細胞自噬范文
時間：2023-04-04 16:39:15
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篇1
細胞內損傷物質的積累是所有衰老細胞的普遍特征，能導致生命有機體生存能力降低。細胞自噬能夠降解受損蛋白質和衰老或損傷細胞器等細胞結構，是細胞內主要的異化途徑，參與衰老以及與衰老相關的各種病理過程。近年來研究發現，衰老進程中，細胞自噬活動下調，而對各種長壽突變體的研究表明自噬活動是壽命延長所必需的，多種自噬相關基因或蛋白直接受長壽途徑的調節〔1～5〕，這些發現都支持細胞自噬是各種真核生物衰老非常重要的調節機制。
1 衰老進程中自噬活動下調
近年來的研究發現，與年齡相關的細胞自噬活動下降能影響細胞功能，引起各種衰老表現。在哺乳動物衰老過程中巨自噬和分子伴侶介導的自噬活動(CMA)下降〔6，7〕，CMA的效率降低，將受損蛋白結合在溶酶體膜上及轉運進入溶酶體的活動明顯減弱。CMA是通過以熱休克蛋白70(HSP70)為主的分子伴侶，特異性的識別結合被降解的蛋白，然后在溶酶體膜上的受體LAMP2A(Lamp2A)作用下，轉運到溶酶體內進行降解的過程。研究發現衰老過程中CMA效率的降低是由于溶酶體膜上的受體LAMP2A表達隨著衰老進程進行性地減少造成的。進一步的研究表明〔7〕，在轉基因鼠中阻止衰老引起的LAMP2A的表達減少，即使在老齡的細胞中，CMA依然保持活躍的功能，尤其重要的是，CMA功能的維持與減低細胞內有害蛋白的積累和改善肝功能密切相關。除了CMA，衰老過程中哺乳動物組織細胞的巨自噬活動可能也受到抑制，大量的研究表明，衰老能夠影響巨自噬活動，尤其是影響巨自噬對功能缺陷的線粒體的降解〔3，8〕。對線蟲的研究發現兩種自噬基因沉默的野生型線蟲和DAF2突變體的壽命會縮短〔9〕。另外，對其他真核生物，如酵母、果蠅等的研究也觀察到了自噬對衰老的調節作用〔10〕。對擬南芥研究發現，剔除自噬相關基因(Atg)Atg7、Atg4和Atg9，植物能正常生長，但是卻加速葉片衰老，增強對病原菌和碳饑餓的超敏反應〔11〕。
2 自噬活動增強具有抗衰老作用
細胞自噬通過保證細胞蛋白質組穩定和細胞器更新能阻止或者減緩細胞衰老進程。有研究認為抗脂藥物的抗衰老作用可能是基于細胞自噬活動的增強〔12〕。用雷帕霉素或者海藻糖處理增強自噬的降解作用，可能對帕金森綜合征等蛋白沉積性疾病模型具有治療作用〔13〕。最近研究表明，一種p62蛋白在通過自噬攝取泛素化蛋白聚合物的過程中具有關鍵作用，p62能與聚泛素化蛋白結合形成聚合物，也能與自噬效應蛋白LC3 （LC3）相互作用，介導自噬對蛋白聚合物的攝取。p62缺乏能引起小鼠肝細胞和神經元細胞蛋白聚合物的沉積〔14〕。
線蟲是細胞衰老和長壽研究常用的模式生物之一〔5〕。研究發現，線蟲DAF2功能缺失突變能夠誘導成蟲表現出滯育樣的代謝變化，明顯延長線蟲的壽命。而線蟲與哺乳類Beclin1基因同源的自噬基因bec1是線蟲DAF2功能缺失突變體耐受態形成和壽命延長所必需的，顯然線蟲耐受態的形成和壽命的延長與自噬率的增加有關〔15〕。在線蟲或者哺乳動物，限制熱量都是延長壽命的研究中常用的實驗手段。限制飲食的過程中能誘導自噬的發生，抑制自噬對進食充足線蟲的壽命沒有影響，而影響限制飲食線蟲的壽命，自噬對飲食限制的反應受到轉錄調節。同時還發現，壽命延長除了需要誘導自噬發生，還需一種轉錄因子DAF16/FoxO的表達，研究者認為自噬為細胞提供新的物質來源，而轉錄因子DAF16/FoxO負責將這些原材料轉化為保護性的蛋白以延長線蟲的壽命〔16〕。
另外有研究認為自噬激活的水平對線蟲壽命的調節具有重要的作用，在生理水平下，能夠促進生存，而低于或者超過生理水平都引起線蟲的死亡〔17〕。對線蟲的研究還發現，在DAF2突變體中自噬的增加能夠增強對β淀粉樣蛋白的降解，以對抗衰老過程線蟲細胞淀粉樣物質積累引起的蛋白毒性〔18〕。
3 長壽途徑與自噬的調節
隨著在細胞水平上自噬對衰老調節作用的認識，人們開始進一步在分子水平上探討調節自噬和衰老的信號通路之間是否存在聯系。近年來，對于調節自噬降解活動的信號通路有了一定的認識，尤其是mTOR信號通路和Beclin 1的調節作用。而且研究發現調節抗逆境和抗衰老進程的長壽途徑，如FoxO3，NFκB，p53 和 SIRT1等對自噬活動也具有有力的調節作用。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，連接胰島素、生長因子等上游信號對Atg1復合物等下游效應物的作用，是自噬的負調控因子〔19〕。NFκB信號系統是細胞對抗細胞損傷和環境傷害的防御機制誘導的重要信號通路，研究發現，NFκB信號通路通過激活mTOR激酶而抑制腫瘤壞死因TNFα誘導的自噬，或者通過下調Beclin 1和Atg5的表達抑制巨自噬活動。NFκB信號通路與自噬之間存在交叉對話，激活NFκB的上游激酶IKKβ和NIK都是自噬作用的靶蛋白〔20，21〕。
SIRT1是哺乳動物的一種沉默因子，是酵母Sir2蛋白的同源物，Sir2蛋白是公認的酵母抗逆和長壽因子，轉錄因子FoxO家族是調節細胞代謝、增殖和抗逆的重要因素，線蟲FoxOs就是調節耐受態形成和壽命極限的主要因素〔15〕。最近的研究發現STRT1和FoxO3相關的信號通路參與對哺乳動物自噬的調節。研究表明，在體外培養的細胞或者轉基因鼠體內，SIRT1能夠激活自噬作用，SIRT1/轉基因鼠的一些表型和Atg5/小鼠相似。研究還發現，SIRT1與自噬蛋白Atg5，Atg7 和Atg8的去乙酰化有關，表明長壽基因sir2和自噬降解過程的相關性。最近有研究發現，FoxO3能夠誘導LC3和Bnip3等激活自噬活動的蛋白表達，而促進細胞降解作用，維持生物體的能量代謝〔22〕。
機體細胞脫離衰老過程可能會發生癌變，p53是一種抑癌基因，它的失活能引起腫瘤發生。p53對自噬作用跟細胞狀態有關，有研究發現，p53能抑制mTOR信號通路誘導自噬發生〔23〕，相反另一研究發現，p53表達下調能夠激活細胞的自噬活動〔24〕。對攜帶p53活性片段的轉基因鼠的研究發現，可能是由于細胞自噬的抑制和細胞凋亡誘導而表現出早老癥狀，而攜帶完整的p53及其等位基因和Arf的轉基因鼠，能夠激活p53的表達，使p53表達適度增加，但是卻表現出衰老延遲。由此推測可能p53Arf信號通路誘導p53在特定位置表達的適度增加能夠抑制mTOR，激活自噬，而p53的過量表達或者乙酰化增加活性增強，卻抑制自噬，表現出早老的癥狀〔25〕。
4 結論與展望
近年來人們開始關注自噬對生物體的生理和病理影響，同時，對于衰老過程的分子調節機制也有了進一步的認識。自噬對于衰老進程以及衰老相關的疾病都具有調節作用，適度激活自噬能夠延緩衰老，而且調節自噬和衰老的信號通路之間存在交叉重疊。對于二者相關性的研究有助于延緩衰老，并為蛋白沉積性疾病的治療提供了新的治療方向。雖然，對于自噬和衰老的相關性有了一定的認識，但是怎樣在衰老細胞中誘導適度的自噬活動延遲衰老進程、氧化應激在衰老進程中是否對自噬具有抑制作用、SIRT1是否通過自噬作用延長壽命以及增強自噬活動的藥物是否對蛋白沉積性疾病具有療效等很多問題仍有待于進一步的研究。
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篇2
2016年的諾貝爾生理學或醫學獎日前已經揭曉。在273位被提名的科學家中，日本科學家大隅良典（日文：大隅良典/おおすみよしのり；英文：Osumi Yoshinori）最后折桂，北京時間10月3日17：30分，諾貝爾基金會宣布將2016年的諾貝爾生理學或醫學獎授予大隅良典教授，以表彰他在自噬反應（autophagy）領域做出的卓越貢獻。
大隅良典，是日本分子細胞生物學家。他1945年生于日本福岡縣，1974年獲東京大學博士學位。在美國紐約洛克菲勒大學度過三年之后，他回到東京大學，并于1988年建立了自己的研究團隊?，F年71歲的大隅良典現任日本綜合研究大學院大學名譽教授、基礎生物學研究所名譽教授，大隅良典的專長是生物學，特別是分子生物學領域，其最知名的成就，是闡明細胞自噬的分子機制和生理功能，是細胞自噬研究的先驅。今年7月11日大隅良典在《Developmental Cell 》上宣布：他們成功探明了細胞自噬（autophagy）的啟動機制，這對預防和治療由細胞自噬引發的多種疾病有重要意義。
諾貝爾生理學或醫學獎評選委員會在10月3日的新聞公報中指出，大隅良典的研究成果有助于人類更好地了解細胞如何實現自身的循環利用。在適應饑餓或應對感染等許多生理進程中，細胞自噬機制都有重要意義，大隅良典的發現為理解這些意義開辟了道路。
細胞自噬是近年來熱門研究領域，詞語“autophagy”源自希臘詞語“auto-”和“phagein”，前者意思是“自我”（self），而后者的意思則是“去吃”（eating），而“自噬”表示的字面意思是就是“自己把自己吃掉”（self-eating），實則是一種細胞自身成分降解和循環的基本過程。通俗地說，細胞可以通過降解自身的非必需成分來提供營養和能量，也可以降解一些毒性成分以阻止細胞損傷和凋亡。
正是通過大隅良典等科學家的不懈努力，現如今我們知道：細胞自噬是真核細胞內廣泛存在的一種高度保守的生命現象，是細胞在缺氧、饑餓等應激條件下通過自我分解受損、變形或失去功能的蛋白質和細胞器以維持細胞內環境的穩態和基因組穩定性的一種方式，有利于使細胞在生長或環境改變導致的應激和壓力條件下獲得生存優勢。它既是細胞的一種自我保護機制，也是一種與凋亡并列的程序性死亡機制。
發現細胞自噬機制的艱難歷程
在大隅良典等科學家的不懈努力下，今天我們對細胞自噬有了一定的了解，可是，搞清細胞自噬機制卻歷經了很多坎坷。
上世紀中期，科學家發現，細胞能將自己內部的多余的蛋白質和細胞成分打包在一起用膜包起來（也被稱為“自噬體”），形成囊泡并運送到溶酶體（細胞中的小隔間，可以降解細胞成分），從而將其降解。打個比方，就好像打包好自己家的垃圾，通過垃圾車拉走，送到了垃圾回收站。
研究人員發現，正常大鼠肝細胞中存在包含退化細胞質的膜結構，但其豐度在灌注胰高血糖素之后或暴露于有毒物質之中時會大幅提升。在認識到這種結構具有消化細胞內部分內容物的能力后， 1963年，克里斯汀？德?迪夫創造了“自噬”這個詞，并在發表的文章中廣泛討論了這個概念。
幾年后，基于電子顯微鏡的觀察結果，科學家發現了哺乳動物細胞中也存在這種自噬現象。研究人員接下來發現：自噬現象本身處于低水平狀態，但在各種組織包括腦、腸、腎、肺、肝、前列腺、皮膚和甲狀腺的分化和重塑期間，這種現象加劇。此外，除了單細胞真核生物中存在自噬現象，在阿米巴原蟲、眼蟲、四膜蟲、昆蟲和青蛙等后生動物中也發現了這種機制。
在隨后的幾十年里，該領域的進展有限，其作用機制和規律并沒有得到很好的理解。當時人們還弄不明白細胞為什么要這樣做，以及我們人類細胞是否也存在這樣的行為。
直到上世紀90年代初，近30年過去，許多根本性問題仍無法確認：自噬過程是如何啟動的？自噬體是如何形成的？自噬對細胞和有機體的存活有多重要？自噬在人類疾病中扮演什么角色？大隅良典的工作顯著改變了人們對這一重要細胞過程的理解。
相關專家介紹，大隅良典的重要成就是利用酵母開展實驗，發現了對細胞自噬機制具有決定性意義的基因。基于這一研究成果，他隨后又闡明了自噬機制的原理，并證明人類細胞也擁有相同的自噬機制。
20世紀90年代，大隅良典帶領其研究團隊以酵母菌作為生物細胞的模板在研究細胞自噬的啟動和進展過程獲得重大突破，證明了酵母菌內存在細胞自噬現象，找到了識別和描述細胞自噬過程中重要基因的方法，并確認了細胞自噬機制上的15個起關鍵作用的基因。
大隅良典用面包酵母作為模型系統研究自噬，在檢驗了酵母細胞中確實存在自噬現象后，他開發出一種方法，能夠識別和鑒定涉及這些過程的關鍵基因，他將第一個發現的突變基因命名為自噬基因1（APG1），隨后報告了一系列真核細胞自噬機制必不可少的基因，命名為APG1-APG15。隨著在酵母和其他物種中鑒定出的新自噬基因，ATG作為基因縮寫命名在此后的學術研究中得到統一使用。
1993年，大隅良典發表了他在酵母15個基因中的開創性發現。隨后，他在酵母和哺乳動物細胞中克隆了這些基因并闡明了編碼蛋白質的功能。
在接下來的幾年中，大隅良典克隆了ATG基因，并描述了一系列蛋白質產物的功能，包括在實驗室證明自噬能參與調解細胞物質合成、降解和重新利用之間的代謝平衡，影響生物生命過程特別是響應饑餓等方面的作用。
基于大隅良典的開創性發現，自噬在人體生理和疾病中的重要性現在獲得了廣泛認可。同時，大隅良典的先驅性研究激起科學家對自噬的巨大興趣。該領域已成為生物醫學研究的最熱門領域之一，自2000年起相關出版物的數量顯著增加。
