慢性中性粒細胞白血病分子診斷探討

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慢性中性粒細胞白血病（chronicneutrophilleukemia，CNL）是一種極為少見的BCR－ABL陰性骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferativeneoplasms，MPN），其特征是持續地外周血成熟中性粒細胞明顯增多、骨髓粒系增生和肝脾腫大，無髓系細胞發育異常形態改變和BCR－ABL1、PDGFRA、PDG－FRB、FGFR1重排。以往由于缺乏特定的分子標志，本病的明確診斷很大程度上取決于仔細地鑒別反應性粒細胞增多和表現相近的其他髓系腫瘤，基本屬于排除性診斷。隨著2013年發現大多數患者具有集落刺激因子3受體基因（CSF3R）突變［1］，并經嚴格定義的CNL中驗證，確認其為CNL發病分子基礎，2016年WHO淋巴與造血組織腫瘤分類中納入CSF3R突變作為CNL診斷主要指標［2］，使得CNL不再是排除性的診斷，而成為一種形態學和分子遺傳學定義的髓系腫瘤?，F就CNL分子診斷研究進展介紹如下。

1CSFR

CSF3R基因定位于染色體1p34．3，含有17個外顯子，編碼813個氨基酸的集落刺激因子跨膜受體，為粒細胞提供增殖和生存信號，并有助于其分化和功能。CSF3R是一單鏈細胞表面受體，屬于細胞因子受體Ⅰ型超家族，其胞質部分包括有不同的功能區，即近膜區域有絲分裂信號傳導，行使增殖功能；遠端區域羧基末端與成熟信號傳導有關，行使分化和增殖調節功能［3］。CSF3R與其配體G－CSF結合后，通過經典的下游途徑，包括JAK－STAT，SRC家族激酶（尤其是LYN），非受體酪氨酸激酶SYK、Ras／Raf／MAP激酶和PI3K／Akt通路發揮作用，誘導中性粒細胞分化、增殖、存活，并刺激中性粒細胞功能。研究證明CSF3和CSF3R在粒細胞生成過程起著非常重要作用，小鼠缺乏CSF和CSF3R基因缺陷可表現嚴重的粒細胞缺乏。在嚴重先天性粒細胞缺乏患者，除了明確的遺傳性致病基因（如ELANE或HAX1）突變外，有報道40％可伴有獲得性造血干細胞CSF3R胞質遠端羧基末端過早截斷的基因無義突變，通過與其它癌基因共同作用延長細胞生存，增加克隆優勢，被認為與高急性白血病轉化相關［4－5］。另外，CSF3R基因胚系突變尚可導致顯性遺傳的先天性中性粒細胞增多或家族性慢性中性粒細胞白血病［6－7］，偶爾在急性髓系白血病也報道檢出這種類似突變。

2CSF3R突變與CNL診斷

為了查找潛在的分子發病原因，2013年Max－son等［1］采用原代細胞深度測序結合酪氨酸激酶特異的小干擾RNA或小分子激酶抑制劑作用的方法，對傳統臨床診斷的CNL和不典型慢性髓系白血?。╝CML）進行研究，27例患者中16例（59％）檢出CSF3R突變，其中9例CNL患者中8例（89％）檢出CSF3R突變，均涉及位于外顯子14的胞外近膜結構域點突變，7例（78％）為CSF3RT618I突變，1例為CSF3RT615A突變。這些近膜結構域點突變單獨發生更為多見，少部分與另一類導致CSF3R胞質尾部過早截斷的移碼突變或無義突變共同存在，形成復合突變。胞外近膜結構域點突變和胞質尾部過早截斷突變兩種類型突變分別通過下游JAK－STAT通路和SRC酪氨酸激酶通路介導，均具有體外轉化能力，并相應地對激酶抑制劑蘆可替尼和達沙替尼呈現不同敏感性。以CSF3RT618I表達的造血細胞進行移植，小鼠發生致死性的MPN，表現為突出的成熟粒細胞增多、骨髓明顯活躍和肝脾成熟粒細胞浸潤［8］。Pardanani等［9］在按照嚴格WHO標準診斷的12例CNL患者中更是100％檢出CSF3R基因突變，10例為CSF3RT618I突變；而aCML、漿細胞病相關CNL、原發性骨髓纖維化癥（PMF）和慢性粒－單細胞白血?。–MML）患者無一例檢出該突變。這些均表明CSF3R突變在CNL非常常見，是CNL一致性的生物學特征；CSF3RT618I是CNL敏感而特異的分子標志，應納入CNL診斷標準。2016年修訂的WHOCNL診斷標準將CSF3RT618I和其他激活突變納入診斷［2］，即：①外周血白細胞計數≥25×109／L，分葉核＋帶狀核中性粒細胞≥80％，前體中性粒細胞（早幼、中幼和晚幼粒細胞）＜10％，原粒細胞少見，單核細胞＜1×109／L，無粒系形態發育異常；②骨髓增生活躍，中性粒細胞比例及數量增多，中性粒細胞形態正常，原粒細胞占有核細胞比例＜5％；③不符合WHO定義的BCR－ABL1陽性慢性粒細胞白血?。–ML）、真性紅細胞增多癥（PV）、原發性血小板增多癥（ET），或原發性骨髓纖維化（PMF）；④無PDGFRA、PDGFRB或FGFR1基因重排，無PCM1－JAK2融合基因；⑤CSF3RT618I或其他活化CSF3R基因突變，或持續性（≥3個月）的中性粒細胞增多、脾腫大，且沒有可識別原因的反應性中性粒細胞增多，包括無漿細胞腫瘤，或者如果存在漿細胞病，須有髓系細胞細胞遺傳學或分子學研究證實的克隆性證據。

