乙型肝炎病毒C基因論文

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【摘要目的摘要:構建乙型肝炎病毒(HBV)截短C基因和前S1基因重組原核表達質粒，獲得融合蛋白的表達并進行抗原性分析.方法摘要:PCR擴增獲得截短C基因片段和前S1基因，雙酶切后克隆至原核表達質粒pET28a，轉化E.coliDH5α，酶切鑒定得陽性重組質粒pET28a并測序；然后轉化E.coliBL21，IPTG誘導融合蛋白表達,薄層掃描分析表達蛋白組成；可溶性分析后用Ni2+NTA凝膠親和層析柱純化、透析并濃縮融合蛋白，WesternBlot分析特異性和抗原性.結果摘要:成功構建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表達質粒pET28aCtpreS1，目的基因可高效表達，表達產物主要以包涵體形式存在，Ni2+NTA純化可獲得目的蛋白，純化蛋白具有良好的抗原性和特異性.結論摘要:HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表達并得到純化，為探究新型乙肝疫苗奠定了基礎.

【乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表達；疫苗

0引言

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)導致的病毒性肝炎目前尚無十分有效的治療辦法，疫苗接種是控制和預防乙型肝炎的重要手段，但部分人群對現有的疫苗不應答或低應答而導致接種失敗，因此需要研發新型HBV疫苗.我們利用基因重組技術構建含截短C基因和preS1基因聯合的原核表達載體，在大腸桿菌中表達融合蛋白并進行純化，初步分析其免疫性和特異性，為比較不同來源的HBV候選疫苗分子和深入探究HBV新型疫苗奠定基礎.

1材料和方法

1.1材料

E.coliDH5α和BL21菌株由本實驗室保存;pET28a質粒由范雄林博士惠贈;帶HBV截短C基因和preS1基因的質粒pDE22CtpreS1w由本實驗室構建;TaqDNA聚合酶、限制性內切酶(TaKaRa公司);膠回收試劑盒(上海華舜公司);T4DNA連接酶(上海生物工程公司);Ni2+NTA凝膠親和層析柱(Qiagen公司);HRP標記羊人IgG，DNA分子標準和低分子蛋白質標準(華美生物工程公司).

1.2方法

1.2.1PCR引物設計和合成根據GenBank中的HBVC基因和前S1基因序列，利用生物學信息軟件設計其擴增引物,以擴增C基因編碼蛋白N端155個氨基酸的基因片段和前S1全基因.上游引物P1摘要：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,含EcoRⅠ酶切位點；下游引物P2摘要：5′GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′，含HindⅢ酶切位點和終止碼TTA.交上海生物工程公司合成.

1.2.2目的基因的擴增以pDE22CtpreS1w質粒為模板進行PCR擴增，反應體系為摘要：質粒（1∶100稀釋）5μL，10×Buffer5μL，10mmol/LdNTPs4μL，P1（100pmol/L）2μL，P2（100pmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶2μL，用超純水補至終體積50μL.反應條件摘要：預變性94℃5min；94℃1min，56℃50s，72℃1min,共進行30個循環，最后在72℃延伸10min.取5μL反應產物進行瓊脂糖電泳分析.

1.2.3pET28aCtpreS1重組質粒的構建及鑒定連接、轉化、重組質粒鑒定均參照文獻［1］進行，將酶切鑒定正確的重組質粒交由北京三博遠志公司測序.

1.2.4蛋白表達和可溶性分析自DH5α中提取陽性重組質粒，轉化大腸桿菌BL21，挑取單菌落（同時設空載體質粒轉化的大腸桿菌BL21為對照），置5mLLB培養液中（含卡那霉素50g／L），37℃振搖過夜，次日1∶100的稀釋度加入5mLLB培養液中37℃振搖3h后，測定A600nm約0.4～0.6時加入IPTG至終濃度1mmol/L，37℃繼續振搖4～5h，離心收菌.用PBS(pH8.0)懸浮離心收集的細菌，加入溶菌酶至終濃度0.1g/L，4℃放置20min，超聲破碎，4℃下10000g離心10min，收集上清和沉淀.將菌體沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空質粒轉化菌分別加入等體積的2×樣品緩沖液，沸水中加熱5min，12000g離心5min，取上清，每孔15μL進行SDSPAGE電泳，電泳在恒壓下進行（濃縮膠中為100V，分離膠中為120V）.電泳結束后，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍染色液中染色2h，然后用脫色液脫色至背景清楚.薄層掃描分析目的蛋白表達帶占菌體蛋白百分比.