2001年，東京大學的生物化學與分子生物學教授Noboru Mizushima報道了Atg5的功能，這被認為是哺乳動物分子機制研究的第一環。2003年，以酵母的自噬相關基因為標準進行了統一命名，以“autophagy”中的字母ATG命名，后面加數字以區分不同的基因。2005年，密歇根大學生物化學家的Daniel Klionsky創辦了第一本自噬雜志。2016年，東京大學的研究團隊發現了Atg13在自噬啟動復合物中起到重要調節作用。
如何通過細胞自噬機制治療疾病
感謝研究者Yoshinori Ohsumi和其它從事后續研究的科學家們，如今我們知道，自噬能夠控制細胞中重要的生理學功能，細胞中的組分需要被降解并且回收利用，而自噬作用就能夠快速提供能量并且為細胞組分的回收利用提供基本的構件，同時自噬對于細胞對饑餓及其它壓力的反應也至關重要。
自噬過程是將細胞內代謝廢物以及一些無用或有損傷的細胞器裝到其獨特的運輸工具――自噬小體中，然后沿著特定路線送到“垃圾加工廠”――溶酶體中進行回收和廢物再利用。
通過自噬，細胞可以實現以下幾種情況的動態調節：（1）在細胞能量匱乏時降解自身的非必需成分來提供營養和能量；（2）降解細胞內的毒性成分以阻止細胞損傷和凋亡；（3）在饑餓、缺氧或細胞損傷等特殊情況下啟動應對壓力的促存活通路。與細胞凋亡相比，細胞自噬更接近于逆境中的自救措施，維持了細胞的基本生命活動。
在細胞面對饑餓和其它種類的應激時，“自噬”發揮著不可或缺的作用，好比“食堂”、 “凈化器”、 “兵工廠”、 “垃圾回收站”?！笆程谩保杭毎允赡芸焖偬峁┤剂瞎芰浚蛘咛峁┎牧蟻砀录毎考??！皟艋鳌保河醒芯堪l現，在腫瘤發展的早期，“自噬作用”通過減少細胞內“垃圾”（過氧化物）而維持細胞內環境的穩定，抑制腫瘤形成。相反自噬功能降低，會增加致癌風險?！氨S”：在遭受感染之后，細胞自噬能消滅入侵的細胞內細菌活病毒。“垃圾回收站”：細胞還能利用自噬來消滅受損的蛋白質和細胞器，這個質檢過程對于抵抗衰老帶來的負面影響有舉足輕重的意義。
“自噬”是把雙刃劍，由“自噬基因”來掌控。如果自噬功能紊亂可能會引發神經系統疾病、自身免疫病、衰老、感染甚至是惡性腫瘤。而即使自噬功能正常，也可能對人體不利。當癌癥患者接受了放化療后，自噬系統可能救活奄奄一息的癌細胞，使癌癥無法根治。偶爾它可能又會熱心過度，去除一些重要細胞，完全不理會這樣做是否符合生物體的整體利益。所以掌管著“自噬”各個階段的“自噬基因”就顯得尤為重要了，人們也正在進行緊張的研究以開發藥物，希望能夠自由地掌控這把“雙刃劍”。
近年來科學家發現，細胞自噬作用與生物發育以及許多人類疾病，如衰老、腫瘤、感染與免疫、心血管疾病、肌肉病變及神經退化性疾病等密切相關。 應該說細胞自噬受到熱捧的一個很重要原因就在于其與疾病的關聯。復旦大學附屬華山醫院內分泌科的研究指出，作為基礎性研究的“自噬”會從多方面對相關研究產生影響。
針對癌癥的治療
自噬在治療癌癥的方面有很大前景，如果細胞的自噬系統出了問題，正常細胞可能會轉化成癌細胞。如果我們能知道怎么控制細胞自噬過程，也許就能讓一些早期癌變的細胞通過加劇自噬的程度，讓這些細胞凋亡以免發展成為癌癥；另外還可以通過抑制癌癥細胞的自噬，配合其他綜合干預措施后，癌癥細胞就會因為缺乏營養而死掉。
針對包括帕金森癥在內的一些神經系統退行性疾病的治療
人體的神經細胞不可再生，自打出生以后就是那么多，所以神經細胞能不能長壽，自噬細胞起到了關鍵作用。如果不能有效清除垃圾，就有可能造成帕金森氏病、阿爾茲海默癥，這些病都跟神經細胞的不正常死亡有關。如果有辦法可以控制神經細胞的自噬過程，那么就可以及時清除神經系統的垃圾，從而延緩、改善甚至逆轉疾病。
2013年的一項研究就指出一種與細胞自噬作用相關的基因若出現異常，會導致一種罕見的腦病。這種罕見腦病被稱作“伴隨成人期神經退行性變性的兒童期靜態腦病”（SENDA），患者大腦萎縮并伴隨認知障礙。當時參與研究的科學家指出，自噬作用的異常，比如負責運送蛋白到溶酶體的自噬CMA過程出了問題，都有可能導致認知障礙。
針對糖尿病的治療
有觀點認為，絕大多數1型糖尿病是一種病毒感染后導致的胰島細胞自噬凋亡，而2型糖尿病則是人體脂肪細胞受到了某種刺激后出現了一種自噬分化現象，所以如果能夠進一步搞清楚自噬調控機制，就有可能為防治糖尿病提供嶄新的思路。
針對病毒和細菌感染的治療
病毒和細菌的感染是造成人類生病與死亡的主要原因，如果這些“侵略者”在細胞膜外面，免疫細胞就可以來對付他們，但如果像病毒那樣，入侵到細胞內部了，自噬過程或能保護細胞，集中精力攻擊病毒本身。有研究人員嘗試用自噬機制治療肺結核。
抗衰老
人體的衰老目前看來也是一種自噬受抑制現象，如果能夠激發或者重建人體細胞的自噬，那么就能夠完成細胞層面上的新陳代謝過程。
細胞自噬的典型特征是形成自噬體并呈遞給溶酶體，這一過程在蛋白質和細胞器質量控制中起基礎作用并維持了細胞能量的穩態。一些研究表明，自噬與細胞衰老密切相關，參與蛋白酶和自噬相關調節的BAG蛋白家族中BAG3/BAG1比值在復制性衰老時增高，且BAG3在細胞衰老時能介導自噬的激活。研究還發現在Ras誘導的細胞衰老進程中亦可觀察到較高的自噬活性。
細胞中的受損蛋白質積累是生物體衰老的一個重要特征。而細胞自噬可以擔任一個合格的“質檢員”，消滅受損的蛋白質，以對抗衰老帶來的負面影響。大隅良典的研究成果讓人們明白了細胞自噬的關鍵基因和運作機制，有助于人類更好了解細胞如何實現自身的循環利用，從而找到抗衰老的辦法。
自噬作用可能還能延長壽命
很多人都認為，許多疾病的發病幾率，都會隨著年齡的增長而升高。這可能是因為，年齡增大后，自噬作用的效率降低了。最新研究顯示，如果能阻止自噬作用的效率降低，實驗動物體內就不會有受損蛋白或細胞器的累積。
總之，自噬作用不但是細胞在養分不足時產生的應急反應，也是影響人類健康的重要因素。對于自噬作用，很多科學家開始從多個角度進行研究，對認識也在不斷深入。了解如何控制自噬作用，對于治療疾病甚至延緩衰老進程，都具有重大意義。
細胞自噬相關的增長點及投資熱點
細胞自噬概念已經提出了相當長的時間，自噬機制的研究一直是生命科學的熱門領域，不過，相關研究目前在臨床應用方面還并不明朗。
雷帕霉素（西羅莫司）現已被科學家發現，是激活細胞自噬重要的化學分子，能誘發細胞自噬作用。研究表明，雷帕霉素（西羅莫司）能通過抑制靶蛋白（mTOR），激酶的活性從而激活細胞自噬。在阿爾茨海默和帕金森病小鼠模型中，應用雷帕霉素治療能降低β淀粉樣蛋白的水平、提高對β淀粉樣蛋白聚集體的清除、抑制Tau蛋白過磷酸化等，但是目前雷帕霉素（西羅莫司）還沒有被批準應用于人體細胞自噬異常相關適應癥。
作為一種有效的自噬誘導劑，雷帕霉素（西羅莫司）通過誘導細胞自噬從而減輕炎癥反應，可能是其可以發揮免疫抑制的機制之一。目前雷帕霉素的衍生品已經獲得批準用于治療某些癌癥：腎癌、肺癌和乳腺癌。近10多年來，研究證明它不僅可延緩與衰老相關的疾病，如癌癥、心臟病和老年癡呆癥的病程進展，延長壽命，還能推延正常衰老所帶來的多種影響。
在臨床轉化方面，研究人員開發細胞自噬治療疾病的首個化學藥物是雷帕霉素（Rapamycin），這是一種經典的自噬誘導劑，可以通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）促進自噬的發生。雷帕霉素（Rapamyein）作為一種免疫抑制藥，當人體移植了新的腎臟或其他器官后，會自然產生排異，而它能抑制這種反應。
自1999年，美國食品和藥物管理局（FDA）批準雷帕霉素作為器官移植患者的藥物，迄今已拯救了數以萬計的移植患者的生命。此外，它還被應用于多種用途，如藥廠用于心臟支架的涂層材料上，用于防止產生癲痕組織，出現再狹窄。
作為全球最具權威性和影響力的獎項，諾貝爾獎對科技發展的引導作用非常明顯，這對于著重于相關技術研發的公司來說是個利好。細胞自噬相關藥物雷帕霉素（西羅莫司）生產企業首先將直接受益。
雷帕霉素原研廠家是惠氏（后被輝瑞收購），目前已被批準用于防止腎移植手術后的器官排斥反應等。國內獲得西羅莫司生產批文的企業包括華北制藥、浙江醫藥、華東醫藥、海正藥業和福建科瑞藥業。不過，據了解，目前西羅莫司作為一種免疫抑制劑藥物使用，主要是提供給器官移植手術的器官接受者，西羅莫司現在還沒有被批準用于細胞自噬異常相關疾病的治療或者預防。
篇3
[關鍵詞] 心肌細胞；心肌肥大；番茄紅素；血管緊張素Ⅱ；自噬相關基因
[中圖分類號] R542.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）11（c）-0011-04
The effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ
WANG Haining LI Jilin YAO Huaiqi YANG Baojun XU Tan
The First Affiliated Hospital of Shantou University， Guangdong Province， Shantou 515041， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ）. Methods Cardiac hypertrophy was induced by AngⅡ incultured neonatal rat cardiomyocytes. Morphology and expression of hypertrophy marker atrial natriuretic peptide （ANP） were detected by optical microscope and Real time PCR. Protein level of Atg6 （Beclin1） and autophagic marker， LC3 were tested by western blotting. Results Lycopene down regulated cell surface area [（355.82±40.45） vs （517.19±52.31）， F = 56.518， P < 0.05] and RNA expression of ANP [（12.16±1.41） vs （17.83±2.07）， F = 157.048， P < 0.05] in cardiac hypertrophy induced by AngⅡ. Lycopene increased expression of autophagy related gene Beclin1 [（0.685±0.058）， F = 202.873， P < 0.05] and LC3 protein [（0.608±0.045）， F = 177.114， P < 0.05]. Blocking autophagy by 3-MA could significantly reduce the impact of lycopene on myocardial hypertrophy induced by AngⅡ（P < 0.01）. Conclusion Lycopene may inhibit myocardial hypertrophy by activating autophagy.
[Key words] Cardiomyocyte； Cardiac hypertrophy； Lycopene； Angiotensin Ⅱ； Autophagy related gene
番茄紅素（lycopene，Lyc）是一種廣泛存在于紅色水果和蔬菜中的天然生物色素，屬于類胡蘿卜素一族，因最早發現于番茄中而得名[1]。目前國內外大量的研究證明Lyc不僅有極強的抗氧化能力[2]，還具有抑制炎癥因子表達、抗癌、預防衰老等多種生物學效應[3-4]。雖然，近年來有少量關于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制動脈粥樣硬化等文獻報道[5-6]，但到目前為止，未見有關于其在心肌肥大方面的作用和機制的研究。因此，探索其內在的作用機制對于尋找預防和控制高血壓等心臟肥大疾病的臨床有效治療具有重要的意義。
