ml，培養24h、36h、48h末進行支原體的檢測。

2．2．3 BM-Cyclin-1、2排除法：細胞傳代同時加BM-Cychn-l10μg/ml，37℃培養3天；胰蛋白酶消化、傳代，加入BM-Cyclin-25μg/ml，37℃培養3天；繼續傳代追加BM-Cychn-2 5μg/ml次，培養2～4天棄藥液，D-Hank's液洗2次，胰蛋白酶消化傳代，進行常規培養。

2．2．4 裸鼠過繼法去除支原體闖：將支原體污染的細胞用0，25％胰酶，0.02％EDTA消化制成單細胞懸液后用PBS洗滌離心2次，調細胞密度至107個/ml；經小鼠背部皮下接種0.2ml細胞約10～15天后即可形成移植瘤；3～4周后無菌條件下取出移植瘤組織，剔除壞死部分，用注射器針芯在200目篩下將組織壓碎使細胞釋放人含0.1％EDTA的無血清DMEM培養液中：將細胞懸液小心加入含有淋巴細胞分離液離心管上層，室溫下水平離心3000r/min，20min；用吸管吸出兩種液體界面層的細胞置無血清DMEM培養液中，計數細胞；于無血清DMEM將細胞洗滌離心1次，用完全培養液調細胞密度至5×105個/ml，置37℃，5％CO2培養箱中培養。

3 結果

3．1 陰性對照組和陽性對照組：陰性對照組細胞經Hoechst33258熒光染色后，僅細胞核顯色，細胞表面及細胞周圍干凈、清晰，無熒光小點。陽性對照組經Hoechst33258熒光染色后，可見細胞核與細胞膜及其周圍均可見散在的藍色熒光顆粒，其密集程度與污染呈正相關。

3．2 加溫對支原體污染的治療效果：經觀察發現，加溫8h后，熒光小點開始變少。16h細胞周圍支原體幾乎消失。進入24h開始細胞周圍的熒光小點完全消失，但細胞開始逐漸變圓。脫落飛48h大部分細胞已完全變圓，細胞正常形態消失，培養基中出現飄浮死亡細胞。

3．3 多西環素、環丙沙星聯合治療支原體的效果：30μg/ml組和50μg/ml組多西環素和環丙沙星作用細胞24h開始，熒光開始減少，36h僅見少量熒光，48h熒光完全消失。細胞未見明顯變形脫落、死亡。100μg/ml組的多西環素和環丙沙星聯合作用24h熒光完全消失，至36h細胞無明顯變形死亡，但48h開始出現細胞變圓，脫落，生長變慢。

3．4 BM-Cyclin-1、2排除法：按以上方法處理后，經Hoechst33258熒光染色后，細胞表面及細胞周圍干凈清晰，無熒光小點。細胞無明顯脫落、變形死亡。

3．5 裸鼠過繼法處理細胞后常規培養，經Hoechst33258熒光染色后，未見支原體感染。細胞分裂生長旺盛。

4 討論

支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。支原體約有1％可通過濾菌器，用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性，因此在普通光學顯微鏡下不易被發現。在電子顯微鏡下可見支原體多吸附或散在于細胞之間，斷面與細胞徽絨毛相似。支原體感染發生后能改變細胞的DNA、RNA及蛋白表達，對細胞的生理活動產生多方面的影響。由于支原體無細胞壁，所以通常作用于細胞壁生物合成的抗生素，如內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。本試驗用4種方法對支原體污染的體外培養貼壁細胞MCF-7進行救治，現就其療效進行比較。見表1。

篇7

撫順市疾病預防控制中心，遼寧撫順113006

[摘要] 目的 比較實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法與細胞培養法檢測流行性感冒病毒的差異。方法 采用實時熒光定量RT-PCR及經典的狗腎傳代細胞病毒分離2種方法，同時對流感監測點送檢的80份疑似流感標本檢測流感病毒。 結果 細胞培養病毒分離的陽性數為26份，實時熒光定量RT-PCR的陽性數為36份，χ2=8.1， P<0.005。 結論 通過該實驗，驗證了實時熒光定量RT-PCR的確快速敏感，適用于實驗室快速診斷。

