重癥急性胰腺炎研討論文

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【摘要】目的通過觀察重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）及胰腺NF-κB的表達，探討重癥急性胰腺炎的發生發展機制。方法將40只大鼠隨機分為正常對照組（假手術組）、模型組（重癥急性胰腺炎組），每組20只，造模后24h測定血淀粉酶、IL-8及IL-10，切取相同部位的胰腺組織觀察組織病理學改變，進行NF-κB的免疫組織化學染色。結果模型組大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的濃度均顯著高于對照組，模型組NF-κB免疫組化染色較對照組顯著增強。結論IL-8、IL-10及NF-κB在重癥急性胰腺炎的發生發展中起重要作用，重癥急性胰腺炎的早期即有胰腺組織NF-κB的活化。

【關鍵詞】重癥急性胰腺炎白介素-8白介素-10核因子-κB

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofnuclearfactor-kappaB(NF-кB),seruminterleukin-8(IL-8)andinterleukin-10(IL-10)insevereacutepancreatitis(SAP)inrats.Andtoinvestigatetherolesofactivatednuclearfactor-kappaB(NF-κB)andserumIL-8andIL-10inSAP.Methods40Wistarratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup(Shamoperationgroup)andmodelgroup(SAPgroup).Therewere20ratsineachgroup.Levelsofserumamylase,IL-8,IL-10andactivatedNF-κBinthepancreatictissueweredetected24hoursafteroperations.ResultsThelevelsofIL-8andIL-10inserumSAPweresignificantlyhigherthanthoseinnormalcontrolgroup.ActivatedNF-κBwasenhancedinSAPgroupcomparedwithShamoperationgroup.ConclusionsIL-8,IL-10andNF-κBplayanimportantroleinsevereacutepancreatitis.TherewasactivatedNF-κBattheearlystageofsevereacutepancreatitis.

【KeyWords】SevereacutepancreatitisInterleukin-8Interleukin-10Nuclearfactor-kappaB

重癥急性胰腺炎（severeacutepancreatitis,SAP）是由多因素誘發、多個臟器受累、病情兇險、發展迅速、病死率高的內科急重癥，而多器官功能障礙綜合征（multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS）或者多器官功能衰竭（multipleorganfailure,MOF）是SAP的主要死亡原因。損傷因子（如異常激活的胰酶）導致各種炎癥細胞的過度激活，形成亢進的免疫反應，并釋放多種炎性介質，啟動全身炎癥反應綜合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS），在機體受到促炎細胞因子損傷引起SIRS的同時，機體的防御系統也隨之發生反應,合成并釋放抗炎細胞因子，引起代償性抗炎反應綜合征(compensatoryanti-inflammatoryresponsesyndrome,CARS)［1］。無論失控的SIRS，還是過度的CARS，均表現為機體致炎-抗炎因素的失衡，機體穩態破壞，均可導致炎癥損害加重。在SAP時，大量細胞因子產生，促炎因子和抗炎因子共存，其中包括促炎細胞因子IL-8和抗炎細胞因子IL-10［2］。核因子-κB（nuclearfactorkappaB,NF-κB）活化是眾多炎癥介質作用機制的共同通道，諸多炎癥因子在基因水平上都受到NF-κB的調控。作者自2006年8月至2007年3月通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察血清中IL-8、IL-10的變化以及胰腺NF-κB的表達，探討重癥急性胰腺炎的形成機制。

1材料和方法

1.1動物及分組

40只Wistar大鼠（購自浙江省醫學科學院），體重250～300g，隨機分為正常對照組（假手術組）、重癥急性胰腺炎組（模型組），每組20只。各組于術后24h全部處死，留取標本。動物飼養：所有大鼠均給予普通飼料喂養，自由飲水，飼養環境為每籠4只，人工光循環12h/12h，溫度為(21±2.0)℃，濕度為(55±2)%。

1.2化學試劑

兔抗鼠的NF-κB單克隆抗體購自北京中山生物技術有限公司,大鼠血清IL-8和IL-10的ELISA試劑盒購自R&Dsystems。

1.3重癥急性胰腺炎模型的制備

大鼠術前禁食、不禁水12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）。無菌條件下取上腹正中切口入腹，尋找膽胰管十二指腸乳頭開口，使用一次性靜脈留置套管針于對系膜緣腸壁穿刺，進入腸腔后即將針芯退出，將套管經乳頭部逆行插入膽胰管約1cm，以無損傷小動脈夾于肝門部阻斷膽管后，套管末端接微量泵，以0.1ml/min的速度勻速注入5%?；悄懰徕c（1ml/kg體重），注畢后拔管，胰腺組織可在短時間內出現充血、水腫，可見包膜下胰腺組織點狀或小片狀出血，5min后去除小動脈夾，以無損傷縫線縫合腸壁穿刺孔處，關腹。對照組大鼠開腹后僅翻動胰腺數次后關腹。

1.4取材方法

大鼠造模后24h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，經心臟取血，測定血淀粉酶、IL-8及IL-10；切取相同部位的胰腺組織。

1.5分光光度法檢測血清淀粉酶

1.6血清IL-8及IL-10測定（ELISA法）

洗滌液用重蒸水1:20稀釋。底物工作液配制：使用前將OPD片放入底物稀釋中溶解，每片加液5ml。標準品液配制：使用前每管中加入蒸餾水200μl溶解。試劑盒設標準孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100μl，第1孔加標準品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl，移至第2孔，如此反復作對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100μl棄去，使之體積均為100μl，第8孔為空白對照，建立標準曲線。待測品孔各加入待測樣品100ml。將反應板充分混勻后置37℃120min。用洗滌液將反應板充分洗滌5次，向濾紙上印干。每孔加第一抗體工作液1滴，將反應板置37℃60min。同前洗板。每孔加酶標抗體工作液2滴，將反應板置37℃60min。同前洗板。每孔加入底物工作液2滴，置37℃暗處反應10min。每孔加入1滴終止液混勻。在492nm處測吸光值。以標準品1000、500、250、125、62、31、16、0pg/ml之OD值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線。根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應IL-8及IL-10含量。