心肌肥大的本質是細胞合成代謝與分解代謝的失衡，機體主宰分解代謝的途徑主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是廣泛存在于真核細胞中一個保守的生物學現象，它是通過包裹待降解物形成自噬體，然后與溶酶體結合進行多種酶的消化及降解，參與機體受損細胞器和蛋白質的清除，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新、維持內環境穩定的重要方式[7]。微管相關蛋白1輕鏈3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特異性蛋白，分為胞質型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，筆者已經證實在心肌肥大中自噬受到抑制，阻斷自噬會促進心肌肥大的發展，而Lyc是否對心肌肥大產生作用，其作用是否與自噬相關尚未明確；本研究旨在AngⅡ誘導的心肌肥大中明確Lyc的作用，探討Lyc和自噬的關系。
1 材料
1.1 動物
SD乳鼠，清潔級，1～2日齡，汕頭大學醫學院實驗動物中心提供（SCXK粵2012-0017）。
1.2 主要試劑
DMEM-F12培養基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型膠原酶（B1067）（Gibco）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷BrdU（B5002），血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和3-甲基腺嘌呤3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相關蛋白1輕鏈3 LC3 Ⅰ/Ⅱ抗體（3868s），Bclin1抗體（3738s）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印跡發光液（WBKLS0100）（Millipore），四氫呋喃（THF）（tetrahydrofuran）和2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海寶曼生物科技有限公司）；無核酶水（9012），逆轉錄酶（DR100A），RNA酶抑制劑+脫氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。
2 方法
2.1 原代心肌細胞分離和培養
消毒乳鼠，開胸取心臟，用D-Hank's溶液去血污，分離心室。置入離心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶37℃消化10 min，棄上清，放入0.05%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化2 h。用上述胰酶重復消化1～2次，每次約6 min。將細胞懸液集中放入含10%胎牛血清培養基，均勻接種到培養皿，放置于5% CO2的培養箱60 min以分離成纖維細胞。以1×106/mL密度接種于6孔板，加入100 U/mL鏈霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纖維細胞生長，最后放入50 mL/L CO2培養箱內培養。接種24 h后80%的細胞生長成片并有規律搏動時，換無血清DMEM處理24 h后分組干預。在予以Lyc處理前，先將Lyc溶解于含有0.025%丁基羥基甲苯（BHT）的四氫呋喃。其在培養基中的濃度控制在0.05%（V/V），不會影響細胞活性。
2.2 細胞實驗分組
首先在AngⅡ（1 μmol/L）誘導的心肌肥大中，觀察Lyc（5 μmol/L）對細胞的作用，將心肌細胞分為四組進行干預：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc組（5 μmol/L）和Lyc組（5 μmol/L）；于48 h檢測心肌肥大的標志物ANP的mRNA表達水平。為觀察心肌肥大時Lyc（5 μmol/L）對自噬相關基因Beclin1和LC3蛋白的影響，將心肌細胞分為四組進行干預：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc組（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于48 h以Western blot法測定Beclin1和LC3蛋白的水平。
2.3 細胞鏡檢
用AngⅡ和（或）Lyc干預48 h的心肌細胞以4% PFA固定，顯微鏡400倍拍照，每組取50個同樣大小視野，利用圖像分析軟件Image pro plus 6.0計算細胞面積[9]。
2.4 Western blot檢測蛋白的表達
冰上裂解細胞30 min，收取蛋白。取總蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白以80 V，100 min轉至PVDF膜上；用50 g/L的BSA封閉1 h，加LC3B抗體（1∶1000）、GADPH抗體（1∶10 000）4℃孵育過夜；次日用TBST洗膜，與辣根過氧化物酶標記的抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h；用ECL顯影、曝光。采用圖像分析軟件檢測蛋白條帶的灰度值，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶的比值代表LC3蛋白的表達水平，其余以GAPDH作為參照[9]。
2.5 實時定量PCR
常規Trizol裂解法提取mRNA并逆轉錄成cDNA。參照文獻[9]做標準曲線和定量PCR體系。在Roche PCR分析儀器里擴增目的基因，反應條件為：94℃預變性5 min，然后94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30循環，72℃ 6 min。反應結束后，使用PCR儀配套軟件進行分析。重復3次，數據進行統計學分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。
2.6 統計學方法
采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，各組之間的差異用One-way ANOVA比較均值的單因素分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 Lyc在AngⅡ誘導心肌肥大中的作用
本研究從心肌細胞形態、細胞面積及心肌肥大標志物水平這三個方面，明確Lyc在AngⅡ誘導心肌肥大中的作用。將心肌細胞分為四組進行干預：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和Lyc（5 μmol/L）組；結果顯示，與對照組比較，AngⅡ刺激48 h后細胞面積增大（P < 0.01），心肌肥大標志物ANP的mRNA水平上調（P < 0.01）；Lyc結合AngⅡ干預，細胞大小和面積明顯減?。≒ < 0.05），ANP的mRNA比值顯著下降（P < 0.05）；而用Lyc本身對心肌細胞大小和形態無明顯作用（P > 0.05），ANP的mRNA比值無顯著影響（P > 0.05）（圖1、表1）。提示Lyc可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。
與對照組比較，**P < 0.01；與AngⅡ組比較，*P < 0.05
圖1 Lyc在AngⅡ誘導心肌肥大中的作用
表1 四組大鼠心肌細胞面積和ANPmRNA測定結果比較
（x±s，n = 5）
注：與對照組比較，**P < 0.01；與AngⅡ組比較，#P < 0.05
3.2 在心肌肥大中Lyc對自噬的作用
為明確在心肌肥大中Lyc對自噬的作用，將細胞分為四組：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc組（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于48 h以Western blot法測定Beclin1和LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反應自噬活性。結果顯示：與對照組比較，AngⅡ干預48 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平下降（P < 0.05），加入Lyc干預后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平有所增加（P < 0.05），而使用3-MA后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平迅速下降（P < 0.01）；3-MA（5 μM）對細胞本身無影響（圖2、3，表2）。
與對照組比較，*P < 0.05；與AngⅡ組比較，#P < 0.05；與AngⅡ+Lyc組比較，**P < 0.01
圖2 在心肌肥大中Lyc對LC3蛋白的影響
與對照組比較，*P < 0.05；與AngⅡ組比較，#P < 0.05；與AngⅡ+Lyc組比較，**P < 0.01
圖3 在心肌肥大中Lyc對Beclin1蛋白的影響
4 討論
從20世紀末人們發現服用Lyc能明顯降低前列腺癌的發病率至今，已有大量的流行病學調查、臨床研究和動物實驗證明Lyc具有極強的抗氧化能力，可以預防各種慢性疾病[8-10]。特別是在心血管疾病中，Lyc不僅可以降低血脂，降低收縮壓，減少心血管疾病的風險，還能緩解缺血/再灌注損傷[11-12]。但對于其是否有抑制心肌肥大的作用及相關機制，目前國內尚未有報道。本實驗首次在心肌肥大的模型上探討Lyc的作用和與自噬之間的關系。本實驗觀察到，AngⅡ干預心肌細胞后細胞面積明顯增大、心肌肥大標志物心房利鈉多肽（ANP）明顯上升，說明AngⅡ誘導的細胞肥大模型成功；然后加入Lyc干預發現，Lyc減少了AngⅡ誘導心肌細胞面積的增大，降低了ANP的升高，在一點程度上對心肌肥大起到了抑制作用。實驗進一步發現，AngⅡ誘導的細胞肥大中伴有自噬相關基因Beclin1和LC3蛋白表達的下降，而Lyc的干預卻促進了自噬相關基因Beclin1和LC3蛋白的表達。利用自噬阻斷劑3MA降低了Lyc對心肌細胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通過激活自噬來抑制AngⅡ誘導的心肌肥大。
自噬在心臟中的作用存在著爭議。早在20世紀80年代，人們就發現心肌細胞蛋白質合成增加和細胞肥大的同時，伴隨著自噬水平的降低[13]。21世紀初Nakai等[14]在橫主動脈縮窄誘導的早期心肌肥大模型中發現，自噬水平明顯低于假手術組，提示心肌肥大代償期，自噬活性顯著下降；此外亦有文獻報道自噬的激活劑雷帕霉素可以阻斷由主動脈縮窄[15]、甲狀腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆轉已經存在的心肌肥大[17]。最近的研究發現，FoxO3可通過上調自噬水平，使心肌肥大的心臟體積縮小[18]。目前關于Lyc對自噬的作用在心臟病中的研究是空白。筆者前期實驗表明自噬對于AngⅡ誘導的心肌肥大發展可能起抑制作用[9]。本實驗在細胞水平上明確了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻斷自噬會明顯降低Lyc對細胞肥大的影響，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一個重要環節，而Lyc是如何調控自噬，其具體分子機制仍需進一步的研究和探索。
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篇4
關鍵詞：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；順鉑（DDP）；骨肉瘤細胞
1實驗材料
1.1細胞來源 骨肉瘤MG63細胞購于中科院上海細胞庫。
1.2主要試劑 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、單丹黃酰尸胺（MDC）購于美國Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒購于上海碧云天公司。