關鍵詞 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應；細胞培養法；流感病毒

[中圖分類號] R4[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-0742（2015）03（b）－0192-02

[作者簡介] 姜紅濤（1965-），女，天津人，本科，主管檢驗師，主要從事病毒檢驗工作。

2013年出現的流感病毒H7N9經自然重配，致病迅速，易變異，給人們帶來極度恐慌，引起WHO 的高度重視[1]，從而使流感病毒病原學的準確快速診斷顯得尤為重要。該實驗室在2014年1月采用整群抽樣法對撫順市流感監測哨點醫院的80份疑似流感樣標本進行了實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法與細胞培養法進行了檢測流行性感冒病毒的方法比較，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2014年1月在撫順市國家級流感監測哨點醫院，每周采集內科和兒科門診就診的流感樣病例（體溫≥38℃，同時伴有咳嗽或者咽喉疼痛等癥狀的急性呼吸道感染者）的咽拭子標本，放人pH 7．4-7．6的DMEM采樣液中，當日低溫送流感實驗室檢測，每周采集 20份流感樣病例的咽拭子標本。

1.2主要試劑

①抗A（H1N1）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（SWL1）亞型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由國家流感中心提供。MDCK細胞，遼寧省疾控中心提供；胰酶、Hank’液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白組分V， 采購于BI公司。DMEM培養基，采購于GIBCO公司。

②提取RNA試劑盒為QIAGEN。

1.3主要儀器

AB PCR儀；二氧化碳培養箱 ；倒置顯微鏡等。

1.4實驗方法

1.4.1采用細胞培養法分離流感病毒，細胞為狗腎傳代細胞（MDCK）每份標本接種細胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hank’s液洗2遍，加入病毒維持液，置34.5 ℃培養，每天觀察病理變化（CPU），當CPU出現3～4個加號時，按常規法檢查維持液中的紅細胞凝集活性。將HA≥1：16的標本采用血凝抑制方法（HI）進行流感病毒型別鑒定[2]。確定病毒的型別和亞型。并送國家流感中心做進一步鑒定。HA≤1：16的標本未做分型鑒定。

1.4.2RT-PCR反應體系的配置[3-4]反應條件：60℃ 5min 50℃ 30min 95℃ 15min95℃ 15s，55℃退火30 s（收集熒光），72℃延伸 30s 45 cycle 72℃ 5min4℃ 保存。見表1。

1.5統計方法

配對設計的χ2檢驗，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差異有統計學意義。

2結果

2.1兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的結果

細胞培養分離病毒26株，陽性百分率32.50%，RT-PCR檢出36株，陽性百分率45.00%，見表2。

2.2兩種檢驗方法統計結果比較

細胞培養分離病毒36株，陽性26株，RT-PCR檢出36株，兩種檢驗方法統計結果為χ2=8.1，因為χ20.005，1=7.88，所以P<0.005，兩種檢驗方法敏感性差異有統計學意義。見表3。

2.3兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的分型結果

細胞培養分離病毒H1N1（22份），H3N2（4份），熒光定量RT-PCR分離病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3討論

流感病毒病原學相關檢測目前常用的有病毒分離培養法、快速檢測、分子生物學方法等。病毒分離是診斷流感病毒的金標準[5]，但耗時長是其缺點。而且宿主細胞生長狀態也是影響病毒生長及復制的關鍵因素[6]，導致疑似流感樣標本到實驗室后，培養完成時間不確定。同時培養液中營養物質的持續消耗以及宿主細胞的逐漸死亡是導致病毒滴度降低的直接原因[7]，收獲的病毒滴度高低存在著很多的不確定因素。而且，標本采集后的保存運送等環節都對MDCK培養分離流感病毒存在較大的影響。而實時熒光定量RT-PCR法應用于流感病毒實驗室診斷，國內外早已有許多報導[8]，它具有靈敏度高、特異性好、檢測所需時間短等等優點，尤其在應急疫情快速診斷中得到了廣泛的應用。它與經典的MDCK細胞分離法相比，檢測時間可縮短到1 d之內。由于在封閉管中進行，省略了電泳這一步驟，減少了以往PCR技術導致的假陽性可能[8]。