1.7病理學檢查、NF-κB測定

每個標本切片行HE染色，采用盲法由?？漆t師在光鏡下閱片，每張切片隨機選擇5個高倍視野，觀察胰腺組織病理變化。NF-κB免疫組織化學染色，胰腺腺泡細胞及胰島細胞染色為棕黃色的是NF-κB陽性細胞，以積分法半定量描述所取標本的染色情況，每張切片隨機觀察10個高倍視野，按染色強度分為4級：0=陰性染色；1=弱陽性染色；2=中度陽性染色；3=強陽性染色；按陽性細胞數占總細胞數的比例分為5級：0=陰性；1=陽性細胞1%～25%；2=陽性細胞26%～50%；3=陽性細胞51%～75%；4=陽性細胞76%～100%；每張切片的染色積分以這二者乘積之和表示。

1.8統計學處理

實驗結果以(x±s)表示，用SPSS12.0統計軟件進行分析，首先進行方差齊性檢驗，然后進行單因素方差分析。

2結果

2.1血清淀粉酶，IL-8及IL-10的變化

模型組大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的濃度均顯著高于對照組，差異有統計學意義。見表1。表1各組大鼠血清淀粉酶、IL-8、IL-10及NF-κB水平（略）

2.2各組大鼠胰腺的組織病理學變化

胰腺組織學改變：對照組胰腺組織光鏡下各時段無明顯改變，胰腺腺泡細胞排列緊密，可見胰島，無中性粒細胞浸潤；模型組則見間質水腫，大片腺泡細胞變性壞死，伴有大量粒細胞浸潤。對照組大鼠胰腺組織NF-κB免疫組織化學染色，腺泡細胞未見陽性細胞，胰島細胞的胞漿呈淡黃色；模型組可見多數胰腺腺泡細胞胞漿呈棕黃色，胰島細胞胞漿呈棕黃色，部分胰島細胞的胞核亦呈棕黃色，染色范圍較對照組明顯增大，染色強度較對照組明顯增強，結果有統計學意義（見表1、圖1～4）。

3討論

急性胰腺炎是常見急腹癥，約10%～15%發展為重癥急性SAP。其最直接的原因是病程早期出現嚴重的SIRS及其它系統并發癥，如急性呼吸窘迫綜合征和MODS。諸多研究己證實炎癥細胞過度激活及炎性細胞因子的過度表達導致細胞因子網絡失衡在SAP中起著關鍵性作用，并同上述并發癥密切相關。NF-κB活化是眾多炎癥介質作用機制的共同通道，諸多炎癥因子在基因水平上都受到NF-κB的調控。NF-κB是一種具有多向轉錄調節作用的蛋白，p50/p65異源二聚體是NF-κB活化的最常見形式。生理情況下NF-κB同其抑制因子（inhibitorofNF-κB,IκB）結合以無活性狀態存在于細胞漿內；疾病過程中，多種因素如病毒、內毒素、氧自由基、TNF-a、IL-6、IL-8等均可使其激活，NF-κB由胞漿進入核內，與其靶基因上的啟動子或增強子結合，進而調控多種細胞因子和免疫介質的表達，進一步放大炎癥反應，促炎因子和抗炎因子共存,其中包括促炎細胞因子IL-8和抗炎細胞因子IL-10［2］。

1997年Dunn等［3］首先發現NF-κB的活化是AP發生中的重要早期事件，隨后Altavilla等［4］發現雨蛙素誘導的大鼠水腫性AP胰腺組織中NF-κB的活性在疾病的早期有明顯的升高。Osman等［5］把IL-10類似劑應用于實驗性AP動物模型后，發現血清TNF-a和IL-8水平下降，腹水量減少，中性粒細胞浸潤和趨化以及肺組織CD11B/CD18陽性細胞功能明顯受到抑制，生存率明顯改善。在體外試驗中，Olivier［6］發現IL-10可以通過抑制IκB激酶復合體來抑制NF-κB的活性，從而減少支氣管上皮細胞中IL-8的表達。

本研究表明在重癥急性胰腺炎的早期胰腺組織即有NF-κB的活化，IL-8，IL-10及NF-κB在重癥急性胰腺炎的發生發展中起重要作用，重癥急性胰腺炎時機體致炎-抗炎因素失衡，IL-10可能有助于促進致炎-抗炎因素的平衡，減輕重癥急性胰腺炎時的炎癥反應。

【參考文獻】

1BoneRC.SirIsaacNewton,sepsisSIRSandCARS.CritCareMed,1996,24:1125～1128.

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3DunnJA,LiC,HaT,etal.TherapeuticmodificationofnuclearfactorkappaBbindingactivityandtumornecrosisfactor-alphageneexpressionduringacutebiliarypancreatitis.AmSurg,1997,63(12):1036～1043.

4AltavillaD,FamulariC,PassanitiM,etal.LipidperoxidationinhibitionreducesNF-kappaBactivationandattenuatescerulein-inducedpancreatitis.FreeRadicRes，2003，37(4):425～435.

5OsmanMO,JacobsenNO,KristensenJU,etal.IT9302,asyntheticinterleukin-10agonist,diminishesacutelunginjuryinrabbitswithacutenecrotizingpancreatitis.Surgery,1998,124(3):584～592.

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