1.3實驗儀器 流式細胞儀（美國BD公司）、酶標儀（美國Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（德國LEICA公司）、低溫高速旋轉離心機（美國Beckman公司）、細胞培養孔板（美國NEST公司）。
1.4試劑配制
1.4.1 MDC溶液 將1 mg MDC粉末溶于1 mL無菌水中，可獲得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL無菌水中，獲得實驗用50 μmol/L的最終溶液，置于4℃冰箱避光保存備用。
1.4.2 DDP溶液 取1 mL濃度為5 mg/mL的DDP，用無菌水稀釋到250 mL，即獲得20 μg/mL的DDP用于實驗，4℃冰箱保存。
2實驗分組
該實驗分為4組：空白對照組（加入等量的培養液做對照）、3-MA組（僅添加濃度為12.5 μg/mL的3-MA）、DDP組（僅添加濃度為20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP組（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同時添加）。
3實驗方法
3.1細胞培養 骨肉瘤MG63細胞培養于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。在濕度飽和的情況下，培養于5%CO2、37°的培養箱中，隔天換一次培養液，3 d傳代1次，取適量對數生長期的細胞進行下一步實驗研究。
3.2 MTT比色法 外源性MTT在活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶作用下能夠還原成藍紫色結晶甲，且該結晶物質不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲溶解，在490 nm波長處可以用酶標儀檢測光吸收值，在死亡細胞中不存在上述反應過程，檢測不到吸光度值，從而可以用來比較不同組之間細胞增殖率。取細胞數為1×108個/L，種植于96孔板中，分別在每孔添加等量的細胞懸液，細胞培養液培養10 h后根據實驗分組在3個組中加入相應的藥物，在恒溫（37℃）5%CO2的環境下培養24 h后，將每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，搖擺15 min，然后在酶標儀上檢測不同組的吸光度值（A）。結合以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=（實驗組A/對照組A）×100%。
3.3 MDC染色法 單丹黃酰尸胺（MDC）被細胞吸收后蓄積于嗜酸性的細胞囊泡中，在熒光顯微鏡下可以看到藍綠色或黃綠色點狀結構出現在細胞核周圍，經常被用來檢測細胞自噬囊泡的存在。取處于對數生長期的骨肉瘤MG63細胞（細胞數為1×105個/mL）加入24孔細胞培養板中培養12 h待細胞貼壁后根據實驗分組加入相應濃度的藥物繼續培養24 h，24 h后加入MDC溶液（濃度為50 μmol/L）避光環境中培養1 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌，然后用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡差異；同樣方法，經相應藥物處理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，然后分別收集各組細胞（不能收集倒置熒光顯微鏡觀察過的細胞，以免影響細胞熒光強度），用流式細胞儀檢測不同組細胞熒光強度。
3.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 磷脂酰絲氨酸位于正常細胞膜的內側，但是在細胞凋亡的初期，磷脂酰絲氨酸從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，出現在細胞外環境中，也就是所謂的磷脂酰絲氨酸外翻。Annexin-V是一種分子量為35~36 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結合。 Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒是用帶綠色熒光燈熒光探針FITC標記的Annexin，直接用流式細胞儀檢測磷脂酰絲氨酸外翻這一細胞凋亡的重要特征，可以使壞死細胞呈綠色熒光。而碘化丙啶（PI）可以將壞死細胞和凋亡晚期失去細胞膜完整性的細胞染成紅色。因正常細胞不被FITC和PI染色，所以二者結合可以較準確檢測細胞凋亡情況。將細胞數為1×105個/mL的骨肉瘤MG63細胞種植于6孔板中培養，待細胞貼壁后，結合試驗分組加入相應藥物干預24 h，然后分組收集、離心細胞，PBS洗滌，按照Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒說明進行操作，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比較各組間差異。實驗重復3次。
3.5統計學分析 用均數±標準差（x±s）表示實驗結果，在SPSS 17.0統計軟件幫助下進行統計學分析，多組間差異用單因素方差分析進行比較，取P
4結果
4.1 MTT法檢測各組細胞增殖抑制率 MTT法檢測結果顯示：與對照組相比，單獨添加3-MA對細胞增殖沒有明顯影響；單獨添加DDP細胞增殖率為（47.6±3.1）%；與單獨添加DDP相比，同時添加3-MA和DDP組細胞增殖率為（27.1±2.8）%，增殖率下降，P
4.2 MDC染色檢測細胞自噬 MDC染色后在細胞核周圍出現黃綠色的自噬空泡，與單獨添加DDP組相比，3-MA和DDP同時添加組細胞自噬空泡較少。經倒置熒光顯微鏡拍片后顯示，見圖1。通過流式細胞儀檢測各組熒光強度差異，結果提示：對照組為（83.1±8.2）%，單獨添加3-MA組為（89.8±9.5）%，單獨添加DDP組為（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同時添加組為（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同時添加組與單獨添加DDP組相比，P
圖1 不同組MDC染色后自噬空泡的變化
4.3流式細胞術檢測細胞凋亡 經流式細胞儀檢測我們發現，單獨添加3-MA組細胞凋亡率為（2.5±0.4）%；單獨添加DDP組為（12.5±1.1）%，與對照組相比，P
圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率
5討論
骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性是決定治療效果的關鍵因素，據統計仍有10%~25%患者對化療反應較差，根本原因在于對化療藥物產生耐藥性[1-2]。另外，臨床上不合理、不規范的使用化療藥物也可引起腫瘤細胞對藥物產生耐藥性，將嚴重影響治療效果。近些年多數研究[3-4]認為骨肉瘤的耐藥性與多種腫瘤基因位點或傳導通路有關，如骨肉瘤的生長、發展或耐藥性與信號傳導子STAT3通路的激活存在一定的相關性；腫瘤細胞對甲氨蝶呤耐藥與異位轉染miR-140存在聯系等。由于新的化療方案的實施，外加新的化療輔助藥物的應用，能很大程度上控制骨肉瘤的發展，產生良好治療效果[5-6]。為了尋找更有效、更廣泛的腫瘤化療輔助藥物，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對腫瘤耐藥性的影響日益引起大家的關注[7-8]。
順鉑屬于細胞周期非特異性藥物，結構類似于雙功能烷化劑，在DNA復制過程中發揮抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等實體惡性腫瘤中應用較廣泛。自噬是細胞通過自身來消除細胞內部衰老或死亡細胞來維持內環境穩定的過程。3-甲基腺嘌呤可以通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬體與溶酶體形成自噬溶酶體，進而發揮抑制作用，是一種常見的自噬抑制劑，廣泛應用于自噬相關基礎研究[9]。MDC是特異性自噬體標記物，被MDC染色的細胞核周圍可見藍綠色或黃綠色點狀結構，常用來檢測細胞自噬囊泡[10]。
本研究結合臨床中順鉑在骨肉瘤化療中的應用，借助自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤來說明自噬在骨肉瘤化療過程中的作用。經MTT比色法檢測，我們發現3-MA+DDP組細胞增殖率明顯低于單獨添加DDP組，P
隨著人們對自噬與腫瘤發生、發展機制研究的深入，我們不難發現通過調控自噬可以克服腫瘤耐藥性，促進細胞凋亡，為臨床獲得良好的治療效果提供實驗依據，該研究也證實調控自噬在改進腫瘤治療方案中有更寬闊的研究前景。但是如今，自噬抑制劑不能在臨床上應用的主要原因主要有：①自噬在臨床上還沒有特異性的抑制劑，實驗中應用的藥物還不能直接應用于臨床。②在臨床上對自噬水平的檢測到目前為止還沒有一個客觀定量的方法，比如根據一個血液標本或者腫瘤組織就可以檢測到自噬水平。這兩點也正是我們下一步繼續努力研究的方向。
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篇5
基金項目：蘇州市2013年“科教興衛”青年科技項目（KJXW2013026）
作者單位：215007 江蘇省蘇州， 蘇州大學附屬第二醫院急診與重癥醫學科[陸件（在讀碩士研究生）、錢會銀（在讀碩士研究生）、劉勵軍、周保純、肖鹽]，心內科[毛錦寧、安國印（在讀碩士研究生）]，血液科[芮明忠（在讀碩士研究生）]，檢驗科[王濤（在讀碩士研究生）]；南通大學醫學院電鏡教研室（朱昌來）
通信作者：劉勵軍，Email：
【摘要】目的 觀察亞低溫（MH）對心肺復蘇（CPR）后海馬神經細胞活性氧（ROS）產生量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）mRNA和自噬相關蛋白輕鏈3（LC3）表達的影響。方法 65只健康成年雄性SD大鼠隨機數字法隨機分為2組：空白對照組（BC，n=5）；CPR組（n=60）。CPR組制作窒息法心肺復蘇模型，在自主循環恢復（ROSC）后再隨機分為2組：常溫CPR組（NT）和低溫CPR組（HT）。NT組在ROSC后保持37 ℃恒溫，HT組在ROSC后立即行低溫32 ℃干預4 h。根據觀察時點的不同，再將兩組CPR組隨機分2個亞組：即 ROSC后12 h和24 h組（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。到達觀察時點先對存活大鼠進行神經功能缺損評分（NDS），然后立即取雙側海馬組織，應用流式法檢測大鼠海馬單細胞懸液ROS水平。利用透射電鏡觀察海馬神經細胞細胞核和線粒體的超微結構形態學變化。利用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術測定海馬神經細胞caspase-3mRNA的表達水平；蛋白免疫印跡法（WB）測定海馬神經細胞LC3蛋白水平。應用SPSS 19.0軟件包，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。結果 60只大鼠中有44只（73%）成功ROSC，存活到觀察時點的有33只大鼠（55%）。NT和HT組各時點的NDS明顯低于BC組（F=8.107，P
【關鍵詞】亞低溫；心肺復蘇；活性氧；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；輕鏈3；自噬
The impact of mild hypothermia on the ROS and expression of caspase-3mRNA and LC3 of hippocampus nerve cells in rats after cardiopulmonary resuscitation Lu Jian， Qian Huiyin， Liu Lijun， Zhou Baochun， Xiao Yan， Mao Jinning， An Guoyin， Rui Mingzhong， Wang Tao， Zhu Changlai. Department of Emergency and Critical Care Medicine， The Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， 215007， China