該實驗室對2014年1月流感監測點送檢的80份標本，采用細胞培養、實時熒光定量RT-PCR 兩種方法檢測，同時進行比較， 結果證實，實時熒光定量RT-PCR法對流行性感冒病毒的檢出率為45.00%，高于細胞培養法的病毒檢出率32.50%。實時熒光定量RT-PCR法和細胞培養法兩種檢驗方法χ2檢驗結果為χ2=8.1，P<0.005。對流感病毒的檢出敏感性差異顯著，對流感病毒的分型也是準確無誤，在病毒含量較低的標本中不存在漏檢情況發生。通過這兩種方法的比較，與浙江省疾病預防控制中心通過比較得出的，實時熒光定量RT-PCR法對大量疑似標本進行實驗室快速鑒別診斷，實用性強，快速敏感[9]的結論一致。驗證了實時熒光定量RT-PCR法確實是實驗室快速診斷流行性感冒病毒的首選方法，用實時熒光定量RT-PCR法檢測為流感病毒陽性的標本接種MDCK細胞，培養分離流感病毒，可以降低細胞培養法分離流感病毒的成本，減少不必要的試劑材料的消耗，提高檢測效率。這僅僅是本實驗室的驗證結論，還需要其它研究中心加以驗證。

參考文獻

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篇8

【關鍵詞】 灌注培養；微載體；細胞截留

隨著單克隆抗體藥物產業的發展，帶動了大規模動物細胞培養技術的不斷提高。利用動物細胞生產單克隆抗體已成為當前生物制藥企業的發展方向。在上世紀六十年代，灌注培養技術的出現為動物細胞大規模培養開辟了廣闊的前景。在隨后的研究中，灌注培養技術得到了迅速發展，已成為動物細胞大規模培養的重要方法。灌注培養的主要優點是連續灌注的培養基可以提供充分的營養成分，并帶走代謝副產物，而細胞保留在反應器系統中，由于細胞生長環境優良，可以達到很高的細胞密度，并延長表達時間、增大收獲體積，同其它方法相比，灌注培養的產率可以提高很多。

1 懸浮灌注培養

1.1 微載體懸浮灌注培養

微載體培養最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在細胞培養時，將細胞懸液與經過特殊處理的微載體混合培養，待細胞貼附于微載體上后移至培養液中培養，借助攪拌系統使細胞隨載體均勻懸浮于培養液中。近年來隨著對微載體材料的深入探索，相繼開發出液體微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA 微載體、藻酸鹽凝膠微載體等，并有很多微載體已進行商業化生產，如明膠微載體Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore等。

1.2 懸浮細胞截流灌注培養

隨著無血清懸浮培養技術的日趨成熟，現有細胞密度及表達量已不能滿足需求，人們重新將目光轉移到灌注培養上，但是如何不用微載體而將細胞截流在反應器中并結合無血清懸浮培養工藝進行產物的表達成為熱門。該工藝的重點在細胞截流上，如何高效的截流細胞而不對細胞產生損害及降低堵塞成為焦點。

1.2.1 中空纖維柱細胞截流裝置

中空纖維柱是由若干根孔徑在10kd-0.45um的圓筒形膜束捆綁在一起構成的，含細胞液由圓筒中間快速通過形成切向流，因膜的孔徑小于細胞直徑，因此細胞被截流在膜內側，而培養液透過膜滲出到膜外側而達到截流細胞的目的。當前該種灌注培養裝置最具代表的就是ATF System(Refine TECHNOLOGY ），其特有技術可有效防止柱體的堵塞，達到長時間截流細胞的目的。據報道，應用該系統進行懸浮細胞培養密度可達4-15×107個/ml，蛋白產量可達1g/L/day甚至更高。