1.2.5親和層析法純化表達蛋白參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱(Ni2+NTA)操作說明進行.首先離心收集1L誘導宿主菌，冰浴15min；按5L/kg濕菌的比例加入含8mol/L尿素的BufferB（pH8.0），室溫下輕輕攪拌使細菌裂解至溶液清亮，4℃下10000g離心收集上清，棄去沉淀；將1mLNi2+NTA樹脂懸浮液和一定量清亮裂解上清于室溫輕柔搖動混勻(100r/min搖動15～60min)后，將其混合液裝柱；依次用BufferC（pH6.3）,BufferD（pH5.9）,BufferE（pH4.5）洗脫，分別收集洗脫液.取各部分樣品進行SDSPAGE分析.

1.2.6WesternBlot檢測表達蛋白將純化蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳，然后將蛋白質進行電轉移至NC膜上（濾膜孔徑0.22μm，轉移條件為恒流100V，1h）.用乙型肝炎陽性患者抗HbcAg，抗preS1陽性血清（來自西京醫院檢驗科）作為一抗，HRP標記羊抗人的IgG作為二抗，DAB（0.6g／L）顯色，至目的條帶染色清楚時終止反應.

2結果

2.1重組表達質粒的鑒定陽性重組質粒酶切產物預期大?。s630bp）處出現條帶（圖1）.序列測定結果和文獻報道一致.

2.2融合蛋白的表達和溶解形式分析經SDSPAGE電泳檢測，在Mr約24000處有一明顯的條帶，和預期的融合蛋白大小一致.該融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，上清液中幾乎無誘導表達的融合蛋白.薄層掃描顯示其占菌體蛋白的40%（圖2）.

2.3融合蛋白的大量表達及純化目的蛋白在BufferD（pH5.9），BufferE（pH4.5）洗脫液中，掃描顯示純度在90%以上（圖3）.

2.4表達蛋白的Westernblot預期大小處可見條帶染色清楚,純化的蛋白很好地保持了和HBV陽性患者血清的結合活性（圖4）.

3討論

疫苗是預防HBV感染的重要手段，但相當數量的接種者對現臨床使用的疫苗無應答或低應答，而為數眾多的感染者需要有效的治療，所以迫切需要新型HBV疫苗.

抗原特異性CTL所介導的細胞毒功能在病毒感染的控制和痊愈過程中起核心功能［2-3］.多個CTL表位的疫苗探究策略是近年各類HBV新型疫苗探究的熱點.HBV核心C基因在不同亞型間最為保守,在它編碼的180多個氨基酸中，CTL表位多位于第150位氨基酸（aminoacid,AA）以前，其中18～27位AA為HLAA0201所限制，第88～96位AA被HLAA11所限制，第141～150位AA為HLAAw68和HLAA31分子所限制，此外第75～81位AA或72～88位AA是很強的構像型B細胞表位，因此核心抗原是比較理想的疫苗探究靶分子［4-5］.在既往HBV疫苗探究中人們大多選用S基因編碼的蛋白，并輔以CpG,IL2等分子佐劑試圖達到免疫目的，但效果并不理想［6-7］.而preS1基因編碼蛋白含有HBV和肝細胞膜結合的位點，并且相當保守,肝細胞、B細胞和T細胞均可表達針對其第21～47位AA的受體，故前S1抗體是除表面抗體外又一重要的中和抗體［8］.因此HBV的C基因和preS1基因已經成為近年來HBV新型疫苗探究的重點［9］.

幾乎所有新型HBV疫苗如亞單位疫苗、DNA疫苗、分枝肽合成疫苗、新載體疫苗或植物轉基因疫苗的前期探究工作中都需要候選分子高效表達,以便在體外評價疫苗候選分子刺激細胞增殖的潛力和CTL殺傷效應,達到全面評價候選分子的目的［10-12］.而HBV各個基因片段原核表達難易程度不同，考慮到C基因原核表達難度低，本探究采用將截短C基因置于preS1基因前面的方式，構建了原核重組表達質粒并獲得了高效表達.目的蛋白純化以后，Westernblot進一步證實該濃縮蛋白可以和抗HBcAg、抗preS1陽性患者血清結合，具有很好的抗原性和特異性，可用于進一步的HBV新型疫苗探究；和Chen等［9］采用經典的preS1基因在前、C基因在后的表達方式所獲取的同類蛋白相比，本探究中蛋白表達量明顯較高.在后續工作中，我們將選用新型的疫苗載體BCG運載候選疫苗分子，進一步探究該蛋白在CTL免疫和體液免疫中的功能.

【參考文獻

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