Corresponding author： Liu Lijun， Email：
【Abstract】Objective To observe the impact of mild hypothermia （MH） on the reactive oxygen species （ROS） and expression of cacpase-3mRNA and light chain 3 （LC3， a subunit of immunoglobulin） in hippocampus nerve cells of rats after cardiopulmonary resuscitation （CPR）. Methods A total of 65 healthy male Sprague Dawley （SD）rats were randomly（random number） divided into 2 groups： blank control group （n=5） and CPR group （n=60）. Cardiac arrest （CA） was induced in rats of CPR group by asphyxia. The survival rats after CPR were randomly（random number） divided into 2 groups： normothermia CPR group （NT） and hypothermia CPR group （HT）. Homeothermia of 37 ℃ was maintained in NT group after restoration of spontaneous circulation （ROSC）， and hypothermal intervention to 32 ℃ was carried out in HT group for 4 hours immediately after ROSC. Both NT group and HT group were then randomly divided to 2 subgroups 12 hours and 24 hours after ROSC （NT-12， NT-24， HT-12， HT-24 subgroups）. During observation， the neurological deficit （NDS） of rats was scored， then the bilateral hippocampi were obtained from rats' head， and monoplast suspension of fresh hippocampus tissue was made immediately to determine the level of intracellular ROS by flow cytometry. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure changes of cellular nucleus and mitochondria. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to determine the expression of caspase-3mRNA and Western-blotting （WB） was used to determine the level of LC3 in frozen hippocampus tissue. Measured data were analyzed with paired sample T test and One-Way ANOVA. Results Of 60 rats with CA， 44 were successfully resuscitated （73%） and 33 survived until the end of the experiment （55%）. The NDSs of rats in NT and HT groups were significantly reduced in comparison with BC group （F=8.107， P
【Key words】Mild hypothermia； Cardiopulmonary resuscitation； Reactive oxygen species； Caspase-3； LC3； Autophagy
隨著心肺復蘇（CPR）技術和急診醫學的發展，大多數心臟驟停（CA）患者能恢復自主循環，但均遺留有不同程度的神經功能障礙，造成家庭和社會的巨大負擔[1]。神經細胞凋亡是CA后存活患者神經功能障礙的主要病理生理過程，如何預防和控制CA后腦神經細胞凋亡的發生和發展是減少繼發性神經功能障礙的重要治療措施之一[2]。腦神經細胞在缺血缺氧后凋亡的發生與細胞自噬程度密切相關[3]，這種自噬與凋亡的關系以及其調節機制尚需進一步的明確。本研究采用窒息法大鼠心肺復蘇模型，來觀察亞低溫（mild hypothermia， MH）對CPR后大鼠海馬神經細胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）產生量和神經功能的影響，并探討其相關機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物分組
采用雄性健康成年SD大鼠[由中科院上海動物實驗研究所提供，合格證號：SCXK（滬）2007-0005，周齡16～18 周，體質量（450±45）g，共65只；隨機（隨機數字法）分為兩組：空白對照組（BC，n=5）、CPR組（n=60）。BC組用3.6%水合氯醛（批號：120203，國藥集團化學試劑有限公司）按10 mL/kg進行腹腔內注射麻醉后，氣管插管和股動、靜脈置管，不建立窒息CPR模型，待穩定后開始計時，到達觀察時間點后進行NDS，然后在麻醉狀態下處死大鼠取腦。CPR組在麻醉后，氣管插管和股動、靜脈置管，并復制窒息大鼠CPR模型（詳見模型制備），待成功自主循環恢復（ROSC）后，再將大鼠分為常溫CPR組（NT）、低溫CPR組（HT）。NT組在ROSC后保持其體溫在
37.0 ℃，HT組在ROSC后立即予32 ℃低溫干預，持續4 h后開始緩慢復溫至正常體溫。根據觀察時點的不同，再將上述CPR組大鼠隨機分為2個亞組，即ROSC后12和24 h組（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。
1.2 模型制備和神經功能缺損評分
模型參照Idris等[4]所建立的方法進行。用3.6%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后將大鼠固定于鋪有控溫毯（型號：MODLE6900，深圳瑞沃德公司）的操作臺上。大鼠氣管插管后用24 G套管針行股動、靜脈置管，股動脈置管成功后接壓力換能器。所有大鼠均行心電、肛溫及有創動脈壓監測（8導生物信號采集系統MD3000，安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）。操作完成后再穩定5 min，期間予心肺復蘇裝置（型號：A-CPR-IIC，中山大學心肺腦復蘇研究所）機械通氣，心肺復蘇裝置參數如下：呼吸頻率100次/min、潮氣量6 mL/kg、吸氧體積分數100%通氣1 min，然后將吸氧體積分數改為21%繼續通氣4 min。采用呼氣末夾閉氣管導管模擬窒息，CA判定標準如下：收縮壓（SBP）≤25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并持續至心電圖呈直線。此后，開始復蘇，予機械通氣 （呼吸頻率50次/min，潮氣量6 mL/kg，氧濃度100%）；同時，使用心肺復蘇裝置進行胸外心臟按壓，頻率250次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3。復蘇開始10 s后，經股靜脈注射腎上腺素（批號：120505，上海禾豐制藥有限公司）（0.01 mg/kg）。CPR后ROSC的標志：出現自主心律和SBP≥60 mmHg，
并持續10 min以上[4]。復蘇前和復蘇時動物肛溫均控制在（37.0±0.5）℃。HT組在復蘇后立即予控溫毯、冰袋和風扇等降溫措施將肛溫降至32 ℃，持續4 h后再以0.5 ℃/h的速度緩慢復溫至37.0 ℃。到達觀察時點先按Geocadin等[5]的方法進行神經功能缺損評分（neurological deficit scores， NDS），然后在麻醉下處死大鼠獲取海馬組織標本。
1.3 檢驗取材方法
CPR組大鼠在窒息前、ROSC后0.5 h和4 h均從股動脈抽取0.5 mL動脈血（取血后補充等量生理鹽水）行血氣分析。各組大鼠在到達觀察時間點之前均予5%GNS灌胃（10 mL/kg，1次/6 h），到達相應的觀察時間點后，先對大鼠進行NDS，然后在麻醉狀態下心內注射10%氯化鉀2 mL處死大鼠，切開胸骨，分離心包，暴露心臟，將穿刺針經左心室送入升主動脈，剪開右心耳，經心臟快速灌注4 ℃生理鹽水250 mL至右房流出液清，迅速斷頭取腦，分離雙側海馬。左側海馬切取2/3立即在冰上研磨制作單細胞懸液，剩余1/3行電鏡觀察；右側海馬-80 ℃凍存，用于caspase-3mRNA和LC3B表達的測定。
1.4 流式細胞儀檢測細胞內ROS水平
左側海馬取出后切取2/3在冰上用裝有冷PBS的玻璃勻漿器內勻漿10次，經300目尼龍過濾網過濾，收集濾液600×g 4 ℃離心5 min，棄上清，冷PBS重懸沉淀，反復吹打后再離心，重復上述操作3次，最后用冷PBS重懸沉淀，用活性氧檢測試劑盒（貨號：S0033，碧云天生物技術研究所）中的DCFH-DA按1∶1000的濃度裝載探針，37 ℃孵育20 min后用PBS洗滌3次，最后重懸后用流式細胞儀（型號：FACSCalibur，美國BD公司）檢測，分析100000個單細胞內的DCF熒光強度，取其平均值。
1.5 caspase-3mRNA表達測定
采用RT-PCR法測定：用Trizol（批號：120805，美國GIBCO公司）抽提RNA；逆轉錄mRNA至cDNA；再用PCR擴增儀（型號：9700，美國應用生物系統中國公司）擴增cDNA。由invitrogen上海提供合成引物，caspase-3引物：上游5’-GCA CTG GAA TGT CAG CTC GCA-3’，下游5’-GCC ACC TTC CGG TTA ACA CGA-3’，擴增產物大小559 bp；β-actin引物：上游5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，擴增產物大小300 bp。反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃終末延伸7 min。擴增產物用電泳儀（型號：三恒ECP3000，北京市六一儀器廠）電泳，電泳后攝片，并應用Vilber凝膠成像分析系統（型號：Type T2A，法國Lourmat公司）進行吸光度掃描，以目的條帶與β-actin的積分比值表示caspase-3mRNA的相對表達量。
1.6 LC3B表達測定
采用Western blot法測定：用蛋白裂解液RIPA（中）（貨號：P0013C，碧云天生物技術研究所）在玻璃勻漿器中裂解凍存組織，高速離心后得上清蛋白溶液。采用BCA蛋白含量測定試劑盒（貨號：P0010S，碧云天生物技術研究所）測定蛋白濃度；然后，用SDS-PAGE（貨號：P0012A，碧云天生物技術研究所）制備12%的分離膠和6%濃縮膠。加樣后恒壓100V電泳，電泳結束后轉PVDF膜，轉膜后加一抗（anti-LC3B 1∶1000；anti-GAPDH 1∶800）；過夜后加二抗（second anti-LC3B 1∶3000；second anti-GAPDH 1∶4000）。孵育后將膜包好進入暗室壓片并洗片，使用凝膠成像分析系統對膠片進行掃描分析，以特定的目標蛋白條帶OD值（volume）與內參蛋白GAPDH（volume）比值表示LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達水平。