圖1 ATF系統運行示意圖

1.2.2 沉降法細胞截流

在眾多的細胞截留裝置中，傾斜式重力沉降器由于設備簡單、對細胞造成的損傷較小、操作簡易，已用于雜交瘤和CHO 細胞連續灌注培養，在采用上流式沉降操作的連續灌注培養生物反應器系統中實現了高密度培養。但該系統在進行細胞培養時還存在諸如細胞損失、灌注流速過慢等問題而限制了系統的放大，無法應用于商業化生產。

1.2.3 聲學細胞截流裝置

這是一種基于聲頻引起細胞聚集的新型細胞截留裝置，BioSep聲學細胞截流設備（Applikon ）的原理完全是基于溫和的聲頻引起松的細胞積聚，然后再沉淀。與其他的細胞分離技術相比，BioSep內的聲頻能量網構成一個“虛擬網”，因而是更好的，無接觸、不移動的過濾模式。該技術可以進行長達數千小時的連續培養，因而大大提高細胞密度、生產率并獲得高的產品質量。

1.2.4 離心細胞分離

該方法較為簡單，即在無菌條件下利用重力離心分離細胞與培養液，但該方法使細胞受到的剪切力較大，對細胞損傷較大，另外，對操作環境要求較高及離心機體積上的限制而無法應用于大規模生產，僅在研究中應用。

2 床層灌注培養

2.1 流化床培養

利用一些諸如磁、電場等技術手段將微載體局限于一定區域內，細胞生長于多孔微載體內部，培養基在流通過程中不會損失細胞，該培養方式適用于貼壁依賴型細胞，具有培養基交換快，細胞養分充足的特點。

2.2 固定床培養

是將微載體固定于無菌容器內，細胞貼附生長在載體上或載體內部，進行培養液更換時，微載體并不移動，可很大程度上降低血清的用量。

2.2.1 中空纖維灌注培養

由于中空纖維培養系統具有類似于生理狀態的纖維毛細管模式和灌注式培養基循壞系統, 既有利于高密度細胞在纖維管壁和周圍的停留、生長和增殖, 也便于營養物質的供應和代謝產物的轉移, 近年來, 已被越來越多地用于雜交瘤細胞的體外培養。

2.2.2 堆積床培養

該方式是將反應器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產生的負壓，迫使培養基不斷流經填料，有利于營養成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。

篇9

[關鍵詞] 雪旺氏細胞；培養；人

[中圖分類號] R421 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）06（a）-0025-02

雪旺氏細胞（SCs）是周圍神經系統中一種功能特殊的膠質細胞，是周圍神經中神經鞘的主要組成部分。近年來發現，SCs不僅能維持周圍神經正常的電生理傳導功能，還在神經損傷后修復再生過程中起重要的作用[1]。研究表明[2]，SCs在周圍神經損傷后的修復過程中，主要是通過分泌多種神經生長因子，維持神經元的存活；另一方面，SCs還通過產生細胞外基質、細胞黏附分子等，在神經軸突的再生過程中起支持和引導的作用。利用SCs的這種特性，將SCs作為一種支持細胞移植到中樞神經系統上，在神經系統損傷修復中發揮巨大的作用[3]。作為細胞移植前的基礎工作，本實驗探討從人胚胎脊髓背根中分離、培養并純化人SCs。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM細胞培養基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；0.125%胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）；膠原酶（Sigma公司）；Forskolin、牛腦垂體提取液（BT1，Sigma公司），阿糖胞苷（Sigma公司），D-Hanks平衡液，CO2培養箱（NAPCO公司），倒置相差顯微鏡（Olympus公司），35 mm一次性培養皿，多聚賴氨酸，兔抗人S-100（Neomarkers公司）；即用型SABC免疫組化試劑盒和褐色DAB顯色試劑盒，均購自博士德公司；引產的28周死亡胎兒（汕頭大學醫學院第一附屬醫院婦產科提供）。