3繼發性或反應性粒細胞增多的排除更為方便

臨床上中性粒細胞增多可見于多種良惡性疾病，精確診斷CNL需要仔細與這些具有類似表現的疾病進行鑒別。CML、aCML、CMML以及MPN／MDS等各自均具有特征性分子和細胞形態學特征，診斷也在2016年WHO髓系腫瘤分類中明確界定，與CNL鑒別并不困難。類白血病反應與CNL均可表現有外周血白細胞增多、骨髓增生明顯活躍、BCR／ABL融合基因陰性和正常染色體核型，二者的鑒別極具挑戰性。盡管仔細地病史詢問、臨床檢查和外周血分析大多可以提供相應診斷線索，但若能證明存在克隆性造血，包括識別出CSF3R突變或其它分子或細胞遺傳學異常，則更加支持CNL的診斷。而缺乏CSF3R基因突變雖并不能完全排除CNL診斷的可能性，但此時要診斷CNL更需格外謹慎。CNL經常同時伴發漿細胞病，以多發性骨髓瘤最為常見，意義未定單克隆γ球蛋白血癥次之，文獻報道可高達32％［10］。鑒于腫瘤性漿細胞可合成G－CSF，CNL能自發緩解，基礎漿細胞病治療中性粒細胞計數改善，患者預期壽命更長，尤其均不能檢出特征性的CSF3R基因突變，表明伴發漿細胞病的“CNL”與單純CNL是兩種病因和機制不同的病理異常，支持前者實為漿細胞病繼發的中性粒細胞增多［11－12］。另外，某些實體瘤也可易位生成G－CSF，導致副瘤性白細胞增多［13－14］，表現與CNL相似，需注意鑒別。

4CSF3R突變類型與CNL臨床表現及預后

CNL有兩種不同的CSF3R突變類型，一是常見的近膜端突變，主要包括T618I和T615A點突變。膜近端突變阻止CSF3R的O－糖基化，導致活性二聚體構型增加，配體非依賴的受體激活，以及經由JAK2的構成性下游信號傳導［15］。已經證明最常見的CSF3RT618I突變經由JAK－STAT途徑發揮作用，對JAK抑制劑蘆可替尼治療敏感。另一種是移碼突變或無義突變，導致CSF3R的胞質尾端過早截斷（D771fs、S783fs、Y752X和W791Z）［1，5］。受體的截斷致使負調控基序喪失，包括與受體內化有關的雙亮氨酸分選基序，以及靶向并進而降解受體的細胞因子信號傳導3（SOCS3）的抑制劑結合位點［16－17］，破壞受體轉運，延遲受體內化和（或）降解，導致細胞表面CSF3R表達增加，STAT5持續活化，細胞增殖加強［18］。單獨的CSF3R的胞質尾端截斷突變可能不足以驅動白血病發生，在CNL也極為罕見，對SRC激酶抑制劑達沙替尼治療敏感［19］。絕大多數CNL呈CSF3R基因近膜端突變，最高約30％的患者同時表達近膜端突變和胞質尾端截斷突變的復合突變。CSF3R基因復合突變可誘導小鼠發生侵襲性致死性白血病，并在體外顯示對JAK和SRC抑制劑均耐藥，而對MAPK信號傳導途徑抑制劑trametinib更為敏感［20］。最近，Szuber等［21］將19例CSF3R基因突變CNL患者按照突變類型分組為14例T618I突變和5例其它CSF3R基因突變（包括M696T突變2例，T640N突變，c．2215C＞T截斷突變和I598ISYN突變各1例），比較2組患者的臨床特征。結果顯示，CSF3RT618I突變患者具有更多的不良臨床和實驗室特征，傾向于診斷時年齡更大，白細胞計數更高、血紅蛋白和血小板計數值更低，以及異常核型發生率更高。這些不良特征最終轉化為較其它CSF3R突變類型患者顯著降低的整體生存（OS）。

5CNL其它突變基因

除了CSF3R基因突變外，在CNL患者中尚可檢測到不同發生頻率的其它基因突變，包括ASXL1（47％～77％），SETBP1（0～75％），SRSF2（44％），TET2（20．5％～50％），CALR（5％～12．5％），以及JAK2（8％）等［22－26］。另外，10％左右的CNL患者缺乏CSF3RT618I及其它近膜端基因突變，提示應該尚有另外的基因異常參與其白血病發生。與潛能未定的克隆性造血（CHIP）一致的多種基因突變的檢出，促使考慮在CHIP背景下晚發CSF3R突變并最終導致CNL表型的可能性。而Zhang等［27］二代基因測序研究結果顯示，超過半數的CNL、aCML、CMML、MPN－U或MDS／MPN－U患者表現出3種不同的途徑共同發生突變，涉及染色質修飾、表觀遺傳調節、剪切復合物和信號傳導基因。CNL這種多通路基因突變共同發生的模式與aCML、MDS／MPN－U和CMML非常相似，作者提出該病歸類為MDS／MPN較MPN更為合適。CNL是一少見的MPN，臨床表現異質性非常高，在缺乏疾病特異性標志時代其精確診斷具有極大挑戰性。2013年CSF3R突變與CNL發病因果關系的闡明導致CSF3R突變納入修訂的WHOCNL診斷標準，并隨之發現其它相關基因。這些CNL致病基因突變的識別不僅豐富了分子診斷方法，也為基于此的靶向藥物研發奠定了基礎。

作者：張鳳奎 宋琳