1.7 透射電鏡標本制作
將左側海馬剩余1/3新鮮組織塊用手術刀片切成1 mm3大小，并用4%戊二醛固定，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗2次，每次15 min。1%鋨酸固定1 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗2次，每次15 min。30%丙酮脫水15 min，50%丙酮脫水15 min，70%丙酮飽和醋酸鈾過夜。過夜后再用80%丙酮脫水15 min，90%丙酮脫水15 min，100%丙酮脫水3次，每次10 min。將包埋劑與100%丙酮按1∶1比例放置1 h，然后將組織塊放入膠囊包埋，放入烘箱，制超薄切片并枸櫞酸鉛染色待檢。
1.8 統計學方法
用SPSS 19.0和office excel 2007統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較用成組t檢驗，多組間比較用LSD-t檢驗，以P
2 結果
2.1 CPR組大鼠窒息和復蘇時間以及存活情況
60只大鼠制模成功44只（73%），存活到觀察時點者33只（55%）。心臟驟停后大鼠主要復蘇措施以機械通氣和胸外心臟按壓為主。在復蘇過程中大鼠的心律未見長時間的心室顫動，故在復蘇過程中未使用心臟電除顫。各組大鼠窒息和復蘇時間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
2.2 CPR組大鼠基本生命體征及血氣分析變化
CPR組大鼠在窒息前、ROSC后0.5和4 h各項生命體征（除Tc外）差異無統計學意義（P>0.05）。動脈血氣分析結果比較，HT組ROSC后4 h乳酸水平明顯低于NT組（t=2.146，P=0.036），余各相同時點血氣分析指標間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、3。
2.3 ROSC后各組NDS情況
結果發現，CPR組各組大鼠的NDS顯著低于BC組（F=8.107，P
NDS滿分為80分，0分為腦死亡；BC：空白對照組；NT：常溫CPR組；HT：亞低溫CPR組；ROSC：自主循環恢復；NDS：神經功能缺損評分。NT和HT組與BC組比較，aP
圖1 各組NDS比較
Fig 1 NDS in each group
2.4 各組大鼠海馬單細胞懸液ROS的變化
與BC組比較，CPR組各組大鼠海馬組織單細胞懸液反應ROS水平的指標――DCF值均明顯上升（F=16.824，P
A：空白對照組；B：常溫CPR組ROSC后12 h；C：低溫CPR組ROSC后12 h；D：常溫CPR組ROSC后24 h；E：低溫CPR組ROSC后24 h。每組的左圖是通過流式細胞術分辨出的在單細胞懸液中不同的有形物質，白色箭頭標注的是所計數的單細胞群，右圖是該細胞群的平均熒光度
圖2 各組大鼠海馬單細胞懸液ROS檢測流式細胞圖
Fig 2 ROS flow cytometry in hippocampus monoplast suspension of each group
2.5 海馬神經細胞caspase-3mRNA表達水平
與BC組相比，CPR組各組大鼠海馬神經細胞caspase-3mRNA表達均明顯升高（F=24.527，P
BC：空白對照組；NT12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT24：低溫CPR組ROSC后24 h；ROSC：自主循環恢復。ROSC后NT和HT組的平均熒光強度與BC組比較，aP
圖3 各組大鼠海馬單細胞懸液ROS檢測結果比較
Fig 3 ROS compare in monoplast suspension of each group rats
A：目的基因caspase-3mRNA（559 bp）的表達。從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h；B：為內參照β-actin （300bp）的表達，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h。BC，空白對照組；NT，常溫CPR組；HT，低溫CPR組
圖4 各組大鼠海馬神經細胞caspase-3mRNA表達
Fig 4 Caspase-3mRNA expression in hippocampus nerve cells of each group
2.6 大鼠海馬神經細胞LC3B表達水平
與BC組相比，CPR組各組大鼠海馬神經細胞LC3B表達均明顯升高（F=6.584，P
2.7 透射電鏡觀察結果
ROSC后24 h取各組大鼠海馬組織作電鏡觀察?？瞻讓φ战M大鼠的海馬神經細胞核，核膜完整、光滑，核染色質分布均勻；線粒體，外膜完整，嵴光滑清晰可見，基質均勻。常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核體積縮小，核膜有皺褶，核染色質邊集、密度不均勻；線粒體體積明顯減小，嵴紊亂、粗糙，基質濃縮。低溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核體積略有縮小，核膜尚光滑，核染色質略有邊集，分布尚均勻；線粒體體積略有減小，嵴可分辨，基質濃度略不均勻。見圖8。
BC：空白對照組；NT-12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT-12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT-24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT-24：低溫CPR組ROSC后24 h。NT和HT組的caspase-3mRNA表達量與BC組比較，aP
圖5 各組大鼠海馬神經細胞caspase-3mRNA表達水平比較
Fig 5 Caspase-3mRNA in hippocampus nerve cells in groups
（A）目的蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ（16/18 kd）的表達，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h；（B）內參照GAPDH（36 000）的表達，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h。BC，空白對照組；NT組，常溫CPR組；HT組，低溫CPR組
圖6 各組大鼠海馬神經細胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達
Fig 6 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
3 討論
治療性低溫已成為心臟驟?；颊吣X復蘇治療的有效措施之一；然而，它也主要對院外心室顫動心臟驟?；颊哂幸妫崾镜蜏乜赡軆H對輕、中度腦損傷患者有益；但是其有效的主要機制仍有待研究。
BC：空白對照組；NT-12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT-12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT-24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT-24：低溫CPR組ROSC后24 h。NT和HT組的LC3B- Ⅱ/Ⅰ表達量與BC組比較，aP
圖7 各組大鼠海馬神經細胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平比較
Fig 7 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
A：空白對照組大鼠的海馬神經細胞核（×8000）；B：常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核（×8000）；C：低溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核（×8000）；D：空白對照組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）；E：常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）；F：低溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）；G：常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）被雙膜結構（黑箭頭所示）包圍形成自噬體
圖8 各組大鼠海馬神經細胞核和線粒體的超微結構變化
Fig 8 Electron micrographs of nucleus and mitochondria in each group
心臟驟停后全身各器官、組織和細胞缺血缺氧，使呼吸鏈傳遞電子的效能下降，并使電子受體減少，造成缺血區ROS的產生并未增加[6]。經CPR治療恢復自主循環（ROSC）后，再灌注血液中含有大量的氧，而此時線粒體呼吸鏈的酶活性卻未能迅速恢復，致使氧經單電子還原成氧自由基增多[7]。此外，Ca2+超載也使線粒體功能受損，細胞色素氧化酶系統抑制，最終使ROS的產生超過組織的清除能力[6]，進而造成細胞膜和細胞器不同程度受損，甚至引起細胞壞死和凋亡[8]。本研究結果表明，大鼠海馬神經細胞在缺血-再灌注（I/R）后胞內ROS明顯增高，這與細胞在缺血缺氧后發生級聯反應的結果是一致的。低溫治療使ROS的產生量較相同時點的NT組明顯減少（圖2、3），其原因可能與MH能降低ROS的產生，同時具有保護清除ROS的酶系統有關。
Caspase-3是凋亡通路的最后執行者，能從一定程度上反應細胞凋亡的程度[9]，已有研究結果表明，MH能通過減少神經細胞的凋亡而使神經功能得到保護[10]。本研究中發現，MH能顯著減少腦細胞I/R后ROS的產生量，并且與caspase-3mRNA的表達有一定的相關性。其原因可能是ROS的減少，通過抑制鈣介導的興奮性氨基酸與氧自由基之間的惡性循環，使caspase-3mRNA表達減少（圖4、5），在一定程度上降低了細胞凋亡的程度。
另外，自噬通常被認為是細胞的一種保護性作用，它在維持缺血缺氧等應激狀態下使細胞存活[11]，并清除細胞內衰老細胞器和錯誤折疊蛋白中起重要作用[12]。但是，近年來也發現，在某些條件下細胞自噬也能導致細胞死亡，即所謂過度自噬[13]。除利用電鏡可觀察自噬體形成外，還可以利用WB的方法檢測LC3的形成，從而判斷自噬發生的程度[14]。由于LC3B在腦中表達較多，可以用作腦細胞自噬的分子標志[15]。在自噬過程中，LC3-I被泛素樣體系修飾和加工，產生相對分子質量為16 000的LC3-Ⅱ，并被定位到自噬小體中。故此，自噬小體中存在的LC3I和LC3-Ⅱ均可成為細胞發生自噬的分子標志，并且LC3Ⅱ的含量和發生自噬的程度成正比[16]。本研究也發現，HT組LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達較相同時相點的NT組有所下降（圖6、7），表明MH減小了細胞的自噬程度，并可能是大鼠神經功能改善的原因之一（圖1）。提示大鼠復蘇后腦神經細胞發生的自噬是過度的、有害的。
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篇6
1.1、延安紅棗的現狀及問題
延安大紅棗是馳名中外的陜西傳統名優特產之一。其特點是果大核小，皮薄肉厚，質脆絲長，汁多味甜，甘美醇香，含糖量高，色澤鮮紅，水分較少，貯藏期長，品質優良。真乃“味奪石蜜甜偏永，紅邁朱櫻色莫論”，是色、香、味、形俱全的紅棗。
但現狀就如下面：
棗子青了、紅了，爛了、收了;棗農喜悅了、揪心了、希望又落空了……年復一年。每年9月底10月初,老天爺的"臉色"總是那樣地讓延安棗農揪心。延安大紅棗，牽扯到沿黃七縣近百萬群眾的一項大產業，今年遭災了嗎?收成如何?紅棗產業還面臨什么亟待解決的問題?