1.2 雪旺氏細胞的分離和培養

從引產的28周胎兒中分離背根神經，將背根神經在D-Hanks平衡液中切成小塊，在37℃下加入膠原酶進行消化約1 h，后加入等量含10%胎牛血清、青酶素和鏈酶素的DMEM溶液中止消化。800 r/min離心5 min，移除上清，加入2 mL的DMEM，用火焰拋光的吸管進行吹打，將吹打后的細胞懸液用微孔大小約10 μm的濾網進行過濾，制成單細胞懸液。將單細胞懸液移入用多聚賴氨酸包被的培養瓶中，置搖床上每隔10 min 搖10 s，總共搖30 s，將雪旺氏細胞與混雜在其中的成纖維母細胞進行分離。將上層的細胞懸液移入另外一個培養瓶中進行培養，原培養瓶中底部沉淀的成纖維母細胞和少量的雪旺細胞加入10 mL的DMEM進行培養，約4 h后，原培養瓶再進行震搖，將懸浮細胞移入另一培養瓶中進行培養，原培養瓶中余下的細胞大部份為成纖維母細胞。將上述方法取材、消化、純化后的細胞懸液種植于含20%FBS的DMEM培養液中，于5%CO2，37℃條件下培養24 h后，更換成含阿糖胞苷（終濃度為5 μg/mL）和20% FBS的DMEM培養液，48 h左右更換成含有Forskolin及BT1生長促進劑的培養液，每周2～3次。待細胞長滿皿底后以0.125%的胰蛋白酶-EDTA液消化1～2 min，同時鏡下觀察，當細胞開始皺縮后加入含血清培養液中止消化，離心（1 500 r/min，5 min），加入適量培養液，用拋光的吸管吹打，稀釋后接種在預先涂布有多聚賴氨酸的35 mm培養皿中。靜置5～15 min，吸出上清液，離心（1 500 r/min，5 min），加適量培養液， 用拋光的吸管吹打，均勻后重新接種于另一只預先涂布多聚賴氨酸的35 mm培養皿中，于5% CO2，37℃條件下培養。

1.3 S-100免疫組化法鑒定SCs及純度

反復傳代后，待P4代SCs長滿底部后，以3%甲醛固定10 min，PBS沖洗3次。加入一抗兔抗人S-100多克隆抗體（1∶100），4℃過夜；0.1 mol/L PBS沖洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗2 min×3次；滴加試劑SABC，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗5 min×4次；DAB（用蒸餾水1 mL加試劑盒中A，B，C試劑各1滴），室溫下顯色5～30 min。顯微鏡下觀察，S-100陽性細胞為SCs。細胞純度采用抽樣法進行統計。該方法大略如下：用一帶網格的蓋玻片在顯微鏡下對S100抗原陽性細胞（雪旺氏細胞）和S-100抗原陰性細胞（非雪旺氏細胞）進行細胞計數。第一個計數區域選擇在蓋玻片中央部位，計數后水平或垂直移動蓋玻片2 mm，再進行計數，依同樣的方法共計數9個區域，最后再進行統計。

2 結果

細胞懸液種植2～4 h后，倒置顯微鏡下觀察，剛貼壁的SCs呈小而圓，折光性好，少數呈雙極或三極的梭形；成纖維細胞胞體較大，形狀不規則，較SCs貼壁更早，黏附更牢。24 h后大部分細胞完全貼壁，大多數細胞呈兩端突起的梭形，少量呈多角形，相鄰細胞之間以突起相連（圖1）；在這些梭形細胞中間，夾雜一些散在分布，形狀不規則，細胞個體較大的細胞，這些細胞是纖維母細胞。加用阿糖胞苷后，有少量的細胞胞體變黑浮起，細胞增殖明顯受抑制，成纖維母細胞受抑制更明顯。細胞生長融合延緩，第6～9天細胞才長滿皿底部。經傳代后SCs純度明顯提高。