⑴信息不能很通暢的進行交流
農民們不知外面市場的需求量有多大，是否還可以擴大種植面積，獲得更多的利潤
⑵交通不夠發達
不能將如此好的產品銷售出去。(路難：肩扛背馱的棗農無奈)
⑶當年的棗不能很好的賣出
雖然外面對棗的需求很大，延安人手中有棗，但是不能很好的銷售出去。好多的棗由于在當年沒有賣出去到了以后就會出現好多的問題(發霉，生蟲等)
⑷目前紅棗的營銷模式局限于傳統的營銷模式，市場前景狹窄
銷售渠道不廣泛，導致了紅棗的銷售一直不是很理想，所以延安紅棗應該發展新的營銷模式 ⑴利用淘寶網店銷售會使得延安紅棗有個更好的前景
再好的東西得不到好的銷售，就會積壓在農民手中，就會失去它應有的價值。延安地區如果將迎來陰雨天氣，省氣象臺應及時提醒，紅棗成熟會受到影響。此外，還須加強地質災害的監測和預防。
目前紅棗的營銷模式局限于傳統的營銷模式，市場前景狹窄，銷售渠道不廣泛，導致了紅棗的銷售一直不是很理想，所以延安紅棗應該發展新的營銷模式。
我方在淘寶網上注冊了網店，就是為了讓更多的消費者可以買到他們想要的延安大紅棗。讓延安紅棗闖出陜西，走出中國，走向世界!
2、選擇延安大紅棗的理由
紅棗，盛名己久，。尤其延安延川縣的紅棗，更負盛名。延安延川縣東傍黃河，屬溫帶半干旱區，氣候干燥少雨，晝夜溫差大，日照時間長，延安大紅棗主要產于黃河沿岸，它以個大、核小、皮薄、肉厚、味醇、富含維生素c、d、p(蘆丁)、糖份、果膠物質、鐵鈣、磷，鉀等成分是名副其實的"果中皇后"。受黃河特殊的地理因素影響，是大棗的理想適生區。
紅棗的功效
1.減少老人斑
紅棗中所含的維生素c是一種活性很強的還原性抗氧化物質，參與體內的生理氧氣還原過程，防止黑色素在體內慢性沉淀，可有效地減少色素老年斑的產生。
2.保肝護肝
紅棗中所含的糖類、脂肪、蛋白質是保護肝臟的營養劑。它能促進肝臟合成蛋白，增加血清紅蛋白與白蛋白含量，調整白蛋促進肝臟合成蛋白，增加血清紅蛋白與白蛋白含量，調整白蛋白與球蛋白比例，有預防輸血反應、降低血清谷丙轉氨酶水平等作用。
3.防止落發
紅棗有健脾養胃之功能。"脾好則皮堅"，皮膚容光煥發，毛發則有了安身之處，所以常食營養豐富的紅棗可以防止發脫落，而且可長出烏黑發亮的頭發。
4.健胃補腦
中醫常用紅棗養胃健脾。如在處方中遇有藥力較猛或有刺激性藥物時，常配用紅棗，以保護脾胃，紅棗中含有糖類、蛋白質、脂肪、有機酸，對大腦有補益作用。用紅棗與面粉制成棗糕，能養胃補腦。
5.可補氣養血
“紅棗有補中益氣，養血安神”之功效。紅棗中的高維生素含量，對人體毛細血管有健全的作用。
延安紅棗好處如此之多，我們就借助網絡平臺，讓延安紅棗的銷售更上一個臺階，讓更多的人受益!
3、項目的可行性
3.1、目前農村電子商務的發展
目前，從對中國互聯網認識和使用的群體來看，絕大部分都集中于受過高等教育的人口。在電子商務迅速發展的情況下，農村電子商務出現了一些屬于自己買賣的平臺，秉承綠色、助農、至誠、共贏的價值觀，樹立開放式接入、專業化運營、市場化經營的經營理念，依托全省供銷社行業資源，建立專業的、開放的、涉及農產品的電子商務平臺"網上供銷社"，聯接城鄉、服務三農，努力打造一條從線下到線上的綠色農產品通道。網上供銷社全面整合供銷社行業資源，以最優質、最全面的服務，為農民兄弟解決“買難”、“賣難”問題
3.2、農村網絡使用的增長
近年來，農村經濟的不斷發展，農民的生活也火起來了，互聯網也相繼進入了各家各戶。
4、方案策劃
4.1、網絡廣告推廣營銷戰略
4.1.1、網絡廣告
①廣告目標
擴大陜北延安農村地區紅棗的知名度，使其更好地走向市場。
②廣告定位
篇7
姓名
性別
男
學號
分院
現代服務系
專業
實踐
單位
山東百利通亞陶科技有限公司
實踐
崗位
助理技術員
實習
時間
2021-09-10至2022-12-10
（一）實踐主要內容及進程
1. 對生產原料以及產品進行質檢，將不符合生產標準的原料、產品淘汰，提高成品率
2. 及時處理或上報各工序出現的的異常情況，恢復正常生產
3. 協助技術員做好組織生產工作，保證車間員工嚴格按照工藝標準及相關準操作規程進行生產
4. 負責設備工序的組裝與打包，對生產車間和設備進行日常維護
（二）主要收獲與體會
通過此次實習，我學到了如何運用所學知識解決處理簡單問題的方法與技巧，積累了一線的生產知識，增強了實踐操作技能，為專業課學習打下堅實的基礎。同時使我體驗到了社會工作的艱辛，磨練了自己的意志。更重要的是，我懂得了與員工同事相處溝通的有效方法途徑，積累了社會工作的簡單經驗，為畢業后走向工作崗位打下了一定基礎。
（二）對實踐單位的建議
1. 檢修器件后剩余材料、備件應注意重新入庫，避免造成浪費。
2. 生產車間需保持通風狀態良好，整潔。
3.
（四）實踐成果
1. 對車間生產流程、工藝標準以及有關注意事項建立了清晰的認識
篇8
自動化認識實習報告一
一、實習目的和任務
認識實習是實踐性教學環節中的重要組成部分，是實現本專業應用型人才培養的主要手段之一。通過實習使學生對工業企業生產過程和主要設備，以及自動控制在工業生產中的應用有一個全面、感性的認識，提高學習專業知識的積極性和主動性。
其任務是：通過參觀了解工廠的生產概況及生產組織和管理的一般情況，了解自動控制在工業生產中的作用，了解工廠電氣控制設備生產狀況，了解電氣控制技術的新工藝，新設備及電氣控制的新方向，了解工程技術人員、生產管理人員在生產和試驗過程中的作用和職責。
二、實習時間
20xx年6月21日-20xx年6月25日
三、實習地點
湘潭市各有關工廠企業【湖南京電開關廠、世通電氣、雙馬電氣、超宇科技和凌天科技】
四、實習內容
20xx.6.22 星期二 多云
今天我們參觀湖南京電開關廠，該廠位于湘潭市雙擁路27號火炬創新創業園，早上8：10后，我們坐車奔赴了目的地。
湖南京電開關廠是隸屬于國家電網公司中興電力實業發展總公司的全資企業，于1995年成立，廠房面積約7200平方米。注冊資本人民幣壹仟貳佰萬元整，是電力、冶金、礦山、煤炭、化工等行業高低壓電器和高壓低壓電氣成套設備的專業生產廠家,是湖南省電器行業的重點骨干企業。
該廠子分為兩層，我們首先參觀了第二層，我們去的時候，有些工人正在工作，那里的一個師傅給我們介紹了一些產品的性能、結構、原理等方面的知識，限于專業知識還沒有學到，部分東西還不能理解。但對這些產品有了感性的認識，同學們參觀時興趣盎然，都對這些以前沒有見到過的東西有著濃厚的興趣，我們幾個同學走到一個接線工人的工作臺觀察她接線，只見他技術嫻熟，接線速度很快，而且美觀。我們很多人在旁邊看了好久，都對她的接線技術贊不絕口，自嘆不如，我們覺得自己在以前的電工實習上接的線都比這個差了很多，同學們表示自己一定要多動手，把自己要做的事情做的美觀，就像接線工人接的線一樣結實、漂亮!
參觀完了第二層，我們來到了第一層，這里沒有工人在生產，有很多的開關都擺在這里，我以前總覺得開關是個非常簡單的東西，不就一開一關嗎?能有什么高級的開關么?事實證明我錯了，開關很多，我之所以這么想，就是以前接觸過的都是生活中見到的簡單的開關。在這里，我們看到了VSI型戶內高壓真空斷路器、KYN28A(GZSI)-12戶內交流金屬鎧裝抽出式開關設備、VJD中壓固封式真空斷路器、GCS型低壓抽出式開關柜和MNS型低壓成套開關裝置等設備。
在這里，我具體GCS型低壓抽出式開關柜的一些情況，我從掛在那個柜子上的說明書上了解到：這種低壓抽出式開關柜的主構架為兩種,全組合式結構和部分焊接式結構;裝置各功能室嚴格分開, 各功能室主要分為單元式、母線式、電纜式,各單元的作用相對獨立;水平母線采用框后平置式排列布置,以增加母線抗短路電流電動力的能力;電纜間采用上下進出線方式;按三相五線制或三相四線制;一個抽屜為一個單元, 抽屜尺寸分為一單元、二單元、三單元、二分之一單元、四分之一單元, 五個尺寸系列, 各單元回路額定電流在630A及以下。抽屜尺寸的變化僅僅為高度的變化, 其寬度、 深度不能變化,相同功能的單元可以互換。
MNS型低壓成套開關裝置我也了解了一下，它適用于發電廠、變電站、石油化工、冶金軋鋼、輕工紡織等廠礦企業和住宅小區、高層建筑等場所，作為交流50～60Hz，額定工作電壓交流660V及以下的電力系統的配電設備的電能轉換、分配及控制之用。
VSI型戶內高壓真空斷路器我也仔細地看了一下產品說明書，它有很多優點，其優點之一是：它的觸頭常采取對接式觸頭。因為一般的真空斷路器在分閘狀態下動靜觸頭的距離只有16mm這么小的距離很難制作出其他形狀的接觸面，而且平直的接觸面瞬間動作電弧的損傷也較小。真空斷路器的優點之一是體積小，動靜觸頭要在一個絕對真空的空間內動作，如果制作成其他的對接方式也會增加斷路器自身的體積!
說實話，我還不太懂得這些高級開關設備的原理，這次在京電開關廠的參觀使我對電器原理產生了更大的好奇，我一定在大三的時候努力學好專業知識，立志以后從事電氣行業，為電氣事業奉獻自己的綿薄之力。
自動化認識實習報告二
一、實習目的
1. 通過親身接觸自動化設備和實驗器材，并且通過老師及工廠人員的講解，對自動化專業進行初步的認識，在實踐中驗證、鞏固和深化已學的專業理論基礎知識。
2.加強對企業技術操作的理解，將學到的知識與實際相結合，運用已學的專業基礎課程理論知識，對實習單位的各項技術操作進行初步分析觀察和分析對比，找到其合理和不足之處，靈活運用所學的專業知識，在實踐中發現并提出問題，找到解決問題的思路和方法，提高分析問題和解決問題的能力。
3.見識電子控制類產品的設計、開發及維護等過程，理解自動化專業的發展動態與專業前景。
4.通過一定的實踐認知實習，為以后的畢業設計及論文撰寫做好鋪墊。
5. 讓我們了解到知識與現實之間的差距，提升自己實際的工作能力，領悟到現實工作中我們需要什么，我們應該朝哪一方面發展，對我們以后的發展指明了道路，為今后真正走上工作崗位打下良好基礎。
二、實習地點及時間安排
1.實習地點：
中冶連鑄技術工程股份有限公司
2.時間安排：
8：30 由武漢科技大學黃家湖校區出發
9：20 到達中冶連鑄技術工程股份有限公司，開始參觀
11:00 返回學校
三、實習單位介紹
中冶連鑄技術工程股份有限公司(簡稱中冶連鑄，CCTEC)，是由中國冶金科工集團(MCC)發起設立的科技型股份制企業。xxxx年，中冶集團在美國《財富》雜志評選的世界企業500強中，排名第280位。中冶連鑄總部設在武漢，是國內最大的以連鑄、板帶冷軋與表面處理為特色的冶金專業化技術工程公司;xxxx年7月，中冶集團宣布，中冶南方合并中冶連鑄，自此，中冶連鑄成為中冶南方的全資子公司。
公司主營業務為：方坯、板坯和薄板坯連鑄連軋工程，板帶冷軋與處理工程和工業電氣自動化控制系統。自動化專業認識實習心得。中冶連鑄現依托集團各項優勢在北京設立了分支機構，從事國內外海水淡化項目的投資、建設和運營。連鑄核心業務有：EPC工程總承包，事業部具有專業化連鑄技術研發、工程設計、設備制造能力的優勢，可以為客戶提供各類連鑄機(大小方坯、圓坯、矩形坯、異型坯、扁坯、板坯、薄板坯等)的設計、制造、安裝、調試一條龍工程總承包及單項服務;技術服務，事業部依靠專業化連鑄技術研發實力，為客戶提供連鑄生產工藝、品種開發、生產工藝訣竅、鑄坯質量問題診斷等相關技術服務;設備維護服務外包，事業部具有專業化連鑄設備制造、供應鏈管理能力，能夠提供連鑄設備維護服務外包，為客戶帶來良好的經濟效益。
公司人力資源實力：xxxx年初，公司已有職工854人，其中技術管理人員496人，擁有博士學位11人、碩士學位101人、高級工程師以上職稱83人。公司在北京設有自己獨立的研究院，擁有多項自主知識產權的核心技術，每年研發費用占營業額的5%#from 本文來自高考資源網gkstk.com end#，研發實力強大。中冶連鑄擁有專業的設備制造基地中冶易新科技，設備制造能力強大。主要機械、電氣設備在公司內部制造完成，產品質量和交貨期有保證。
事業部/子公司：連鑄事業部、海外事業部、北京科貿、斯瑞普科技、中冶易新科技、中冶重工。
四、實習內容
1月5日我們到了中冶易新科技股份有限公司，在實習開始，由公司員工李華剛師傅帶領全班同學對公司各個車間進行專業性的參觀，在車間里李師傅對同學們參觀中的疑問進行了專業、技術性的講解。在參觀過程中，李師傅針對我們專業對他們車間采用及開發的新技術、新設備進行了詳細的介紹，這對我專業知識的認識更深了一層。各個車間各司其職，但又緊密聯系，比如做一臺軋鋼機，它需要各個車間的配合，從最初的圖紙設計到最后的零件組裝要求毫無差錯，精密準確。
對于李師傅介紹的一些簡短又新鮮的名詞如銅排總、分控制機PID等，同學們疑惑百出，紛紛提出自己的疑問。而李師傅耐心的為我們在專業技術與知識方面進行了解惑，電子產品本來就更新速度快，在技術研發方面需要什么，大學生需要具備什么，專業的發展前景怎樣等問題他都做了非常詳細的介紹。因為他做該公司工作了挺長一段時間，所以對大學生他很了解，對我們在大學中應掌握的技能都做了一些要求，對專業知識的掌握以及在他們產品中占據的地位進行了解惑，讓我受益匪淺。
五、實習心得與體會
通過此次實習，讓我學到了很多課堂上更本學不到的東西，仿佛自己一下子成熟了，懂得了做人做事的道理，也懂得了學習的意義。我看清了自己的人生方向，也讓我認識到了從事電子工作應支持仔細認真的工作態度，要有一種平和的心態，創新的精神，應該擁有一顆隨時接受考驗的心，迎接未知的世界。
實習期間，我謙虛謹慎，認真聽取相關技術人員的指導講解，并能夠仔細觀察、切身體驗、獨立思考、綜合分析，也培養了我的耐心和素質，能夠做到服從指揮。感受到了提出疑惑和疑惑解決后的。對自己的專業也更喜愛，不再迷茫。
篇9
1、將瓜子裝到塑料袋，扎緊袋子，然后放入罐子密封，放點干燥劑，拿到避光陰涼干燥處存放或者放入冰箱冷藏，這樣能夠達到延長濕瓜子的保質期。
2、瓜的種子，特指炒熟了的做食品的倭瓜子、西瓜子等。又叫瓜子兒，俗名叫邊果。它的種類較多，有葵花子、海瓜子、吊瓜子、西瓜子、南瓜子、黃瓜子、絲瓜子等?？ㄗ邮窍蛉湛墓麑?，不但可以作為零食，而且還可以作為制作糕點的原料，同時也是重要的榨油原料，是高檔健康的油脂來源。
（來源：文章屋網 ）
篇10
一周的電工實訓進行的緊張有序，使我們有在車間實習體驗。這次實訓是對實際條件下的依次模擬考核，使用的電壓在220伏到380伏，所以對我們的要求很高，弄不好會有觸電的危險，還有燒毀儀器，在實訓開始前老師告訴我們，安全放在第一，不能馬虎，開電的時候要檢查一遍，還要通知其他人，以免觸電，老師又講了試驗時應注意的問題，然后我們按分好的組開始做試驗。
剛開始作一周實訓，以為要做很多試驗，發下材料一看才四個，這次電工實訓一共有四次試驗，第一個試驗是家用供電線路實訓，主要目的是要學會日光燈電路，一燈兩地控制，燈光可調電路，聲光延時電路，鍘刀控制電路的正確接法。以前我對家用供電線路的了解，只存在火線，零線。一些開關的連接，再實際生活中電是危險物，在家根本不叫碰，所以知道的不多。通過老師的講解使我們有了一定的了解，我們接的很順利，聲光延時開關必須用東西包住才能使燈泡亮。通過這次實訓讓我對家用點有了一定的了解。
第二個試驗是電動機反-正轉實訓，我們上學期有一定的理論知識，我想應該沒問題，可以做起來，可一做不是那一回事，接完后電機不轉，發現是接觸點不能吻和。我們將電壓改變后，電路恢復正常工作，電機開始反-正轉。這讓我懂的接線必須認真，不能馬虎。在做任何事都必須認真做。是我感受頗多。
第三個試驗電動機既可點動又可自鎖控制線路實訓，這個試驗線路和上一個沒有查別，在加上已經做過二個試驗，我們對電器的應用有一定的熟悉。操作起來就比較順利，我從中學到了很多，讓我對電機有了新得認識，可以順利的進行調控。
最后一個試驗是工作臺自動往返循環線路實訓，要求我們通過實際安裝接線掌握有電氣原理圖變換成安裝接線圖的方法，并掌握行程開關的作用，以及機床電路的應用。這個試驗很復雜，我們接完線，打開開關，可機床不動，我們檢查線路，發現一個地方沒有連線，我們把線接上，機床動了。雖然和試驗要求不一樣，但我們很高興，因為它動了，我們有把線檢查了好幾遍，沒有發現問題，我們很著急，把高頻調到低頻，還是不行，最后我們把1、2、3、4它們換個來，機床動了，我們成功了。
一周的實習期瞬間結束了，但一顆熾熱的心依然還在那實習的場地依依不舍，特別是對咱們的指導老師很是敬佩。
通過幾天的實習，使我懂了許多許多的道理，真可謂是“受益非淺”啦，這次我們的實習任務，雖然算不上很重，其任務就是按圖安裝一些簡單的照明電路。原理談不上很復雜，但是真正要安裝起來那得費一把勁，由于是四位同學共用一個工位，最重要的是雙方協作精神，這一點我體會最深。
做工有條不紊的進行著，這項工作需要特別的細心，弄不好的話很容易讓自己做的一切從頭再來。首先，必須把安裝的器材清好檢查是否完好，再次就是要運用巧勁把每副夾子上好，牢固，一下午下來人累得是筋疲力盡，但看到自己安裝的效果，還是感到很欣慰的，再過一年半我們就要步入社會，踏上自己的工作崗位，但我感覺到一周的學習期就是以后生活的寫照，我會運用自己的書本知識和實踐能力去撐穩，那在江中的風帆……
第一次看著電動機通過自己動手接線轉起來，那種感覺是自豪的。自己在心里會說：“呃，我也能讓電動機轉起來，哈，開心。加油，其實這蠻好玩的嘛”。
也培養了規范化的工作作風，通過這一次的電工的實訓。以及我團結協作的團隊精神。
再準備讓我接線。剛開始接線時我就按著圖接下來，老師總是先給我講一些理論的內容。一點秩序也沒有，所以接好了線看過去亂亂的像蜘蛛網一樣?，F在想到都覺得好笑。
比如安全用電常識、電工基本操作（怎么連接導線）電氣照明（主要是日光燈）還有一些常用的低壓電器（意所布的線布的先后順序，也因為電工課我解到很多我平時都不會認真去注意的常識。比如說布線時應把其他線都布好了之后再布開關的線，交流接觸器，繼電器等）行程開關的用法；電動機的結構和銘牌意義；控制電路故障分析與排除等。恩，總之，感覺學到東西還是蠻多的四次的電工對手親身體會到整體思考的重要性，布一塊好板就必須要有整的邏輯思維，布板要注意各元器件的空間排布還要注意到布線時線與線不能相交且要注