免疫組織化學檢測，SCs被染成黃褐色（圖2），而成纖維母細胞不著色。示SCs呈S-100抗原陽性。細胞純度統計示SCs純度達99%。

3 討論

有研究表明[4]，SCs能分泌20多種蛋白質，這些蛋白質的分子量分布在15～250 kD之間，這其中就包括多種神經營養因子（NTFs），這些神經營養因子中，NGF、CNTF、BDNF和FGF研究較多。有研究表明，單一的神經營養因子既能維持某些神經元的生存，又能促進其突起生長，而多種神經營養因子在一起可能有協同的生理效應，即他們可能作用于相同的受體，起協同作用。將SCs移植到中樞神經系統中，SCs能長期存活并分泌神經生長因子和細胞外基質，這將在中樞神經系統損傷中起到很重要的作用[5-6]。近年來，SCs細胞中樞神經系統移植作為支持細胞與神經干細胞移植治療中樞神經系統損傷的研究很多，部分研究已經應用于臨床[7-8]。因此，探索人SCs的分離、培養和純化方法對人類有著迫切的需要。

目前SCs細胞的分離培養方法已經較為成熟，難點在于與成纖維母細胞的分離[9]。由于兩種細胞的貼壁特性的不同，成纖維母細胞的貼壁時間更早，貼壁更牢固，因此，可以利用兩種細胞的這種特性對其進行分離。本實驗在原代培養階段，將經過酶消化后的混懸液置于用多聚賴氨酸包被的培養瓶中，在搖床上進行振搖，SCs在這種條件下貼壁很少，而成纖維母細胞由于較易貼壁，大部份附著于瓶底，通過提取上清液，達到SCs與成纖維母細胞的分離。在分瓶傳代過程中，利用成纖維母細胞貼壁較牢固的特性，通過調節適當的消化酶的濃度，使大部份SCs懸浮，而成纖維母細胞仍然處于貼壁狀態，通過提取上清液的方法，既而與底部成纖維母細胞分離。通過不斷的傳代培養，使SCs不斷純化。由于阿糖胞苷對兩種細胞的生長抑制程度不同，在培養液中加入阿糖胞苷，抑制成纖維母細胞的生長，使SCs的增殖速對相對于成纖維母細胞快，從而達到減少成纖維母細胞，提高SCs純度的目的。本實驗綜合利用酶消化、時間差和阿糖胞苷抑制等方法分離、培養和純化人SCs，經鑒定，這些細胞呈S-100抗原陽性，純度達99%。本實驗為將來臨床利用SCs移植治療中樞神經系統損傷奠定基礎。

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篇10

【關鍵詞】軟骨細胞 提取 培養

軟骨細胞作為軟骨組織在軟骨基質中唯一存在的特定的細胞種類，在軟骨組織再生與代謝方面起到了重要作用。但因軟骨組織中缺少血管和神經系統，其自身修復方面存在一定的局限性。近些年，生物組織工程學將工程學和生命科學的方法原理相互結合構建人體組織或器官的功能替代物。在軟骨組織工程中，體外構建的自體軟骨細胞組織復合物可移植到機體受損關節修復其結構并恢復原有功能。自體軟骨組織移植技術已引起人們越來越多的重視，但由于機體軟骨組織中的軟骨細胞相對較少，無法滿足機體受損關節修復和愈合所需的軟骨細胞數量；并且軟骨細胞在體外擴增的過程中，會發生“去分化”現象。發生了去分化現象的軟骨細胞則不宜再用于軟骨組織工程。因此，本實驗通過結合國內外文獻，試圖探討通過簡易的方法來獲取大量活性化、增殖能力強的軟骨細胞。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

2月齡新西蘭大白兔1只（由蘇州大學動物實驗中學提供），體重1.5kg。II型膠原酶（collagenase type II）、HEPES液、脯氨酸、抗壞血酸及非必須氨基酸均由Sigma公司提供；高糖DMEM、PBS從Hyclone購買；胎牛血清、青鏈霉素由Gibco公司提供；cck8試劑購自國產碧云天。

1.2 軟骨細胞的分離和培養

耳緣靜脈空氣栓塞法處死新西蘭兔，75%酒精消毒雙側膝關節。將關節以及周圍肌肉組織完全離斷，75%醫用酒精浸泡消毒后，放入含有雙抗的PBS液中。在超凈臺上分離關節，剔除周圍的軟組織。仔細清除軟骨表面的滑膜，用刀片削下透明軟骨，放入含2ml PBS的5ml EP管中，并用PBS清洗3次。去掉PBS后，加入4ml 0.2%II型膠原酶，并移入15ml離心管中，放入37℃恒溫搖床振蕩消化。消化過程中，觀察到約3h，軟骨組織已全部變為絮狀。將細胞懸濁液經過200目濾網過濾，收集到的軟骨細胞分別按2000個/孔接種于96孔板、5000個/cm2接種于25cm2培養瓶。在37℃、5%CO2培養箱中培養。每天于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并每3天換液一次。

1.3 軟骨細胞培養液的組成

對照組：高糖DMEM培養基，添加10% FBS和1%雙抗。實驗組是在對照組的基礎上，添加0.1mM非必須氨基酸、10mM HEPES液、0.4mM脯氨酸、50mg/L抗壞血酸。

1.4 原代軟骨細胞貼壁和增殖情況

（1）細胞貼壁情況：原代細胞接種24h后，每天于倒置顯微鏡下觀察貼壁生長情況并拍照。

（2）cck8法檢測細胞增殖：原代細胞按2000個/孔的密度接種于96孔板，設5個復孔，接種后1-10d每天測得其吸光值（OD490）。測定前每孔加入10ul cck8溶液，放置培養箱繼續培養。2h后于酶標儀檢測OD490。

2 結果

2.1 原代軟骨細胞的貼壁情況及形態學觀察

原代軟骨細胞接種后，分別按實驗組和對照組的培養基進行培養，連續觀察7d。原代分離的軟骨細胞為圓球形，懸浮于培養基中；實驗組，24h后細胞開始貼壁，逐漸展開，第3天時細胞基本均已展開呈多角形，在增殖過程中，出現抱團現象，至第6天，細胞可長滿瓶底，單層生長的細胞呈現典型的“鋪路石”樣表現；而對照組的細胞，在48h才開始貼壁，第4天細胞基本展開呈多角形，第7天時呈現“鋪路石”樣。

2.2 原代軟骨細胞的增殖情況

通過cck8法檢測了實驗組和對照組細胞連續9d的增殖情況。實驗組的細胞在接種第2天即開始增殖，而對照組的細胞從第4天才開始明顯增殖，實驗組細胞的增殖率明顯高于對照組。

3 討論

隨著社會快速發展，人口老齡化的問題日趨嚴重，伴隨而來的關節軟骨損傷的發病率也出現持續升高。因軟骨組織缺乏血液和神經供應，其自身修復能力較差，故軟骨損傷的治療問題一直是醫學界的研究熱點。近年來，軟骨組織工程技術已成為治療關節軟骨缺損的重要手段，而足夠數量的高質量種子細胞的來源則是組織工程軟骨構建的關鍵。

本研究在軟骨細胞的消化分離過程中，清除軟骨表面的滑膜組織后，采用對細胞毒性較小的0.2% II型膠原酶消化，可以減輕胰酶對軟骨細胞的傷害。置于37℃恒溫搖床振蕩，可以在較短時間內使軟骨消化更徹底。本實驗中，1只兔的雙膝關節軟骨經3h左右的消化后已可完全消化，收集細胞后計數可達500萬，且細胞的活性較高，貼壁率達90%以上。本消化方法較很多文獻報道中的聯合酶消化法等，具有步驟簡單、耗時短、污染率低、獲取細胞數量多等特點。

在軟骨細胞的培養中，我們發現，使用添加了HEPES液、非必須氨基酸、脯氨酸及抗壞血酸的培養基可以促進原代軟骨細胞的貼壁和增殖，且pei等表明這種培養基可以利于軟骨細胞表型的維持。因此，在軟骨組織工程中體外準備種子細胞時可以考慮使用該培養基，以獲取更多具有軟骨細胞表型的細胞。

參考文獻：

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